Bewertung der Wirksamkeit der H. pylori Protein HP-NAP als therapeutisches Werkzeug zur Behandlung von Blasenkrebs in einem orthotopen Mausmodell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen Tumor in der Blasenhöhle weiblicher Mäuse zu etablieren und anschließend Therapeutika zu verabreichen. Dies wird erreicht, indem zunächst Tumorzellen aus einer Kultur entnommen und in PBS suspendiert werden. Als nächstes werden Mäuse katheterisiert und Tumorzellen in die Blasenhöhle injiziert.

Drei Tage nach dem Tumorimplantat werden den Mäusen Therapeutika injiziert und die Injektionen werden alle drei Tage für insgesamt 13 Tage wiederholt. Schließlich wird die Blase herausgeschnitten und eine histologische Analyse durchgeführt. Letztendlich werden histologische Analysen und immunhistochemische Analysen verwendet, um die Wirksamkeit der injizierten Therapeutika zu überprüfen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem intraperitonealen oder subkutanen Tumormodell besteht darin, dass das orthotope Modell die natürlich vorkommende Umgebung des Tumors nachahmt. Nach der Aufzucht von C 57 BL sechs J, weiblichen Mäusen bis zu einem Alter von acht Wochen, wachsen gemäß dem Textprotokoll MB 49 Zellen in RPMI 1640, Medium ergänzt mit FBS und Gentamycin auf 80% Konfluenz. In T 75 versucht man die Zellen und resuspendiert sie dann bei 0,5 mal 10 bis zum fünften bis 0,5 mal 10 zu den sechs Zellen pro 150 Mikroliter PBS nach der Anästhesie einer Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Zola, te und Xor.

Legen Sie das Tier in Rückenlage auf ein Polster und befestigen Sie die Hinterbeine mit Klebeband am Polster, wobei Sie darauf achten, dass die Pfoten ausreichend getrennt sind, um den Katheter mit einer kleinen Zange einzuführen, eine Kante des äußeren Teils der Harnröhre und vorsichtig zum Kopfende der Maus hin gedreht. Dadurch wird die Harnröhren-Atu freigelegt. Entfernen Sie die innere Nadel des Katheters und führen Sie die Leiter vorsichtig in einem 45-Grad-Winkel in die Harnröhre ein, leicht ausgerichtet zum hinteren Ende der Maus.

Den Katheter nicht mit Gewalt erzwingen, sondern vorsichtig drehen, verdrehen, wenn ein Widerstand zu spüren ist. Wenn sich etwa 0,5 bis 0,8 Zentimeter des Katheters in der Harnröhre befinden, positionieren Sie den Katheter vorsichtig parallel zum Schwanz der Maus und führen Sie ihn vollständig ein. Führen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit 200 bis 300 Mikrolitern sterilem PBS in den Katheter ein und waschen Sie den Restharn aus der Blase, bevor Sie die gesamte Flüssigkeit aus der Blase absaugen.

Injizieren Sie anschließend mit einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze 200 Mikroliter 0,1 NHCL. Füllen Sie die Blase, um die gesamte Wand zu verbrennen. Entfernen Sie nach 10 Sekunden die gesamte Säure und neutralisieren Sie sie sofort, indem Sie 200 Mikroliter 0,1 NNAH injizieren.

Saugen Sie dann die gesamte Restflüssigkeit ab und verwenden Sie sofort 300 Mikroliter steriles PBS, um den Hohlraum zu spülen. Nach der Entleerung der Blase durch Aspiration werden 150 Mikroliter M 49 cell suspension injiziert. Lassen Sie die Spritze am Katheter befestigt, um ein Auslaufen von Zellen zu verhindern, und befestigen Sie sie mit Klebeband.

Eine Stunde später ziehen Sie den Katheter vorsichtig aus der Harnröhre und legen Sie die Maus in einen Käfig unter einer Heizlampe, damit sie sich mindestens drei Tage lang erholen kann. Nach der Injektion der MB 49-Zellen nach der Anästhetisierung des Tieres, das wie gerade demonstriert katheterisiert wurde, und unter Verwendung einer Ein-Milliliter-Spritze mit 200 bis 300 Mikrolitern sterilem PBS den Restharn aus der Blase gewaschen, die gesamte Flüssigkeit aspiriert, injiziert 50 Mikrogramm Helicobacter pylori, neutrophiles aktivierendes Protein oder H-P-N-A-P pro 150 Mikroliter PBS in die Blase, Lassen Sie die Spritze am Katheter befestigt, um ein Auslaufen zu vermeiden. Entfernen Sie nach einer Stunde vorsichtig den Katheter aus der Harnröhre und legen Sie die Maus in einen Käfig unter einer Heizlampe, bis sie erwacht.

Mäuse, die am Tag Null implantiert werden. Mit MB 49 wurden die Zellen an den Tagen 3, 6, 9 und 12 mit 50 Mikrogramm H-P-N-A-P oder PBS behandelt. Am 13. Tag wurden die Tiere getötet und die Blasen für die histologische und immunhistochemische Analyse entnommen.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, waren die Tumoren aus der Blase von H-P-N-A-P-behandelten Mäusen signifikant kleiner als die von Vehikel-behandelten Mäusen. Interessanterweise dringen die Tumore bei vehikelbehandelten Tieren in das darunter liegende Fettgewebe ein. Bei sieben der acht mit HP NAP behandelten Tiere sind die Tumore auf die Blasenwand beschränkt.

Schließlich ist die Vaskularität, wie hier gezeigt, bei mit HP NAP behandelten Mäusen im Vergleich zu Kontrolltieren reduziert und das Ausmaß der Nekrose erhöht, was darauf hindeutet, dass HP NAP ein starkes Anti-Tumor-Potenzial gegen Blasenkrebs bietet. Von Therapeutika erbeten.