Name: Mess Oxidativer Stress Widerstandsrat Caenorhabditis elegans In 96-Well-Mikrotiterplatten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie oxidativen Stresswiderstand bei Caenorhabditis elegans in 96-Well-Platten messen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Überlebensraten unter oxidativen Stressbedingungen.

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Wir erkennen die Caenorhabditis Genetics Center for C. elegans-Stämme. Finanzielle Unterstützung durch die Terry Fox Research Institute bereitgestellt. Wir unterstützen EP aus der Rolande und Marcel Gosselin Graduiertenstipendium und der CIHR / FRSQ Ausbildungsförderung in der Krebsforschung FRN53888 der McGill Integrated Cancer Research Training Program gewährt erkennen auch.

1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Herstellung von Medien für C. elegans Wachstum (in diesem Fall, Tiere Wildtyp und FLCN-1 (ok975) mutierten Tiere). <ol><li> Bereiten Geändert Youngren nur Bactopepton (MYOB) Trockenmischung, die 5,5 g Tris HCl, 2,4 g Tris-Base, 31 g Bactopetone, 20 g NaCl und 0,08 g Cholesterin. Gut mischen mit Schütteln. Anmerkung: Diese Mischung ist ausreichend, um 10 l MYOB Medium herzustellen. HINWEIS: normalem Wachstumsmedium (NGM) Platten könnte statt MYOB Platten 27 verwendet werden. Jedoch sollte die gleiche Art von Platten für gültige Vergleiche zwischen Stämmen und zwischen unabhängigen wiederholt verwendet werden. In diesem Protokoll haben wir nur MYOB Platten. </li><li> Bereiten Sie 1 l MYOB Medium durch Zugabe von 6 g MYOB Trockenmischung, 17 g Agar und auf 1 L mit H 2 O und Autoklav für 45 Minuten bei 122 ° C. Platten gießen und lassen bei Raumtemperatur trocken für 2 Tage. </li><li> Unter Einhaltung steriler Techniken impfen 100 ml cultuWieder LB-Brühe-Medium mit E. coli OP50 Bakterien und wachsen O / N bei 37 ° C. </li><li> Seed MYOB Platten mit E. coli OP50 Bakterien. Lassen Sie es bei Raumtemperatur für 48 Stunden wachsen. </li></ol></li><li> Vorbereitung für die Gen-Downregulation mit RNAi <ol><li> Bereiten MYOB RNAi-Zuführung Platten. Gehen Sie wie in den Schritten 1.1.1 und 1.1.2. Nach dem Autoklavieren Das Medium auf etwa 55 ° C abkühlen gelassen und mit 1 ml 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) und 1 ml 100 mM Ampicillin. </li><li> Streak E. HT115 coli Bakterien, die mit einem Plasmid, das entweder Steuerung EV oder FLCN-1 spezifische RNAi auf Ampicillin (50 ug / ml) / Tetracyclin (15 ug / ml) Agarplatten drückt umgewandelt. Kultur wachsen O / N bei 37 ° C. </li><li> Wählen Kolonien und impfen E. coli HT115 Bakterien mit einem Plasmid, das entweder Steuer EV oder FLCN-1 spezifische RNAi und wachsen Kultur in LB / Ampicillin (50 ug / ml) mittel- und O / N bei 37 &amp; # drückt transformiert176; C. </li><li> Samen Platten mit E. coli HT115 EV Bakterien oder HT115 FLCN-1 RNAi Bakterien. Hinweis: Bewahren Sie Platten 48 Stunden bei Raumtemperatur vor der Verwendung. Wenn RNAi durch Einspeisen in Wirk, andere Verfahren der Abgabe der ds-RNA 28. </li></ol></li><li> Induziert oxidativen Stress mit Paraquat (PQ): <ol><li> Vorbereitung M9 Puffer durch Mischen von 3 g KH 2 PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl und 0,25 g MgSO 4 · 7 H 2 O. Bringen Sie bis zu 1 L mit destilliertem Wasser. Autoklaven-Lösung für 45 min bei 122 ° C und zu speichern Flaschen bei RT. </li><li> Am Tag des Assays, bereiten Sie die M9 / PQ-haltigen Lösung. Für dieses Protokoll verwenden 100 mM PQ (0,1028 g PQ in 4 ml M9-Puffer füllt ein ganzes 96-Well-Platten mit 40 ul M9 / PQ pro Vertiefung). ACHTUNG: PQ ist eine gefährliche und hochgiftige Verbindung. Griff nach entsprechenden Richtlinien. HINWEIS: Beim ersten Ausführen eine neue sZug oder ein neuer Zustand, ist es empfehlenswert, um das Überleben in steigenden Konzentrationen von PQ um das beste Konzentration, um die Tiere in 7-10 h zu töten verwenden bestimmen, zu untersuchen. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Age-synchronisiert L4 Bevölkerung <ol><li> Transfer 20 gravid Erwachsenen Hermaphroditen auf eine frische Platte mit MYOB E. ausgesät coli OP50 Bakterien. Vorbereitung mehrere Platten auf der Basis der Anzahl der Würmer bei den Assay benötigt. </li><li> Lassen Sie sie Eier für 6 Stunden und dann mit einem Platindraht Wurm Pick entfernen Sie die Mütter legen. Überprüfen Sie die Platten unter dem Mikroskop, um die Anzahl der gelegten Eier zu bewerten. </li><li> Lassen Sie die Eier schlüpfen und wachsen bei 20 ° C für 48 Stunden. Zu dieser Zeit sind die Tiere in einem späten L4 / junger Erwachsener Bühne. Wählen gleichen Stufe Tiere und Transfer zum PQ Lösung haltigen Brunnen. Hinweis: Da 48-stündiger Inkubation nur auf Mutanten, die ähnlich zu den Wildtyp-Tieren wachsen, ist es wichtig, zu überwachen EntwicklungsRate der neu getesteten Mutanten, um sicherzustellen, es erfüllt die Entwicklungsrate Wildtyp, sonst sollten andere Zeitleisten verwendet werden. </li><li> Alternativ können Sie Synchronisationstechniken. Generieren synchronisiert Bevölkerung von L1-Larven Würmer mit Hypochlorit-Lösung (25 ml Wasser, 125 ml von 5,25% Natriumhypochlorid, 50 ml von 4 M NaOH; wickeln Flasche mit Aluminiumfolie vor Licht zu isolieren). Für diesen Test ist es nicht empfehlenswert, da intensive Bleich könnte das Verhalten der Tiere während des Assays beeinflussen. VORSICHT: Gehen Sie Hypochlorit-Lösung nach den Richtlinien. HINWEIS: Bei der Verwendung von RNAi, um nach unten zu regulieren das Gen von Interesse, die Hermaphroditen zu synchronisieren, wie in Kapitel 2 beschrieben, mit der Ausnahme von der Übertragung von Müttern auf RNAi-Platten mit den spezifischen RNAi Bakterien geimpft. Wenn der Zuschlags mit der RNAi schwach ist, wird Fütterung für mehrere Generationen empfohlen. </li></ol> 3. Durchführung der oxidativen Stressresistenz Assay &lt;/ P&gt; <ol><li> Pipette 40 ul der 100 mM PQ-Lösung (frisch zubereitet) auf jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Verwenden Sie mindestens 12 Wells als repliziert jeder Bedingung (Behandlung, mutant, etc.). Unter Verwendung einer Platindraht-Wurm Pick, übertragen 5-8 L4-Larven Tiere jeden gut, die die Startzeit und die Endzeit. </li><li> Beim Start eine weitere Bedingung, beachten Sie die Startzeit und die Endzeit. Legen Sie die Platte bei 20 ° C in der Inkubationszeit zwischen toten Tieren eine Stunde später die Übertragung der Würmer und Scoring von der Startzeit. </li><li> Verwenden des Binokular, zählen Überlebens jeden hr. Die Platte Schütteln Sie vor dem Start zu zählen. Geben Sie Würmer, die sich nicht bewegen, auch nach dem Absetzen einer Licht von hoher Intensität, wie tote Tiere. Auch die Anzahl der Tiere am Leben. HINWEIS: Mit Blick auf Schneckenform, Schwänze und Kopfbewegung bei hoher Vergrößerung, um festzustellen, tote Würmer lebendig. </li><li> Wiederholen Sie diesen Schritt jede Stunde, bis die meisten Würmer sind tot. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Bestimmung der Überlebensprozent zu jedem Zeitpunkt <ol><li> Berechnen Sie die Gesamtzahl der Tiere pro Bedingung, indem Sie die Gesamtzahl der Tiere, um jedes über gut. Ignorieren Sie die Tiere, die beschädigt sind oder bei der Übertragung getötet. </li><li> Für jeden Zeitpunkt berechnen die Gesamtzahl der toten Tieren pro Bedingung (Summe der toten Tiere in den 12 Vertiefungen). Für jeden Zeitpunkt berechnen Prozentsatz des Todes (Anzahl der toten Tiere dividiert durch die Gesamtzahl der Tiere und multipliziert mit 100) und den Prozentsatz des Überlebens (100 minus Prozent Tod). </li><li> Wiederholen Sie diesen Test mindestens 3 unabhängigen Zeiten. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

C. elegans ist ein attraktives Modellorganismus genetisch oxidative Stressresistenz in vivo zu untersuchen, da es leicht gezüchtet werden können, und führt zu einer Vielzahl genetisch identischer Nachkommenschaft schnell. Mehrere Methoden zur oxidativen Stress Widerstand zu messen, wurden zuvor beschrieben und sie sind auf die Ergänzung von Kulturplatten mit verschiedenen ROS Quellen wie PQ, Rotenon, H 2 O 2 und Juglon 25,26,29-32 basiert. Hier beschreiben wir ein Proto...

A reference was corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/52746">Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates</a>. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:
Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).
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Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., &#38; Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).

Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

In Eukaryoten ist die oxidative Phosphorylierung, die sich in der Elektronentransportkette der Mitochondrien der Haupttreiber der Energieproduktion in Form von ATP. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind ein natürliches Nebenprodukt des Prozesses. Trotz ihrer wichtigen Rolle als Signalmoleküle, können übermäßige ROS auf DNA-Schäden, Protein-Carbonylierung und Lipidoxidation führen. Ein Ungleichgewicht zwischen ROS-Produktion und Entgiftung verursacht oxidativen Stress, was zu Energiemangel, Zellschäden führt, und löst den Zelltod 1,2. Oxidativer Stress trägt zur Alterung und auf die Entwicklung von vielen lebensbedrohlichen Krankheiten wie Krebs, Diabetes, Herz-Kreislauf- und neurodegenerative Erkrankungen 3-9. Zellen enzymatischen und nicht-enzymatischen Abwehrstrategien entwickelt, um die ordnungsgemäße ROS Niveau zu halten und ihre Bestandteile vor oxidativen Schäden schützen 1,2. Superoxid-Dismutase (SOD) Enzyme wirken Erste convert Superoxid zu H 2 O 2, die später in Wasser umgewandelt wird von Katalase oder Peroxidase-Enzyme. Nicht enzymatischen Abwehrstrategien beinhalten meist Moleküle, die schneller mit ROS im Vergleich zu zellulären Makromolekülen, zum Schutz wesentlicher Zellkomponenten reagieren. Trotz der schützende Rolle von ROS Entgiftungsenzyme, einige ROS-Moleküle entweichen die antioxidativen Abwehrmechanismen und führen zu oxidativen Schäden. Erkennung, Reparatur und Abbau der beschädigten zellulären Komponenten sind wesentliche Verteidigungsstrategien während oxidativem Stress 1,2. Signalwege in Stressresistenz und speziell oxidativem Stress beteiligt sind hoch evolutionär konservierte 10,11. Im Gegensatz zu Zellkulturexperimenten, wo organismal Bedingungen nur teilweise wiedergegeben werden, die Untersuchung von oxidativem Stress in Modellorganismen 12,13 hat eine große Bedeutung. C. elegans ist ein freilebenden Nematoden, die einfach und kostengünstig sein kann culnissen auf einem Bakterienrasen auf Agar-Medien. Es ist klein (ca. 1 mm in der Länge) und in der Regel wächst als selbstDünge Zwitter, die genetische Manipulationen erleichtert. Es hat eine schnelle Lebenszyklus und eine hohe Fortpflanzungsfähigkeit, die rund 300 Nachkommen pro Generation, so dass es ein leistungsfähiges Werkzeug, um groß angelegte genetische Screens 14 durchzuführen. C. elegans Genom vollständig sequenziert und 40-50% der Gene vorhergesagt werden, um Homologe des humanen krankheitsassoziierten Genen 15-18 sein. Der Knockdown von Genen von Interesse unter Verwendung von RNAi ist eine schnelle und einfache in C. elegans. Gene Herunterregulierung könnte durch Füttern von Tieren der E. erreicht werden coli-Bakterien, die ein Plasmid, das das doppelsträngige RNA, die die mRNA von Interesse 19 zielt exprimieren beherbergen. Daher hat die Bestimmung der Genfunktion mit Groß RNAi-Screens großen Einfluss auf das Verständnis der menschlichen Krankheiten, darunter Krebs 20,21. Studium der oxidative Stressresistenz in C. elegans haben zur Identifizierung von konservierten Mechanismen der Resistenz gegen oxidative Belastung 13,22 geführt. Einige Wege identifiziert normale Wege, die Langlebigkeit und Beständigkeit zu modulieren anderen Belastungen als auch, wie Hypoxie, Wärme und osmotischen Stress. Diese Wege sind die Insulin-Signal, TOR-Signalisierung und Autophagie. Weitere wichtige Signalwege beinhalten Entgiftung von ROS wie Superoxid-Dismutase Enzyme und Enzyme Katalase, oder in Schaden zu reparieren, wie Hitzeschock und Chaperon-Proteine ​​11,13,22. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Widerstandsfähigkeit gegenüber oxidativem Stress von C. bestimmen elegans in Flüssigkeit. Wir verwendeten FLCN-1 (ok975) und Wildtyp-Tieren, das Protokoll zu zeigen, da wir zuvor in C gezeigt, eine erhöhte Resistenz gegenüber oxidativem Stress bei Verlust der FLCN-1 (ok975) elegans 23. Wir haben auch gezeigt, dass dieser Widerstand hängtauf AMPK und Autophagie, einen Signalisierungs Achse, die zelluläre Bioenergetik verbessert und fördert die Stressresistenz 23. PQ ist eine oxidative Stressfaktor, der mit der Elektronentransportkette an reaktiven Sauerstoffspezies produzieren 24 stört. Das gleiche Assay könnte angepasst werden und andere ROS Quellen oder ROS erzeugende Verbindungen könnten als H 2 O 2 und Rotenon verwendet werden, so. Ähnliche Tests wurden auf Platten, wo niedrige Konzentrationen von PQ verwendet 25,26 entwickelt. Der Vorteil dieses Tests ist, dass es sehr schnell ist, und die Ergebnisse können in einem Tag erreicht werden. Zusätzlich ist das Gesamtvolumen der Flüssigkeit verwendet, um den oxidativen Stress Resistenzassay in Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt gering, verglichen mit der zur Bestimmung PQ-enthaltenden Platten herzustellen Volumens. Daher ist die Menge des verwendeten PQ im flüssigen Assay gering ist, was den Assay macht preiswerte und begrenzt die Erzeugung von Giftmüll. , Grenzen dieses Tests im Vergleich zu Plattentests sind jedoch die lack von Nahrungsmitteln im flüssigen Assay und der geringeren Konzentration an Sauerstoff in flüssiger, im Vergleich zu Luft. Dies sind wichtige Faktoren, die in einigen Fällen die Ergebnisse beeinflussen. Daher bestätigt die Reproduzierbarkeit mit anderen Methoden von oxidativem Stress Widerstand wird empfohlen, die Ergebnisse in diesem Test erhalten unterstützen.

<table><tbody><tr><td>Agar bakteriologische Qualität</td><td>Multicell</td><td>800-010-LG</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriologisches Pepton</td><td>Oxoid</td><td>LP0037</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid biotechnologische Qualität</td><td>Bioshop</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Tris Hydrochlorid</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>Tris Aminomethan</td><td>Bio Basic Canada Inc</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202185A</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bioshop</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>8013-01-2</td><td></td></tr><tr><td>Methylviologen Dichloridhydrat</td><td>Aldrich Chemie</td><td>856177-1G</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 60 x15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 10 ml</td><td>Fisher</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat einbasisch</td><td>G-Biosciences</td><td>RC-084</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat Heptahydrat</td><td>Sigma</td><td>M-5921</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat dibasisch</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Discovery v8 Stereo-Zeiss-Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 Well, klare Mikrotiterplatte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>flcn-1 RNAi-Quelle</td><td>Ahringer Bibliothek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mess oxidativer stress widerstandsrat<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; in 96-well-mikrotiterplatten

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidativer Stress, der die Folge eines Ungleichgewichts zwischen der Erzeugung und Entgiftung von reaktiven Sauerstoffspezies ist, ist ein wesentlicher Faktor, um chronische Humanerkrankungen, kardiovaskulären und neurodegenerativen Erkrankungen, Diabetes, Altern und Krebs. Daher ist es wichtig, oxidativen Stress nicht nur in Zellsystemen als auch mit ganzen Organismen zu studieren. C. elegans ist eine attraktive Modellorganismus, um die Genetik von oxidativem Stress Signaltransduktionswege, die sehr evolutionär konserviert sind zu studieren. Hier stellen wir ein Protokoll, um oxidativen Stress Widerstand in C messen elegans in Flüssigkeit. Kurz gesagt, ROS-induzierenden Reagenzien wie Paraquat (PQ) und H 2 O 2 in M9-Puffer und Lösungen werden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen aliquotiert. Synchronisiert L4 / jungen Erwachsenen C. elegans Tiere werden zu den Vertiefungen transferiert (5-8 Tiere / Vertiefung) und das Überleben wird gemessenjede Stunde, bis die meisten Würmer sind tot. Bei der Durchführung eines oxidativen Stressresistenz-Test unter Verwendung einer niedrigen Konzentration von Stressfaktoren in Platten, Alterung könnte das Verhalten der Tiere auf oxidativen Stress, was zu einer falschen Interpretation der Daten führen könnten, zu beeinflussen. In dem hier beschriebenen Assay Dieses Problem ist jedoch nicht wahrscheinlich, da nur L4 / junge Tiere verwendet werden. Darüber hinaus ist dieses Protokoll kostengünstig und Ergebnisse werden in einem Tag, die diese Technik attraktive für genetische Screens rendert erhalten. Insgesamt wird dies dazu beitragen, um oxidativen Stress Signalübertragungswege, die in bessere Charakterisierung des oxidativen Stress-assoziierten menschlichen Erkrankungen übersetzt werden konnte verstehen.

Vergleicht man Wildtyp C. elegans zu FLCN-1 (ok975) mutierten Tiere Hier haben wir 100 mM PQ, um den Widerstand von Wildtyp-C zu bestimmen elegans Tieren im Vergleich zu FLCN-1 (ok975) von dem gezeigt wurde auf oxidativen Stress, Hitze und Anoxie 23 zu widerstehen. Nach 4 Stunden der Behandlung, 48,3% des Wildtyp-überlebt, im Vergleich zu 77,8% Überlebensrate in FLCN-1 (ok975) Tiere. Wie erwartet, FLCN-1 (ok975) mutier...

C. elegans ist ein attraktiver Modellorganismus zur Untersuchung von Signaltransduktionswegen, die an der oxidativen Stressresistenz beteiligt sind. Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der oxidativen Stressresistenz von C. elegans-Tieren in der Flüssigphase unter Verwendung mehrerer Oxidationsmittel in 96-Well-Platten zur Verfügung.

Mess Oxidativer Stress Widerstandsrat<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96-Well-Mikrotiterplatten

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, oxidativen Stress und die Resistenz von Ceno Titis elegans-Nematoden in Flüssigkeit zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst ROS-induzierende Substanzen wie Paraquat in M9-Puffer gelöst und die Lösung in eine 96-Well-Mikrotiterplatte aliquotiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, fünf bis acht synchronisierte späte L4-Nematoden in jedes Well zu überführen, wobei mindestens 12 Wells pro Bedingung verwendet werden.Anschließend wird unter Verwendung eines Stereomikroskops stündlich die Anzahl der lebenden und toten Tiere bestimmt, bis die Mehrheit der Tiere verstorben ist. Im letzten Schritt wird der Prozentsatz der Tiere berechnet, die zu jedem Zeitpunkt unter jeder Bedingung mindestens sechs Tage vor der Durchführung des Assays zur Bestimmung der oxidativen Stressresistenz überlebt haben. Bereiten Sie die modifizierte junge Grins-only-Bact-PEPIN- oder MYOB-Trockenmischung zur Herstellung des MYOB-Mediums durch gründliches Mischen unter Schütteln vor.Um einen Liter MYOB-Medium herzustellen, mischen Sie sechs Gramm MYOB-Trockenmischung mit 17 Gramm Agar und verdünnen auf einen Liter mit H2O; anschließend 45 Minuten bei 122 Grad Celsius autoklavieren. Gießen Sie das MYOB-Medium in Petrischalen und lassen Sie die Schalen unter sterilen Bedingungen zwei Tage lang bei Raumtemperatur trocknen. Impfen Sie am folgenden Tag 100 Milliliter LB-Brühe mit E. coli OP50-Bakterien und kultivieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. MYOB-Platten mit den E. coli OP50-Bakterien beimpfen und das Bakterienwachstum bei Raumtemperatur für 48 Stunden ermöglichen. In Fällen, in denen die Genunterdrückung mittels RNA-Interferenz erfolgen soll, beginnen Sie das Verfahren mit der Herstellung von MYOB-RNAi-Fütterungsplatten. Nach der Autoklavierung das MYOB-Medium auf etwa 55 Grad Celsius abkühlen lassen.Dann fügen Sie Isopropyl-β-D-thiogalactosid, oder IPTG und Ampicillin zum MYOB-Medium hinzu. Gießen Sie die Platten und lassen Sie sie bei Raumtemperatur zwei Tage lang trocknen. Impfen Sie E. coli HT115-Bakterien auf Agarplatten, die Ampicillin und Tetracyclin enthalten.Ein Stamm wurde mit einem Plasmid transformiert, das einen Kontroll-Plasmidvektor oder ev. ausdrückt. Ein weiterer Stamm wurde mit einem Plasmid transformiert, das die doppelsträngige RNA exprimiert, die FOLLIN eins gezielt anspricht. Mr.NA wird über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert und am folgenden Tag weiter kultiviert.Einzelkolonien entnehmen und LB-Medium mit Ampicillin ansäen. Die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die MYOB-RNAi-Platten mit E. coli HT115 EV-Bakterien oder HT115 Colin1-RNAi-Bakterien entsprechend beimpfen und die Platten vor der Verwendung 48 Stunden bei Raumtemperatur lagern.Bereiten Sie mehrere Platten entsprechend der Anzahl der Würmer vor, die während des Assays benötigt werden, und lassen Sie die Würmer sechs Stunden lang bei 20 Grad Celsius Eier legen. Entfernen Sie anschließend mit einem Platindraht-Wurmlöffel die Mütter. Überprüfen Sie die Platten unter dem Mikroskop, um die Anzahl der abgelegten Eier zu bestimmen.Lassen Sie die Eier schlüpfen und die Würmer 48 Stunden lang bei 20 Grad Celsius wachsen. 48 Stunden später sollten die Tiere im späten L4- oder jungen adulten Stadium sein. Beachten Sie, dass die 48-stündige Inkubation nur für Mutanten gilt, die sich ähnlich wie Wildtyp-Tiere entwickeln.Wenn ein neuer Mutant getestet werden soll, ist es wichtig, zunächst seine Entwicklungsgeschwindigkeit zu überwachen. In dieser Demonstration wird oxidativer Stress mit Paraquat induziert. Bereiten Sie eine frische 100-Millimolar-Paraquat-Lösung gemäß des begleitenden Protokolltexts vor.Paraquat ist eine gefährliche und hochgiftige Verbindung und muss gemäß den entsprechenden Richtlinien gehandhabt werden. Pipettieren Sie 40 Mikroliter der Paraquat-Lösung in jedes Loch einer 96-Loch-Platte. Verwenden Sie mindestens 12 Löcher als Replikate für jede getestete Bedingung unter Verwendung eines Wurmlöffels aus Platin-Draht.Übertragen Sie fünf bis acht L4-Larven-Tiere in jedes Loch, notieren Sie die Start- und Endzeit für jede getestete Bedingung, stellen Sie die 96-Loch-Platte eine Stunde nach dem Startzeitpunkt bei 20 Grad Celsius ab und zählen Sie die toten und lebenden Tiere mithilfe eines Stereomikroskops. Schlütteln Sie die Platte vorsichtig, bevor Sie mit dem Zählen beginnen. Würmer, die sich auch nach Bestrahlung mit hellem Licht nicht bewegen, gelten als tot. Untersuchen Sie die Wurmform, Schwanz- und Kopfbewegungen bei hoher Vergrößerung, um tote von lebenden Würmern zu unterscheiden.Bewerten Sie die Überlebensrate stündlich, bis die meisten Würmer tot sind, und wiederholen Sie diesen Assay mindestens drei unabhängige Male, um den Überlebensprozentsatz für jeden Zeitpunkt zu bestimmen. Berechnen Sie zunächst die Gesamtanzahl der Tiere pro Bedingung, indem Sie die Gesamtanzahl der Tiere addieren, die jeweils übertragen wurden. Ignorieren Sie dabei die Tiere, die beschädigt oder beim Übertragen getötet wurden.Übertragen Sie anschließend für jeden Zeitpunkt. Berechnen Sie die Gesamtanzahl der toten Tiere pro Bedingung. Ermitteln Sie den Prozentsatz der Todesfälle und den Überlebensprozentsatz in dieser Studie.100 Millimolar. Paraquat wurde verwendet, um die Resistenz des Wildtyps C. elegans im Vergleich zu einem follen Ein-Mutanten zu bestimmen, von dem gezeigt wurde, dass er oxidativem Stress, Hitze und Anoxie widersteht. Nach vierstündiger Behandlung überlebten 48,3 % des Wildtyps im Vergleich zu 77,8 % Überlebensrate bei mutierten Tieren.Ähnliche Ergebnisse wurden bei einem Vergleich zwischen Wildtyp-Tieren erzielt, die mit Kontrollnahrung, leeren Vektor oder Follin gefüttert wurden. Eine Herunterregulierung von Follin mittels RNAi in einem RNAi-Bakterienansatz erhöhte die Resistenz gegenüber 100 Millimolar Paraquat, was zeigt, dass die Herunterregulierung der Genfunktion mittels RNAi funktionellen Verlustmutationen nachahmt. Ist diese Technik einmal beherrscht, kann sie leicht angewandt werden, um Gene zu identifizieren, die die Resistenz gegenüber oxidativem Stress verändern, und bietet dabei Eleganz. Schließlich hat die Durchführung solcher Screenings und die damit verbundene Eleganz einen großen Wert und ein hohes Potenzial für die Behandlung menschlicher Krankheiten, die mit oxidativem Stress in Verbindung stehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Protokoll wird eine Methode zur...

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Dieses Video stellt einen Kurzzeit-Überlebenstest vor, der eine Behandlung auf akute Toxizität testet oder einen genetischen Stamm auf Resistenz gegen eine toxische Bedingung testet. Das Beispielprotokoll zeigt einen Beispiel-Überlebenstest, in dem Würmer auf ihre Fähigkeit getestet werden, oxidativem Stress zu widerstehen, der durch Paraquat (PQ) induziert wird.

C. elegans Überlebenstest: Ein Kurzzeittoxizitätstest

Dieses Video zeigt einen Spot-Plate-Assay, der auf die Bewertung der oxidativen Stressreaktionen von Bakterienstämmen zugeschnitten ist. Einige Stämme produzieren Pyomelanin, ein antioxidatives Pigment. Umgekehrt weisen Stämme, die mit einem Testmittel behandelt wurden, was zu einer verminderten Pyomelaninproduktion führte, eine erhöhte Anfälligkeit für oxidativen Stress auf, was zu einer verminderten Zellviabilität im Vergleich zu Pyomelanin-produzierenden Stämmen führte.

Ein Spot-Plate-Assay zur Bewertung oxidativer Stressreaktionen in Bakterienstämmen

Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Herstellung von schnell Hunderte von Nematoden Wachstum Medien Agar, 96-Well-Kultur-Platten mit einer konsistenten Anzahl von Caenorhhabditis Elegans pro Bohrloch. Diese Kulturen sind nützlich für das phänotypische Screening von ganzen Organismen. Wir konzentrieren uns hier auf dieser Kulturen zu Bildschirm Chemikalien für pro-Langlebigkeit-Effekte verwenden.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für den großflächigen Anbau von Caenorhabditis Elegans auf festen Medien. Als Alternative zu flüssigen Kultur ermöglicht dieses Protokoll Parameter der verschiedenen Maßstäben Platte-basierte Anbaufläche zu erhalten. Dies erhöht die Vergleichbarkeit der Ergebnisse durch den Verzicht auf die morphologischen und metabolische Unterschiede zwischen flüssigen und festen Medienkultur.

Platte-basierte Large-Scale Anbau von Caenorhabditis Elegans: Probenvorbereitung für die Studie von Stoffwechselveränderungen bei Diabetes

Mitochondriale Atmung ist entscheidend für das organismal überleben; Sauerstoff-Verbrauch ist daher ein hervorragender Indikator für mitochondriale Gesundheit. In diesem Protokoll wir beschreiben die Verwendung von handelsüblichen Respirometer basale messen und maximale Sauerstoff-Verbrauch im Leben, intakt und frei bewegliche Caenorhabditis Elegans.

Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen in intakten Caenorhabditis elegans

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans ist ein hervorragendes Modell, Wirt-Pathogen Interaktionen zu zergliedern. Hier beschrieben, ist ein Protokoll zu infizieren den Wurm mit den Mitgliedern der Gruppe Streptokokken Mitis und Aktivierung der oxidativen Stress-Reaktion gegen H2O2 produziert von dieser Gruppe von Organismen zu bestimmen.

Studium der oxidativen Stress verursachten Mitis Gruppe Streptokokken in Caenorhabditis elegans

Hier charakterisieren wir zelluläre proteotoxische Stressreaktionen in der Nematode C. elegans, indem wir die Aktivierung fluoreszierender Transkriptionsreporter messen und die Empfindlichkeit gegenüber physiologischem Stress beobachten.

Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans

Hier werden standardisierte Protokolle zur Beurteilung der Induktion der Wärmeschockreaktion (HSR) bei Caenorhabditis elegans mit RT-qPCR auf molekularer Ebene, fluoreszierenden Reportern auf zellulärer Ebene und Thermorecovery auf Organismusebene vorgestellt.

Standardisierte Methoden zur Messung der Induktion der Hitzeschockreaktion bei Caenorhabditis elegans

Darmmikroben können die Gesundheit ihres Wirts über spezifische oder konservierte Mechanismen positiv oder negativ beeinflussen. Caenorhabditis elegans ist eine bequeme Plattform, um nach solchen Mikroben zu suchen. Das vorliegende Protokoll beschreibt das Hochdurchsatz-Screening von 48 Bakterienisolaten auf Auswirkungen auf die Nematoden-Stressresistenz, die als Proxy für die Gesundheit von Würmern verwendet werden.

Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Isolate mit Auswirkungen auf die Gesundheit von Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans dienen als hervorragendes Modellsystem mit robusten und kostengünstigen Methoden zur Untersuchung von Gesundheit, Lebensdauer und Stressresistenz.

Erhebung kostengünstiger Methoden zur Messung von Lebensdauer und Gesundheitserwartung bei Caenorhabditis elegans

Erfahren Sie, wie Sie oxidativen Stresswiderstand bei Caenorhabditis elegans in 96-Well-Platten messen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Überlebensraten unter oxidativen Stressbedingungen.

Mess Oxidativer Stress Widerstandsrat

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