In-vivo-Imaging und Verfolgung von Technetium-99m markierten Knochenmark mesenchymale Stammzellen in Equine Tendinopathie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Verteilung und das Schicksal markierter mesenchymaler Knochenmarkstammzellen nach ihrer Injektion mithilfe der Gammaskintigraphie nichtinvasiv zu verfolgen. Das Schicksal der Stammzellen nach der Injektion ist bislang nur unzureichend verstanden. Die wichtigsten Vorteile dieser Methode liegen darin, dass die Stammzellen nach der Applikation nichtinvasiv in mehreren Organen verfolgt werden können und dass die kurze Halbwertszeit des A osteo einen vollständigen Abbau innerhalb von 48 Stunden gewährleistet.

Obwohl dies Einblicke in die Verwendung von Stammzellen bei der Therapie natürlicher Tendinopathien ermöglicht hat, könnte es auch zur Untersuchung von Therapien bei Knochen- und Herzerkrankungen genutzt werden. Im Allgemeinen bestehen die Herausforderungen für Personen, die neu in dieser Methode sind, in der Koordination der Zellen und der Vorbereitung der Markierung sowie der Einrichtung des Patienten. Um die Zellen unverzüglich anzuwenden, tragen Sie zunächst akustisches Koppelgel auf das rasierte Gliedmaßenareal auf und verwenden Sie einen linearen Wandler, um systematisch die gesamte palmare Metakarpalregion zu scannen, um serielle Quer- und Längsschnittdarstellungen zu erhalten, um die Zone mit dem maximalen Verletzungsausmaß zu identifizieren.

Nach der Verabreichung eines Lokalanästhetikums die Implantationsstelle mindestens fünf Minuten lang mit einer chirurgischen Chlorhexidin-Lösung abwaschen und anschließend mit einem mit Ethanol getränkten Tupfer abwischen. Zunächst Handschuhe anziehen, sobald das Tier präpariert ist, und eine Portion von 1 × 10⁷ Zellen des Knochenmark-Mesenchymalen Stromazells (BM-MSC) in einem Milliliter Knochenmark-Überstand durch Zentrifugation pelletieren. Danach den Überstand mit einer 2-Milliliter-Spritze, ausgestattet mit einer Nadel der Größe 18 oder 19, abziehen, wobei etwa 100 Mikroliter Lösung im Reagenzglas verbleiben.

Überführen Sie das Überstand in ein Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig durch leichtes Schwenken im verbleibenden 100 µL Überstand. Achten Sie darauf, dass die Zellen vollständig resuspendiert sind und keine sichtbaren Gewebeklumpen vorhanden sind. Anschließend lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur stehen.

Nun mischen Sie ein Milliliter des Technetium-Protec-Nutats in ein Gefäß mit H-M-P-A-O. Nach fünf Minuten behandeln Sie die mesenchymalen Stammzellen mit einer Ein-Milliliter-Spritze und Nadel mit dem gesamten Aliquot des TECHNETIUM-99m-H-M-P-A-O. Danach verschließen Sie das Röhrchen, mischen die Zellen durch vorsichtiges Antippen und stellen das Röhrchen hinter einer Bleiabschirmung bei Raumtemperatur ab.

Nach 30 Minuten öffnen Sie das Röhrchen mit einer Pinzette und geben mithilfe einer Milliliterspritze mit einer 21-Gauge-Nadel ein Milliliter PBS zu den Zellen hinzu. Verschließen Sie das Röhrchen erneut und mischen Sie die Zellen. Zentrifugieren Sie danach die Zellen und übertragen Sie das Überstandsvolumen vorsichtig mit der Zweimilliliterspritze in ein entsprechend gekennzeichnetes, abgeschirmtes Röhrchen, das als „Wash 1“ beschriftet ist.

Waschen Sie das Pellet anschließend wie eben gezeigt in einem weiteren Milliliter PBS. Überführen Sie die zweite Waschung nach dem zweiten Waschschritt in das entsprechende abgeschirmte Reagenzglas, das mit W2 beschriftet ist. Resuspendieren Sie die Zellen gründlich in dem verbleibenden PBS und geben Sie die Aliquote des eiskalten Knochenmark-Überstandes hinzu, wobei Sie den Transduktor parallel zur Nadel halten.

Führen Sie eine 1,5 oder zwei Zoll lange Nadel mit 20 Gauge langsam in die Mitte der Läsion in longitudinaler Ausrichtung in die Zone mit dem maximalen Verletzungsgrad ein. Aspirieren Sie anschließend unter Verwendung der geeigneten Abschirmung die Zellen in eine 2-Milliliter-Luer-Lock-Spritze, die mit einer 20-Gauge-Nadel ausgestattet ist, und entsorgen Sie die Nadel, wobei darauf geachtet werden muss, dass keine Flüssigkeit verloren geht. Nachdem die Spritze an die zuvor platzierte Nadel in der Sehne angeschlossen wurde, positionieren Sie den Ultraschallkopf unter der Nadel, sodass die Nadelspur im Gewebe deutlich sichtbar ist, und injizieren Sie die Zellen langsam, aber gleichmäßig in die Läsion.

Überprüfen Sie, ob die in die Läsion eingespritzte Flüssigkeit im Ultraschallbild als koische Flüssigkeit mit hyperechogenen Luftblasen sichtbar ist. Sobald alle Zellen verabreicht wurden, ziehen Sie die Nadel zurück. Verwenden Sie im Verarbeitungssoftware die Auswahl „Studie erfassen“ und die Option „Knochen statisch“, um jeweils 60 Sekunden lang statische Bilder aufzuzeichnen. Danach erhalten Sie laterale Aufnahmen des Läsionsgebiets, vom Karpus bis zum distalen Extrem, des entsprechenden Bereichs der kontralateralen Extremität, des linken Lungenfelds und der linken Schilddrüse zu den angegebenen Zeitpunkten.

Danach wählen Sie den Bereich von Interesse und die Ellipsen-Werkzeuge aus und passen die Auswahlmaske entsprechend über dem Läsionsbereich an. Wählen Sie abschließend die Option „Zwei Statistiken hinzufügen“, um die Anzahlen für den Bereich von Interesse zu erhalten. Achten Sie darauf, dass für jedes Tier zu den verschiedenen Zeitpunkten identisch große Bereiche von Interesse aufgezeichnet werden.

Nach der intralesionalen Applikation werden die Zellen als fokaler Signalbereich beobachtet, wobei sich im Zeitverlauf eine begrenzte Ausbreitung der Zellen in das umgebende Sehnengewebe zeigt. Im Gegensatz dazu tritt bei der regionalen Perfusion über die digitale Palmarvene eine allmähliche Verringerung des Signals am Injektionsort auf. Im Zeitverlauf sind die Lungenfelder nach intralesionaler Injektion gewöhnlich negativ, jedoch können zu frühen Zeitpunkten gelegentlich sehr fokale Signale detektiert werden, die sich im Verlauf verallgemeinern.

Die Schilddrüse bleibt auch bei dieser Applikationsroute negativ. Die regionale Perfusion zeigt außerdem ein fokales Signal in den Lungen, das im Verlauf diffuser wird, wobei das Signal im Vergleich zur intralesionellen Applikationsroute deutlich intensiver ist. Da auch die Schilddrüse häufig ein fokales Signal aufweist, erfolgt die Erfassung der Gesamtanzahl der Radioisotope in den Zellen zum Zeitpunkt null vor der Injektion sowie der Zählraten aus dem initialen Gammagramm in der interessierenden Region.

Zum Zeitpunkt null nach der Injektion können die Anfangswerte verwendet werden, um den prozentualen Rückgang der Zählwerte zu jedem Zeitpunkt nach der Injektion zu berechnen und so den vorhergesagten Zerfall des TC 99 M anhand der Anfangszählwerte zu bestimmen. Die Verweildauer der Zellen, die sich nach der Injektion an der Injektionsstelle befinden, kann dann ebenfalls für jeden Zeitpunkt berechnet werden. Mit dieser Methode können auch andere Applikationswege der Zellverabreichung angewandt werden, um weitere Fragen zur Homing-Fähigkeit der mesenchymalen Stammzellen nach deren Entwicklung zu beantworten.

Diese Technik hat für Forscher auf dem Gebiet der regionalen Medizin den Weg geebnet, Methoden zur Verbesserung der Zellretention innerhalb von Sehnenverletzungen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Zellen markiert und ihre Verteilung sowie Konzentration in verschiedenen Organsystemen erfasst werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit ionisierender Strahlung äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie persönliche Schutzausrüstung, Strahlungsmonitore, Abschirmung mit Blei sowie die ordnungsgemäße Entsorgung kontaminierten Abfalls während dieses Verfahrens unerlässlich sind.