Name: In-vivo-Imaging und Verfolgung von Technetium-99m markierten Knochenmark mesenchymale Stammzellen in Equine Tendinopathie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Erfahren Sie die nicht-invasive Gamma-Szintigraphie zur Verfolgung von Technetium-99m markierten Knochenmark-Mesenchymstammzellen bei Equine Tendinopathie. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Zellüberleben und Gewebeverteilung im Laufe der Zeit.

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Die Autoren möchten sich für die Finanzierung durch das Horserace Betting Levy Board U.K. (Fördernummer 721) und VetCell BioScience Ltd, U.K. sowie durch die Consejerìa de Innovaciòn, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucìa, Spanien, bedanken.

Die hier beschriebenen Fälle wurden folgende ethische Genehmigung durch die Tierethik und Tierschutz Ausschuss des Colegio de Veterinarios de Malaga, Spanien, und dem Royal Veterinary College, North Mymms, UK auf den Pferden verwendet Verfahren erteilten geführt werden auf genehmigten Protokolle, die es auf der Grundlage in der Klinik für Pferde, die Stammzell-basierte Therapien, die Sedierung, Knochenmark-Aspiration, intra-Sehnen Injektion, regionalen Perfusion, intravenöse Injektion, post-prozeduralen Behandlung und Schmerzmanagement und Überwachung nach der Implantation enthält verwendet. 1. Schlüssel Vorkehrungen getroffen werden, in Advance <ol><li> Suchen institutionelle Ethik und Tierschutz-Zulassung und sich an lokalen gesetzlichen Vorschriften vor Beginn der Arbeiten. </li><li> Suchen institutionellen Genehmigung mit ionisierender Strahlung arbeiten, wie von den lokalen und gesetzlichen Vorschriften, einschließlich der angemessenen Schutz des Personals und der Umwelt und der Veräußerung von CONTAM diktiertinated Abfälle. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Aufnahmekriterien: mit einem nicht-traumatische Überbeanspruchung Verletzungen (Tendinopathie oder desmopathy) an die oberflächliche Beuge digitale Sehne des Vorderbein und Läsionen, was zu einem Mangel innerhalb der Sehne und dem Mangel vor Pferden durch intakte Sehne und / oder Sehnengleitgewebe umgeben . Hinweis: Die Untersuchung und Diagnose für solche Verletzungen und der klinischen Vorbereitung der Pferde für Zellimplantation wurde an anderer Stelle ausführlich 6,15. Anmerkung: Die Isolierung und Expansion in Kultur von BMMSC aus dem Knochenmark von Pferden abgeleitete zuvor 6,16 detailliert wurde. Das aktuelle Protokoll zum Einspritzen BMMSC für SDFT Verletzungen beim Pferd nutzt 10 Millionen Zellen pro ml 4 von autologen Knochenmarkstand (BMS) 16. </li><li> Verwenden Zellen, die nicht mehr als 4 Durchgänge für die in vivo-Implantation unterzogen wurden, um mögliche zelluläre Phänotyp oder genetischen Veränderungen mit hoher Durchlaufhäufigkeit c zugeordnet vermeidenEllen. </li><li> Geben Sie die erforderliche Anzahl von Zellen in der BMS (innerhalb von 24 h in einem Kühlfach an 4 - 8 ° C) in die Tierklinik, wo die Zellimplantation durchgeführt werden soll. Hinweis: Die klinische Anwendung von mesenchymalen Stammzellen im Knochenmark Stand ist ein patentiertes Verfahren durch ReCellerate Inc (USA) und seine Verwendung im Besitz kann genehmigungspflichtig. Anmerkung: Tc-99m ist ein Gamma-Strahler (140 keV) mit einer relativ kurzen Halbwertszeit (hr 6,0058 daher fast 94% der es zerfällt in seine stabile Form von 99 Tc in 24 h). Die Gamma-Energie macht es geeignet für die Detektion von Gammakameras (Szintigraphie) und der kurzen Halbwertszeit führt zu sehr begrenztes radioBelichtungsZeit, um sowohl das Pferd und die Behandlung der Tiere Personal. Dieses Protokoll beschreibt die Vor-Ort-Markierung von Zellen unter Verwendung von Tc-99m-HMPAO [HMPAO mit Tc-99m (als Natriumpertechnetat) markiert]. </li><li> Bestellen Sie das Tc-99m frisch vom Lieferanten, dass sie geliefert wird und zur Markierung der Zellen wit verwendetHin 2 h Elution von der Tc-99m-Generator. Sicherzustellen, dass der Tc-99m wird wie in 1 GBq (Standardpuffer Zulieferers) Eine 1 ml Lösung geliefert. </li><li> Verwenden Sie alle Puffer bei RT. Führen Sie die Markierungsverfahren, die Implantation der Zellen und Bildgebung (Gammaszintigraphie) in einem Isotop Containraum mit allen Geräten mit Alkohol gereinigt wischt vor dem Beginn der Arbeit. </li></ol> 2. Vorbereitung des Pferdes und Ultraschall des Vorderbein Tendon <ol><li> Nehmen Ultraschalluntersuchungen auf den ersten Eintritt für Verletzungen (bei Knochenmark angesaugt wird) und dann zu dem Zeitpunkt, wenn radioaktiv markierten Zellen injiziert. </li><li> Führen Sonographie und Zellimplantation mit dem Pferd Lager Gewicht gleichmäßig im Stall und im stehenden Sedierung (statt Vollnarkose). Verabreichen Sedierung mit einem Gemisch aus HCl und Detomidin Butorphanoltartrat, jeweils 0,01 bis 0,02 mg / kg iv. Hinweis: Recovery ist schnell und post-operative Behandlung erfordert keinebesondere Überlegungen. </li><li> Nach perineuralen Anästhesie angewendet wird (Schritt 2.6) in der betroffenen Extremität, halten das Pferd an der Station unter Sedierung, um die Bewegung des Pferdes während der Behandlung zu verringern. Sichtprüfung der entsprechenden Ebene der Sedierung aus der abgesenkten Kopfposition und der Haltung des Pferdes und das Pferd ist bequem während der Zellinjektion und den Bewegungen der Gamma-Kamera während der Aufnahme Szintigrafen Bilder beurteilt. Hinweis: Es ist nicht notwendig, Tierarzt Salbe auf die Augen (bis zur Trockenheit zu verhindern), weil unter Sedierung Blinken gelten nicht beeinträchtigt wird und das Pferd in der Lage, Feuchtigkeit der Augen zu erhalten. Die Überwachung nach der Implantation der Zellen nicht invasiv ist (Ultraschall und Gammaszintigraphie). </li><li> Clip genau das Haar über der Sehne (mit Pferdehaarschneidemaschinen), dann reinigen Sie den abgeschnitten Bereich mit einer Kombination aus einem Chlorhexidin-chirurgische Macchia und schließlich Alkohol. </li><li> Bewerben akustische Kopplung Gel in der Gegend undscannen methodisch Scans des gesamten Handflächenmittelhandbereich sequenziell markierten Stufen 1 notieren - 7 17, mit einem linearen Wandler (12 MHz oder ähnlich) auf serielle on-Inzidenz Quer- und Längs Bilder zu erhalten. Speichern die Bilder digital, so dass der Querschnittsbereich und die maximale Schadenszone 4 kann mit Hilfe einer Bildanalyse-Software erhalten werden. </li><li> Bereiten Sie den Bereich, die über den Handflächen Nerven unmittelbar distal der Handwurzel für aseptische Injektion von Lokalanästhetikum, um eine vollständige Desensibilisierung der Haut über der Sehne und der oberflächlichen Beugesehne zu gewährleisten. Spritzen Sie 2 ml mepivicaine sowohl subkutan und angrenzend an die palmare Nerven (in deren Unter Faszien Lage) zwischen den Beugesehnen und der Fesselträger unmittelbar distal der Handwurzel zu beiden Seiten des Gliedes. </li><li> Sobald die vorläufigen Scan durchgeführt wurde, bereiten die Implantationsstelle durch Waschen den Bereich mit einem Chlorhexidin-chirurgische scrub Lösung für mindestens 5 Minuten und schließlich mit Alkohol getränkter Gaze. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in aseptischer Art und Weise. </li></ol> 3. Tc-99m-Markierung von Equine mesenchymalen Stammzellen Hinweis: Die Zellmarkierung Schritte können während der Ultraschalluntersuchung der Vordergliedmaße, da dies zu minimieren Isotopenzerfall zwischen Zellmarkierung und Implantation von markierten Zellen in die Sehne durchgeführt werden. <ol><li> Entfernen Sie den BMS aus den Zellen, wie es mit der Aufnahme von isotopen stört. Um dies zu tun, rufen Sie die Fläschchen BMMSC (10 Millionen Zellen in 1 ml BMS) von der Kühlkasten und Pellet die Zellen in einer Mikrozentrifuge bei 350 xg für 5 min bei RT. Den Überstand mit einer 18G oder 19G Nadel (in ein 2-ml-Spritze befestigt) Entfernen Sie vorsichtig, so dass ein kleiner Tropfen (≤0.1 ml) in der Röhre, um die Zell Resuspendierung zu erleichtern. Speichern Sie den Überstand (das BMS) in einer sterilen Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis für eine spätere Wiederverwendung zu halten. </li><li> Resuspendieren der Zellen in dem verbleibenden Tröpfchen der Überstand durch flIcking das Rohr vorsichtig mit den Fingern (anstatt Vortex) und lassen Sie das Rohr in einem Rack bei RT. Achten Sie darauf, die Zellen vollständig suspendiert und dass es keine sichtbaren Zellklumpen. </li><li> Bereiten Sie das Tc-99m wie folgt. 1 ml der Technetium Pertechnetat in eine Phiole HMPAO Verwendung einer 1 ml Spritze und einer Nadel. Mischen Sie vorsichtig, aber gründlich und lassen Sie für 5 Minuten hinter Bleiabschirmung. Anmerkung: Dieser Schritt kann durchgeführt werden, während die Zellen in Schritt 2.1 zu drehen. </li><li> In all der Tc-99m-HMPAO Mischung unter Verwendung einer 1 ml Spritze und Nadel für die Zellen und vorsichtig mischen. Inkubation für 30 min bei RT hinter Bleiabschirmung. </li><li> Für die nächsten Schritte, verwenden Sie eine Zange (oder ein Stück Seidenpapier), um den Deckel des Mikrozentrifugenröhrchen öffnen, um Isotop Kontamination der (behandschuhten) Daumen und anschließend anderen Geräten zu minimieren. Verwenden Sie ein 2-ml-Spritze und 21 G-Nadel, um hinzuzufügen oder zu entfernen Waschpuffer. Anmerkung: Die Verwendung eines Feld Isotop Monitor wird gefördert, um eine Verunreinigung der Oberflächen und Geräte überwachen. </li&gt; <li> 1 ml PBS auf die Tc-99m-HMPAO-Zellmischung, den Deckel schließen, vorsichtig mischen und Spin, um die Zellen zu pelletieren, wie in Schritt 3.1. </li><li> Die PBS Entfernen Sie vorsichtig in ein neues Röhrchen (speichern Sie diese hinter Bleiabschirmung und Label als W1). Zellpellet in 1 ml frischem PBS. Zentrifugieren Sie das Röhrchen und Überstand wie oben (speichern Sie diese und Label als W2). </li><li> Berechnung der Effizienz der Markierung durch Messen der Zählungen in W1 und W2 Rohren und in dem Zellpellet. Tun Sie dies, indem jede Röhrchen in einem Well-Isotop Dosiskalibrator Instrument und Aufzeichnen der Radioaktivität als Zählungen pro Minute (CPM). Berechnen Sie die Markierungseffizienz als (Radioaktivität als CPM von Zellen) / (Radioaktivität von Zellen + Überstand) x 100. </li><li> Resuspendieren der Zellen gründlich in der Rest PBS und fügen Sie den BMS gerettet aus Schritt 3.1. Die Zellen sind bereit für intraläsionale Implantation. </li></ol> 4. Die Implantation von Tc-99m-HMPAO-markierten Zellen <ol><li> Intraläsionale Implantationin die Sehne unter Ultraschallkontrolle <ol><li> Langsam einführen 1,5 oder 2 Zoll (50 mm) 20 G-Nadel in die Maximalverletzungszone der Läsion in einer Längsausrichtung mit dem Ultraschallwandler in einem sterilen Tuch abgedeckt, im Einklang mit der Nadel, so dass die Länge der Nadel sonographisch erkannt werden und die Spitze, wenn die Nadel genau in der Mitte der Läsion entfernt. </li><li> Unter Verwendung geeigneter Abschirmung, sammeln die Zellen in ein 2-ml-Spritze mit einer 20 G-Nadel (Luer-Lock, das Risiko von Verunreinigungen von außen und in einer Bleiabschirmung Spritzenabdeckung zu minimieren). Entsorgen Sie die Nadel darauf achten, daß keine Flüssigkeit zu verlieren. Jetzt legen Sie die Spritze mit der markierten Zellen auf die Nadel in der Sehne vor, entfernt. </li><li> Platzieren der Ultraschallsonde unter der Nadel, so dass der Stichkanal im Gewebe ist deutlich sichtbar. Injizieren der Zellen bei einer langsamen, aber stetigen Tempo in die Läsion. Sicherzustellen, dass es keinen Widerstand gegen Injektion. Wenn dies auftrittsorgfältig neu zu positionieren die Nadel unter Ultraschallkontrolle. Überprüfen Sie, dass die Fluidausstoß in die Läsion auf dem Ultraschallbild als echofreie Flüssigkeit enthaltende hyperechogenen Luftblasen sichtbar ist. </li><li> Zurückziehen der Nadel und unmittelbar platzieren Druck über dem Nadelloch zu einem Verlust der injizierten Zellen zu verhindern und die Ausbreitung von Isotop über die Außenfläche des Gliedes zu minimieren. Unmittelbar Kleid das Teil mit einer Schicht aus Selbstklebender Verband. Das Pferd ist nun bereit für Gammaszintigraphie. Führen Sie dies sofort. Hinweis: Nach der Injektion der Zellen in der Sehne, erwerben eine Zählung der leeren Spritze und Nadel, um möglichst direkten Verlust von Zellen, die in der Spritze verbleiben können beurteilen. </li></ol></li><li> Regionale Perfusion von Tc-99m-HMPAO-markierten Zellen <ol><li> Folgen Sie Schritt 2.4. </li><li> Tragen Sie eine 100 mm Gummiaderpresse Verband an dem proximalen Mittelhand mit zwei 100 mm Watterolle Mullbinde medial und lateral positioniert. </li><li> Aseptisch vorbereiten the Haut über dem seitlichen Handflächenfingervenen auf der Ebene der lateralen proximalen Sesambein durch Schrubben der Fläche mit einem Chlorhexidin chirurgischen Scheuer Lösung für mindestens 5 Minuten und schließlich mit Gaze in Alkohol getränkt. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in aseptischer Art und Weise. </li><li> Bereiten Sie eine 100 mm Verlängerung mit einer 21 G x ¾ &quot;(0,8 x 19 mm) Butterfly-Nadel bei der Blutabnahme eingestellt, indem mit heparinisierter steriler Kochsalzlösung und dann einzuführen, die Nadel in die seitlichen Handflächenfingervenen. Sobald die Vene eingegeben Blut wird teilweise zu füllen den Erweiterungssatz. An der Luer-Lock-Anschluss legen Sie eine Luer-Lock-Gummikappe zur Erleichterung der nachfolgenden Injektion von markierten Zellen. </li><li> Verdünnen Sie die MSCs in 19 ml PBS durch das Sammeln der Zellen in einer 20-ml-Spritze mit dem PBS vorinstalliert. Übernehmen Sie die Zellen über den Gummi-Cup mit einem 18 g (1,2 x 40 mm) Injektionsnadel in einem langsamen, aber stetigen Rate (30 - 40 sec). Spülen Sie den Katheter mit 1 ml PBS in einer syring vorinstallierte. </li><li> Entfernen Sie die Nadel und sofort anwenden Druck auf der Haut über dem Nadelloch mit einer Schicht von fünf 4 x 4 Baumwoll-Gaze. Dann legen Sie einen leichten Verband mit elastischer Klebstoff über das proximale Sesambereich und lassen Sie den Stauschlauch an Ort und Stelle für 30 Minuten nach der Injektion. </li><li> Lassen Sie die Aderpresse nach 30 min. Das Pferd ist nun bereit für Gammaszintigraphie. Hinweis: Nach der Injektion der Zellen, zu erwerben eine Zählung der leeren Spritze und Nadel, um möglichst direkten Verlust von Zellen, die in der Spritze verbleiben können beurteilen. </li></ol></li></ol> 5. Gammaszintigraphie <ol><li> Szintigraphie Bilder <ol><li> Erwerben planare Szintigraphie Bilder mit einer Gamma-Kamera (bei 140 keV photoelektrischen Peak unter Verwendung eines 20% symmetrische Fenster festgelegt) mit einem niedrigen Energieverbrauch, parallel Loch-Kollimator ausgestattet. <ol><li> Erhalten Sie alle Bilder nach dem Zeitpunkt 0 auf Pferden stehend, wie in Schritt 2.2 sediert. Nach der Zeit 0 Szintigramm, ersetzen Sie die Licht Verband über die Implantation site mit einem Polsterbinde. Entfernen Sie diesen Verband vor jeder Szintigraphie Prüfung. </li><li> Erwerben Sie statische Bilder für 60 Sekunden jede (256 mal 256 Matrix) mit der Verarbeitungssoftware mit dem &quot;erwerben&quot; - &quot;Studienauswahl&quot; - &quot;Knochen statische&quot; Optionen. Wesentlich ist, dass das Pferd nicht bei der Bildaufnahme Zeitraum zu bewegen, weil der Modus Option statisch nicht über ein Modul zur Korrektur der Bewegung. </li><li> Für intraläsionale Injektion erhalten seitlichen Bilder von der Läsion Bereich von der Handwurzel, um das distale Ende, das Äquivalent Bereich der kontralateralen Gliedmaße, der linken Lunge Feld und der linken Schilddrüse. Bei der Übernahme der Vorderbeine Bilder, positionieren Sie einen Bleischirm zwischen die Beine, um Bildgebung des Gliedes kontralateralen vermeiden. Erfassen die Bilder bei 5 min nach der Injektion (Zeit 0) und dann nach 1, 3, 6, 12, 24, 36 und 48 Std. </li><li> Für die regionale Durchblutung, erhalten lateral und dorsal gamma Bilder wie 5.1.1.3. Besorgen Sie Bilder 5 min after Blutsperre. Dies wird einige Zeit 0 sein unmittelbar nach dem Einspritzen der Zellen zählt vor Release Tourniquet zu bewerten Es kann nützlich sein Bild der Gliedmaße zu sein. Erhalten gamma Bilder 1, 3, 6, 12, 24, 36 und 48 Stunden nach der Verabreichung der Zellen. </li></ol></li><li> Nachdem die Bilder erworben wurden, verarbeiten die Bilder manuell mit Hilfe der Option &quot;Verarbeitung&quot; der Software mit Optionen für &quot;Sokoloff&quot; Farbe und &quot;Invert&quot; Farbe ausgewählt. Als nächstes wählen Sie die &quot;region of interest&quot; (ROI) und &quot;Ellipse&quot;, da dies ermöglicht Umgestaltung der Auswahlmaske und Bewegung über den Schädigungsbereich. Besorgen Sie sich die Zählungen über den ROI, indem Sie die Option &quot;in den Statistiken&quot;. Sicherzustellen, dass gleich große Bereiche von Interesse (ROI) sind für jedes Tier in den verschiedenen Zeitpunkten erfasst. </li><li> Weiter, korrigieren Sie die Zählungen für die vorhergesagte Abfall des Technetium zu jedem Zeitpunkt. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die für den Abfall zu beseitigen:A = A o e - (0.693t / T 1/2) ist, wobei A o die Anfangsaktivität des Isotops ist, A die Zerfalls korrigierte Radioaktivität zur Zeit null ist, t die verstrichene Zeit und T 1/2 die Halb -life des Isotops. Dann drücken die korrigierten Impulse zu jedem Zeitpunkt in Prozent des ROI zum Zeitpunkt 0 zu erarbeiten, den Prozentsatz an Zellen verbleibende, mit der folgenden Formel: </li></ol></li></ol> % verbleibende Zellen (t) = 100 - {[(vorhergesagten Verfall (t) - Zerfall (t)) / vorhergesagten Verfall (t)]} x 100 Decay (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.

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<li>Heckl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+contrast+agents+for+molecular+imaging+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Future contrast agents for molecular imaging in stroke.</a> Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).</li>
</ol>

JD und RKS sind Mitglieder des wissenschaftlichen Beirats von ReCellerate Inc.

Zusätzlich zum Knochenmark, Stammzellen sind aus Quellen wie Fettgewebe isoliert zur Markierung mit diesem Protokoll. Darüber hinaus können Zellen aus einem gefrorenen Zustand wiederbelebt und in Kultur vermehrt auf die gewünschten Zahlen für Markierungsstudien 12 werden. Ein kritischer Faktor, der die Effizienz der Markierung des BMMSC bestimmt, ist die Zeit zwischen der Elution des Tc-99m aus dem Molybdängenerator an der Radiopharmazie, Herstellung von Tc-99m-HMPAO und Verwendun...

Regenerativ-Strategien für die Reparatur von erkranktem oder beschädigtem Gewebe an multipotenten Stammzellen, die aus einer Vielzahl von Gewebe gewonnen und in den betroffenen Bereich implantiert basiert. Jüngste Fortschritte in der Anwendung der autologen BMMSC zur Behandlung von Sehnen- und Bänderverletzungen beim Pferd verbessert Endpunkte sowohl in experimentellen 1-5 und klinischen Studien. 6 gezeigt Das Pferd ist ein besonders attraktives Modell für die Beurteilung der Wirksamkeit der Stammzellbezogenen Behandlungen, weil sie leidet unter dem Alter und überfordern Verletzungen der Sehnen des distalen Vordergliedmaße, ist es ein athletischer Tier, und es ist eine große, Erleichterung Erholung des Knochenmarks und genaue Implantation. Sehnenverletzungen heilen natürlich mit Fibrose, aber die Sehne verheilt ist funktional inferior 7 und hat ein hohes Risiko für erneute Verletzungen 8. Die oberflächliche Beugesehne (SDFT) ist am häufigsten betroffen, wie es entwickelt hat, um als elastische Energie handelnLaden und Erfahrungen hohen Belastung betont, um energiesparende und hohe Geschwindigkeit der Fortbewegung zu erzielen. Wiederherstellung der Funktion nach einer Verletzung ist daher entscheidend. Diese Verletzungen sind ähnlich zu solchen, die die Achillessehne bei Menschen, die eine ähnliche Funktion 9 ausführt. Es gibt keine guten Behandlungsmöglichkeiten zu behandeln oder zu erreichen, der guten Reparatur für solche Verletzungen, also zellbasierte regenerative Strategien bieten eine attraktive Möglichkeit, die Ergebnisse zu verbessern und um eine erneute Verletzungen zu verringern. In den meisten Studien 5 bis 20.000.000 autologe BMMSC werden direkt in die Läsion in der Regel innerhalb des Kerns der Sehne Körper, dient daher als Aufnahme für die Zellen auftreten injiziert. Das Schicksal der Zellen einmal injiziert ist nicht klar, und verschiedene Zellmarkierungsverfahren zu verfolgen, die Zellen wurden kürzlich beschrieben. Zellen mit einem Fluoreszenz-Tag markiert wurde gezeigt, nur in relativ kleinen Stückzahlen (&lt;10%) 10,11 überleben. Fluoreszenzmarkierungen erforderlichGewebeentnahme und Schnitte für die histologische Analyse, was zeitaufwendig ist und nicht leicht zu erleichtern zeitliche Analyse in einem Großtiermodell oder in klinischen Fällen. In neueren Arbeiten haben wir die Radioisotop 99m Tc verwendet werden, um Zellen zu markieren, und folgen Sie ihr Schicksal durch Gammaszintigraphie 1. Diese Methode erlaubt eine schnelle Vergleiche zwischen unterschiedlichen Routen Zellabgabe, einschließlich intraläsionale, intravenös über die Jugularvene 1 oder regionale Perfusion intraarteriell 12 oder intravenöse 1,12 Injektionen erfolgen. Die Persistenz und die Verteilung der Zellen kann dann durch Gammaszintigraphie verschiedener Organe abgebildet werden. Dies hat gezeigt, dass nur 24% der Zellen injiziert intraläsional in der Läsion nach 24 h 1 geblieben, und dies wird durch eine andere Studie mit experimentell erstellt Läsionen und unter Verwendung des gleichen Radiomarkierung 5 unterstützt. Darüber hinaus zeigen die Zellen begrenzte Fähigkeit, zu Hause, in Sehnen-Verletzungen, wenn deliveredurch regionale Perfusion oder intravenös d sind aber in die Lunge durch die letztgenannten Routen 4 dispergiert. BMMSC mit Eisen-Nanopartikeln markiert ist eine alternative Methode, um Zellen in forelimb Sehnen 13 implantiert zu verfolgen. Obwohl Eisennanopartikel markierten Zellen zu ermöglichen Zellverfolgung in vivo MRI werden zeitliche Studien in einem großen Tier durch die Anzahl der Male Anästhesie zu jedem Zeitpunkt für die Durchführung der MRT verabreicht werden begrenzt. Darüber hinaus sind Eisennanopartikel hypointensen auf MRI, die die Informationen über die Migration von markierten Zellen in die Sehne Körper einschränkt. Andere Radioisotope, die verwendet werden können, sind Indium-111, aber dies hat den Nachteil einer längeren Halbwertszeit als Tc-99m (2,8 Tagen vs 6,0 h) und höhere Gammastrahlenemission Energie. Zusätzlich wurde die Lebensfähigkeit der Zellen wurde berichtet, reduziert werden, wenn mit Indium-111 14 gekennzeichnet. Tc-99m, auf der anderen Seite, wird routinemäßig in sowohl equine und Humankern verwendetArzneimittel zur peripheren mononukleären Blutzellen zu markieren und folgen ihrer Verteilung in vivo durch Szintigraphie. Es lassen sich relativ leicht von den Zellen unter Verwendung HMPAO als Linkermolekül, um das Technetium zu binden, genommen zu werden, wie Tc-99m-HMPAO zu den Zellen. Tc-99m-markierten HMPAO BMMSC zeigen eine gute Lebensfähigkeit und können in vitro 4 vermehren. Dieses Protokoll beschreibt die Kennzeichnung und Verfolgung von Pferde-autologe BMMSC in natürlich vorkommende Läsionen in der Vordergliedmaße SDFT implantiert. Es ist wichtig zu beachten, daß das Protokoll nur soll als Forschungswerkzeug verwendet werden. Seine Verwendung als klinische therapeutische Modalität wird nicht die Wirkung der Radiomarkierung auf zelluläre Phänotyp, nicht vollständig aufgeklärt worden empfohlen.

<table><tbody><tr><td>Technetium99m&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Bitte erkundigen Sie sich bei dem lokalen Ionisationsstrahlenlieferanten nach den gesetzlichen Vorgaben. Das Isotop muss innerhalb von 2 Stunden nach der Elution aus dem Molybdän-99-Generator</td></tr><tr><td>Ceretec - Hexamethylpropylenaminoxim (HMPAO)</td> verwendet werden.<td>GE HealthCare</td><td></td><td>Bitte fragen Sie direkt an GE HealthCare</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge, Minispin/Minispin Plus</td><td>Ependorf</td><td>22620100</td><td></td></tr><tr><td>18 g und 19 g Nadeln</td><td>Terumo Medical</td><td>NN-1838R (18 G); &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NN1938R (19 g)</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen 1 ml und 2 ml</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml)</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 ml</td><td>Greiner Bio-One Ltd</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>LifeTechnologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Mulltupfer</td><td>Shermond Ltd</td><td>UNG602</td><td></td></tr><tr><td>CoflexVet selbstklebende</td><td>Bandage Andover Healthcare, Inc.</td><td>3540RB-018</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschall-Bildgebungssoftware</td><td>Scion Image, Scion Corporation, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicasXplus Software zur Verarbeitung von Scintigrammen</td><td>Bartec Technologies Ltd</td><td></td><td>http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html</td></tr><tr><td>Feldisotopenzähler zur Überwachung von Isotopen</td><td>John Caunt UK</td><td>GMS1800a</td><td>http://www.johncaunt.com/</td></tr> <tr><td>Brunnenzähler für Isotopenmessungen, Dosiskalibrator</td><td>Capintec Southern Scientific</td><td>CRC-25R</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vivo-imaging und verfolgung von technetium-99m markierten knochenmark mesenchymale stammzellen in equine tendinopathie

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Jüngste Fortschritte in der Anwendung von Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BMMSC) zur Behandlung von Sehnen- und Bänderverletzungen im Pferde schlage in experimentellen und klinischen Studien verbessert Ergebnismessungen. Obwohl die BMMSC werden in die Sehne Läsion in großer Zahl implantiert (üblicherweise 10 - 20 Millionen Zellen), wird nur eine relativ kleine Anzahl überleben (&lt;10%), obwohl diese für bis zu 5 Monate nach der Implantation fortbestehen. Dies scheint eine allgemeine Beobachtung bei anderen Arten, bei denen BMMSC haben in andere Gewebe implantiert worden, und es ist wichtig, zu verstehen, wenn dieser Verlust auftritt, wie viele überleben die anfängliche Implantationsprozess und ob die Zellen in anderen Organen gelöscht. Verfolgen des Schicksals der Zellen kann durch die radioaktive Markierung BMMSC vor der Implantation, die nicht-invasive in vivo-Abbildung von Zellenposition und Quantifizierung von Zellzahlen können erreicht werden. Dieses Protokoll beschreibt eine Zelle LABÉLIng Verfahren, das Technetium-99m (Tc-99m), und Verfolgung von diesen Zellen nach der Implantation in die verletzten Beugesehnen bei Pferden verwendet. Tc-99m ist ein kurzlebiges (t 1/2 von 6,01 hr) Isotop, das Gammastrahlen emittiert, und kann von Zellen in Gegenwart der lipophilen Verbindung hexamethylpropyleneamine oxim (HMPAO) internalisiert werden. Diese Eigenschaften machen es ideal für den Einsatz in der Nuklearmedizin Kliniken für die Diagnose von vielen verschiedenen Krankheiten. Das Schicksal der markierten Zellen in der Kurzzeit (bis zu 36 h) von Gammaszintigraphie, sowohl die Zahl der Zellen in der Läsion und der Verteilung der Zellen in der Lunge, Schilddrüse und andere Organe erhalten quantifizieren folgen. Diese Technik wird von der Kennzeichnung von Blutleukozyten angepasst und könnte zu Bild implantiert BMMSC in anderen Organen genutzt werden.

Tc-99m-HMPAO Einbau in BMMSs nicht beeinträchtigt ihre Fähigkeit, auf Gewebekulturkunststoff haften und während sie (Abbildung 1) zeigen die Proliferation Fähigkeit, Monoschichten bilden, haben wir noch nicht vollständig bestimmt, ob Proliferationsraten oder anderen zellulären Phänotypen betroffen sind. Ihrer Morphologie ähnelt unmarkierten Zellen mit einer typischen Spindelform. Das zellulare Markierungseffizienz (dh., Die Aufnahme von Label) variiert typischerweise von etwa 1,5% bis 25%. Der ...

Dieses Protokoll beschreibt die Radiomarkierung von mesenchymalen Stammzellen von Pferden und deren Implantation in Sehnenverletzungen beim Pferd, um das Zellüberleben und die Gewebeverteilung mittels Gammaszintigraphie zu bestimmen.

In-vivo-Imaging und Verfolgung von Technetium-99m markierten Knochenmark mesenchymale Stammzellen in Equine Tendinopathie

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Verteilung und das Schicksal markierter mesenchymaler Knochenmarkstammzellen nach ihrer Injektion mithilfe der Gammaskintigraphie nichtinvasiv zu verfolgen. Das Schicksal der Stammzellen nach der Injektion ist bislang nur unzureichend verstanden. Die wichtigsten Vorteile dieser Methode liegen darin, dass die Stammzellen nach der Applikation nichtinvasiv in mehreren Organen verfolgt werden können und dass die kurze Halbwertszeit des A osteo einen vollständigen Abbau innerhalb von 48 Stunden gewährleistet.Obwohl dies Einblicke in die Verwendung von Stammzellen bei der Therapie natürlicher Tendinopathien ermöglicht hat, könnte es auch zur Untersuchung von Therapien bei Knochen- und Herzerkrankungen genutzt werden. Im Allgemeinen bestehen die Herausforderungen für Personen, die neu in dieser Methode sind, in der Koordination der Zellen und der Vorbereitung der Markierung sowie der Einrichtung des Patienten. Um die Zellen unverzüglich anzuwenden, tragen Sie zunächst akustisches Koppelgel auf das rasierte Gliedmaßenareal auf und verwenden Sie einen linearen Wandler, um systematisch die gesamte palmare Metakarpalregion zu scannen, um serielle Quer- und Längsschnittdarstellungen zu erhalten, um die Zone mit dem maximalen Verletzungsausmaß zu identifizieren.Nach der Verabreichung eines Lokalanästhetikums die Implantationsstelle mindestens fünf Minuten lang mit einer chirurgischen Chlorhexidin-Lösung abwaschen und anschließend mit einem mit Ethanol getränkten Tupfer abwischen. Zunächst Handschuhe anziehen, sobald das Tier präpariert ist, und eine Portion von 1 × 10⁷ Zellen des Knochenmark-Mesenchymalen Stromazells (BM-MSC) in einem Milliliter Knochenmark-Überstand durch Zentrifugation pelletieren. Danach den Überstand mit einer 2-Milliliter-Spritze, ausgestattet mit einer Nadel der Größe 18 oder 19, abziehen, wobei etwa 100 Mikroliter Lösung im Reagenzglas verbleiben.Überführen Sie das Überstand in ein Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig durch leichtes Schwenken im verbleibenden 100 µL Überstand. Achten Sie darauf, dass die Zellen vollständig resuspendiert sind und keine sichtbaren Gewebeklumpen vorhanden sind. Anschließend lassen Sie die Zellen bei Raumtemperatur stehen.Nun mischen Sie ein Milliliter des Technetium-Protec-Nutats in ein Gefäß mit H-M-P-A-O. Nach fünf Minuten behandeln Sie die mesenchymalen Stammzellen mit einer Ein-Milliliter-Spritze und Nadel mit dem gesamten Aliquot des TECHNETIUM-99m-H-M-P-A-O. Danach verschließen Sie das Röhrchen, mischen die Zellen durch vorsichtiges Antippen und stellen das Röhrchen hinter einer Bleiabschirmung bei Raumtemperatur ab. Nach 30 Minuten öffnen Sie das Röhrchen mit einer Pinzette und geben mithilfe einer Milliliterspritze mit einer 21-Gauge-Nadel ein Milliliter PBS zu den Zellen hinzu. Verschließen Sie das Röhrchen erneut und mischen Sie die Zellen. Zentrifugieren Sie danach die Zellen und übertragen Sie das Überstandsvolumen vorsichtig mit der Zweimilliliterspritze in ein entsprechend gekennzeichnetes, abgeschirmtes Röhrchen, das als „Wash 1“ beschriftet ist.Waschen Sie das Pellet anschließend wie eben gezeigt in einem weiteren Milliliter PBS. Überführen Sie die zweite Waschung nach dem zweiten Waschschritt in das entsprechende abgeschirmte Reagenzglas, das mit W2 beschriftet ist. Resuspendieren Sie die Zellen gründlich in dem verbleibenden PBS und geben Sie die Aliquote des eiskalten Knochenmark-Überstandes hinzu, wobei Sie den Transduktor parallel zur Nadel halten.Führen Sie eine 1,5 oder zwei Zoll lange Nadel mit 20 Gauge langsam in die Mitte der Läsion in longitudinaler Ausrichtung in die Zone mit dem maximalen Verletzungsgrad ein. Aspirieren Sie anschließend unter Verwendung der geeigneten Abschirmung die Zellen in eine 2-Milliliter-Luer-Lock-Spritze, die mit einer 20-Gauge-Nadel ausgestattet ist, und entsorgen Sie die Nadel, wobei darauf geachtet werden muss, dass keine Flüssigkeit verloren geht. Nachdem die Spritze an die zuvor platzierte Nadel in der Sehne angeschlossen wurde, positionieren Sie den Ultraschallkopf unter der Nadel, sodass die Nadelspur im Gewebe deutlich sichtbar ist, und injizieren Sie die Zellen langsam, aber gleichmäßig in die Läsion.Überprüfen Sie, ob die in die Läsion eingespritzte Flüssigkeit im Ultraschallbild als koische Flüssigkeit mit hyperechogenen Luftblasen sichtbar ist. Sobald alle Zellen verabreicht wurden, ziehen Sie die Nadel zurück. Verwenden Sie im Verarbeitungssoftware die Auswahl „Studie erfassen“ und die Option „Knochen statisch“, um jeweils 60 Sekunden lang statische Bilder aufzuzeichnen. Danach erhalten Sie laterale Aufnahmen des Läsionsgebiets, vom Karpus bis zum distalen Extrem, des entsprechenden Bereichs der kontralateralen Extremität, des linken Lungenfelds und der linken Schilddrüse zu den angegebenen Zeitpunkten.Danach wählen Sie den Bereich von Interesse und die Ellipsen-Werkzeuge aus und passen die Auswahlmaske entsprechend über dem Läsionsbereich an. Wählen Sie abschließend die Option „Zwei Statistiken hinzufügen“, um die Anzahlen für den Bereich von Interesse zu erhalten. Achten Sie darauf, dass für jedes Tier zu den verschiedenen Zeitpunkten identisch große Bereiche von Interesse aufgezeichnet werden.Nach der intralesionalen Applikation werden die Zellen als fokaler Signalbereich beobachtet, wobei sich im Zeitverlauf eine begrenzte Ausbreitung der Zellen in das umgebende Sehnengewebe zeigt. Im Gegensatz dazu tritt bei der regionalen Perfusion über die digitale Palmarvene eine allmähliche Verringerung des Signals am Injektionsort auf. Im Zeitverlauf sind die Lungenfelder nach intralesionaler Injektion gewöhnlich negativ, jedoch können zu frühen Zeitpunkten gelegentlich sehr fokale Signale detektiert werden, die sich im Verlauf verallgemeinern.Die Schilddrüse bleibt auch bei dieser Applikationsroute negativ. Die regionale Perfusion zeigt außerdem ein fokales Signal in den Lungen, das im Verlauf diffuser wird, wobei das Signal im Vergleich zur intralesionellen Applikationsroute deutlich intensiver ist. Da auch die Schilddrüse häufig ein fokales Signal aufweist, erfolgt die Erfassung der Gesamtanzahl der Radioisotope in den Zellen zum Zeitpunkt null vor der Injektion sowie der Zählraten aus dem initialen Gammagramm in der interessierenden Region.Zum Zeitpunkt null nach der Injektion können die Anfangswerte verwendet werden, um den prozentualen Rückgang der Zählwerte zu jedem Zeitpunkt nach der Injektion zu berechnen und so den vorhergesagten Zerfall des TC 99 M anhand der Anfangszählwerte zu bestimmen. Die Verweildauer der Zellen, die sich nach der Injektion an der Injektionsstelle befinden, kann dann ebenfalls für jeden Zeitpunkt berechnet werden. Mit dieser Methode können auch andere Applikationswege der Zellverabreichung angewandt werden, um weitere Fragen zur Homing-Fähigkeit der mesenchymalen Stammzellen nach deren Entwicklung zu beantworten.Diese Technik hat für Forscher auf dem Gebiet der regionalen Medizin den Weg geebnet, Methoden zur Verbesserung der Zellretention innerhalb von Sehnenverletzungen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Zellen markiert und ihre Verteilung sowie Konzentration in verschiedenen Organsystemen erfasst werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit ionisierender Strahlung äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie persönliche Schutzausrüstung, Strahlungsmonitore, Abschirmung mit Blei sowie die ordnungsgemäße Entsorgung kontaminierten Abfalls während dieses Verfahrens unerlässlich sind.

in-vivo-imaging-tracking-technetium-99m-labeled-bone-marrow

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Tracking-Dynamics of Muscle Engraftment bei Kleintieren durch In Vivo Fluorescent Imaging

Ein experimentelles Mausmodell von Knochenmetastasen wurde nach intrakardialen Lieferung von Luciferase exprimierenden Mammatumorzellen gegründet. Tumorentstehung und führte Osteolyse wurden in Längsrichtung mit Biolumineszenz-und Mikro-CT-Bildgebung überwacht.

Überwachung Tumormetastasen und Osteolysen mit Biolumineszenz und Micro-CT Imaging

Quantitative Messung der Knochenvorläuferfunktion in Frakturheilung erfordert hohe Auflösung Serienbildtechnologie. Hier werden Protokolle für die Verwendung von Intravitalmikroskopie und Osteo-Linie Tracking Bild sequentiell und Quantifizierung der Migration, Proliferation und Differenzierung der knochenbild endogene Stammzellen / Vorläuferzellen in den Prozess der Reparatur von Knochenbrüchen vorgesehen ist.

Sequentiell<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Die Art der Wechselwirkung zwischen hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) und Knochenmark Nischen schlecht verstanden. Kundenspezifische Hardware-Modifikationen und eine mehrstufige Akquisitionsprotokoll ermöglichen den Einsatz von Zwei-Photonen-Mikroskopie und konfokaler Bild ex vivo markierten HSPCs innerhalb des Knochenmarks Bereichen referenziert, Tracking-Wechselwirkungen und Bewegung.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Monozyten sind Schlüsselregulatoren der angeborenen Immunität und spielen eine entscheidende Rolle bei der Erneuerung des peripheren mononukleären phagozytischen Systems und im Falle von Entzündungen. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren der Echtzeit-Bildgebung des Schädeldachknochenmarks der Maus, um den Mobilisierungsmechanismus der Monozyten zu untersuchen.

Tracking-Maus-Knochenmark-Monozyten<em&gt; In-vivo-</em

Das Protokoll beschreibt ein neuartiges Maus-Femur-Fensterkammermodell, das verwendet werden kann, um die Bewegung von Zellen im femoralen Knochenmark in vivo zu verfolgen. Die Intravital-Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um drei Komponenten des femoralen Knochenmarks (Gefäße, Kollagenmatrix und Neutrophile) im Zeitverlauf abzubilden.

Femur Fensterkammer Modell für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zelltracking im Knochenmark der Maus

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Möglichkeit zur Überwachung der Zelle Persistenz und Bioverteilung des menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen (HaMSCs) durch dunkelrote Fluoreszenz Kennzeichnung in einem Rattenmodell Knie Arthrose (KOA) durch intraartikuläre Injektion (IA).

In Vivo Tracking der menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen in einem Rattenmodell Knie Arthrose mit fluoreszierenden lipophile Membran Farbstoff

Hier verwenden wir Biolumineszenz, Röntgen und Positronen-Emissions-Tomographie/berechnet Tomographie Bildgebung wie hemmende mTOR-Aktivität zu studieren Auswirkungen des Knochenmarks pfropfte Myelom Tumoren in einem Xenograft-Modell. Dies ermöglicht eine physiologisch relevante, nicht-invasive und multimodalen Analysen der Anti-Myelom-Wirkung von Therapien gezielt Knochenmark pfropfte Myelom Tumoren in Vivo.

Multimodale Biolumineszenz und Positronic-Emissions-Tomographie/Computational Tomographie Bildgebung des multiplen Myeloms Knochenmark Xenotransplantate NOG Mäuse

Hier wird ein Protokoll zur nicht-invasiven mesenchymalen Stammzell-Entbindung (MSC) und Tracking in einem Mausmodell traumatischer Hirnverletzungen vorgestellt. Superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel werden als Magnetresonanztomographie (MRT) für die MSC-Kennzeichnung und nicht-invasive in vivo-Tracking nach intranasaler Abgabe mittels Echtzeit-MRT eingesetzt.

Verfolgung von superparamagnetischen Eisenoxid-beschrifteten mesenchymalen Stammzellen mit MRT nach intranasaler Lieferung in einem traumatischen Hirnverletzungs-Murine-Modell

Dieses Protokoll beschreibt den Nachweis der CCL5-vermittelten periostalen Skelettstammzellmigration in Echtzeit mittels lebender tierexperimenteller Mikroskopie.

Echtzeit-Bildgebung der CCL5-induzierten Migration von periostalen Skelettstammzellen in Mäusen

Lokale Injektionen einer mitochondrialen Farbstoffbeschriftung terminaler Schwann-Zellmitochondrien in vivo zur konfokalen Mikroskopie. Diese Methode nutzt einen Proof of Concept, der im Skelettgewebe von Mäusen mit gesunden oder kranken Muskeln demonstriert wurde, um eine hochauflösende mitochondriale Visualisierung zu ermöglichen.

Methoden zur In-situ-Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie in Muskel- und terminalen Schwannzellen von Mäusen

Erfahren Sie die nicht-invasive Gamma-Szintigraphie zur Verfolgung von Technetium-99m markierten Knochenmark-Mesenchymstammzellen bei Equine Tendinopathie. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Zellüberleben und Gewebeverteilung im Laufe der Zeit.

In-vivo-Imaging und Verfolgung von Technetium-99m markierten Knochenmark mesenchymale Stammzellen in Equine Tendinopathie

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