Nachweis von krankheitsassoziierten α-Synuclein durch verbesserte ELISA im Gehirn von transgenen Mäusen Expression Menschen A53T Mutierte α-Synuclein

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Ansammlung des mit der Krankheit assoziierten Alpha-Synucleins in einem transgenen Mausmodell der Parkinson-Krankheit mithilfe eines quantitativen Eliza-Ansatzes zu überwachen. Dies wird erreicht, indem man zunächst nicht inokulierten Mäusen erlaubt, normal zu altern, oder indem Mäuse intrazerebral mit einem Hirnextrakt aus kranken M 83 inokuliert werden. Nachdem die Mäuse klinische Krankheit entwickelt haben und getötet wurden, werden Hirnregionen der Mäuse seziert.

Als Nächstes werden aus jeder Hirnregion Homogenate in hochsalzigem Puffer hergestellt und Eliza an den Homogenaten durchgeführt, um das mit der Krankheit assoziierte Alpha-Synuclein in jeder Hirnregion zu quantifizieren. Die Eliza-Ergebnisse zeigen, dass sich die krankhafte Form des Alpha-Synuclein-Proteins hauptsächlich in den Coddle-Hirnregionen, einschließlich des Mesencephalon und des Hirnstamms, sowie in den Rückenmarken der Mäuse anreichert. Der Hauptvorteil dieser Eliza-Technik im Vergleich zu zuvor verfügbaren Methoden wie Western Blot oder Immunhistochemie besteht darin, dass sie eine schnelle und zuverlässige Quantifizierung des mit der Krankheit assoziierten Alpha-Synucleins ermöglicht.

In diesem experimentellen Modell kann diese Methode helfen, die Ansammlung und Ausbreitung dieses Proteins im zentralen Nervensystem dieser MA drei Mäuse zu überwachen. Dies deutet auf eine Beteiligung eines Gehirn-ähnlichen Mechanismus bis zur Entwicklung der klinischen Wissenschaft hin. Weiterentwicklungen dieser Methode könnten in Zukunft für die Untersuchung verschiedener biologischer Proben wie Liquor cerebrospinalis oder Blut in Betracht gezogen werden, die möglicherweise auch veränderte Alpha-Formen enthalten, was zeigt, dass dieses Verfahren von einem Techniker aus unserem Labor durchgeführt wird.

Alle Prozeduren und Protokolle, die Tiere betreffen, entsprachen der EG-Richtlinie 86 6 0 9 EEC und wurden vom französischen Nationalkomitee für Ethik und Tierexperimente ratifiziert. Zur Berücksichtigung der Ethik und Tierexperimente wurden die Tiere in von A und S'S zugelassenen Experimentiereinrichtungen in Leon Young nach der Euthanasie der Mäuse und dem Entfernen von Gehirn und Rückenmark untergebracht und gepflegt. Gemäß dem Textprotokoll wird ein ganzes Gehirn in einer Petrischale auf Eis unter geringer Vergrößerung platziert.

Beginnen Sie damit, eines der beiden Riechkolben zu trennen, indem Sie eine Pinzette direkt hinter dem Bulbus platzieren. Mit einer abwärts gerichteten Bewegung lösen Sie ihn vom Gehirn und entfernen dann den zweiten Bulbus auf ähnliche Weise. Während Sie nun mit einer Pinzette das Gehirn an Ort und Stelle halten, schieben Sie vorsichtig ein zweites Paar Pinzetten zwischen die linke und rechte Rinde und bewegen sie nach vorne, um die beiden Hälften zu trennen.

Halten Sie nun weiterhin das Gehirn an Ort und Stelle. Positionieren Sie die zweite Pinzette zwei Millimeter hinter der Rinde und halten Sie den Druck nach oben, um die Rinde von der Hippocampus abzuheben. Entfernen Sie dann den ersten Teil der Rinde, indem Sie am Hippocampus beginnen und sich zur Vorderseite des Gehirns bewegen.

Wiederholen Sie dies mit der zweiten Hälfte. Positionieren Sie die offene Pinzette dann um einen der Hippocampi. Schließen Sie dann vorsichtig die Pinzette am unteren Ende des Organs und entfernen Sie es vorsichtig.

Wiederholen Sie dies mit dem zweiten Hippocampus. Positionieren Sie die Pinzette hinter einem der Stria und trennen Sie ihn vorsichtig vom Gehirn. Verwenden Sie die Pinzette, um den verbleibenden Cortex vom Striatum zu entfernen, bevor Sie den zweiten Stria entfernen, um das Kleinhirn vom Rest des Gehirns zu trennen. Drücken Sie vorsichtig das Umriss des Kleinhirns.

Platzieren Sie dann die Pinzette hinter dem Kleinhirn und bewegen Sie die Pinzette nach vorne, um es zu entfernen, wobei Sie den breiten Teil der Pinzetten verwenden, um sie als Cephaloon anzuheben, der aus vier runden Strukturen besteht, um deutlich zu sehen, wo es sich dem Hirnstamm anschließt. Machen Sie dann einen vertikalen Schnitt an der Verbindung, bevor Sie den Hirnstamm entfernen. Positionieren Sie die Pinzette hinter dem Mesencephalon und heben Sie sie in der Größe vertikal an, um es vollständig vom restlichen Gehirn zu trennen. Um das Gehirn homogen zuzubereiten, fügen Sie ein angemessenes Volumen an HS-Puffer zu den sezierten Gehirnregionen hinzu, um einen erwarteten Prozentsatz des Homogenats zu erreichen, wie in der folgenden Tabelle gezeigt.

Verwenden Sie einen Gewebezerkleinerer, der aus einem silikathaltigen Glasrohr und den Rohrschälern A und B besteht. Gießen Sie eine zu zerkleinerde Hirnregion in das Rohr. Homogenisieren Sie dann das Gewebe 10 Mal mit dem Schäler A, um es zu dissoziieren. Wechseln Sie dann zu Schäler B und homogenisieren Sie zusätzlich 20 Mal.

Übertragen Sie das Homogenat mit einer Transferpipette in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und wiederholen Sie die Homogenisierung mit den restlichen Hirnproben. Zentrifugieren Sie die Proben 1000 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entnehmen Sie dann den Überstand und teilen Sie ihn in 200 Mikroliter Ali Watts auf. Bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis die Eliza-Analyse durchgeführt wird, um Eliza an Gehirnhomogenat durchzuführen.

Beginnen Sie damit, 50 Mikromolar Carbonatenpuffer zu verwenden, um den Beschichtungs-Anti-Alpha-Synuclein-Antikörper, Kaninchenpolyklonal oder monoklonal Clone 42, auf 0,01 Nanogramm pro Milliliter mit 100 Mikroliter der Antikörper-Beschichtungslösung zu verdünnen. Beschichten Sie die 96-Well-Mikroplatten mit der Antikörper-Beschichtungslösung und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Fügen Sie 300 Mikroliter PBST zu den Wells hinzu und verwenden Sie einen Plattenwaschgerät, um die Platten fünfmal bei Raumtemperatur zu waschen.

Fügen Sie als Nächstes 200 Mikroliter T 20 PBS-Blockierungspuffer zu jedem Well hinzu und schütteln Sie die Platten bei 150 U/min für eine Stunde, bevor Sie PBST verwenden, um die Platten fünfmal zu waschen. Dilutieren Sie das Gehirnhomogenat gemäß den hier aufgeführten Richtlinien und fügen Sie 100 Mikroliter zu jedem Well hinzu. Inkubieren Sie dann bei Raumtemperatur und 150 U/min für zwei Stunden, bevor Sie PBST verwenden, um die Platten zu waschen. Fügen Sie nach dem letzten Waschen die notwendigen Alpha-Synuclein-Detektionsantikörper hinzu, die gemäß Tabelle 2 des Textprotokolls in PBS BST und 1%BSA verdünnt sind, und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur und 150 U/min für eine Stunde, bevor Sie die Platten fünfmal wie zuvor waschen.

Fügen Sie als Nächstes entweder Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugate hinzu, die auf eins zu 8000 in PBST 1%BSA verdünnt sind, und inkubieren Sie sie bei 150 U/min für eine Stunde, bevor Sie die Platten fünfmal waschen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter TMB-Lösung zu jedem Well hinzu und inkubieren Sie sie bei 150 U/min für 15 Minuten im Dunkeln. Stoppen Sie die Reaktion durch Hinzufügen von 100 Mikroliter eins normaler Salzsäure pro Well.

Verwenden Sie dann einen Mikroplattenleser, um die Absorption bei 450 Nanometern für die Datenanalyse zu messen. Subtrahieren Sie den optischen Dichtewert, der im leeren Well erhalten wurde, das nur Puffer und Reagenzien enthält, von der optischen Dichte.

Die aus Hirnproben gewonnenen Werte wurden gemäß dem Textprotokoll in dieser Studie statistisch analysiert. Die Elizas identifizierten speziell das mit der Krankheit assoziierte pser 1 29 Alpha-Synuclein in Gehirnhomogenaten von alten kranken M 83. Mäuse waren bei jungen M 83-Mäusen nicht vorhanden. Zusätzlich getestete Antikörper wie LB 5 0 9 zeigten starke Signale bei kranken, aber nicht bei gesunden Mäusen.

Die analytische Empfindlichkeit des in diesem Video beschriebenen ELIZA wurde mit einer zuvor beschriebenen Western-Blot-Methode verglichen. Etwa 10 Mikrogramm Gehirnäquivalente waren ausreichend, um ein positives P oder