Name: Nachweis von krankheitsassoziierten α-Synuclein durch verbesserte ELISA im Gehirn von transgenen Mäusen Expression Menschen A53T Mutierte α-Synuclein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Erfahren Sie, wie man krankheitsassoziiertes α-Synuclein in transgenen Mäusen mittels verbesserter ELISA quantifiziert. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Analyse von Proteinakkumulation in verschiedenen Gehirnregionen.

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Die Autoren bedanken sich bei Damien Gaillard für Impfungen danken und Follow-up von Tierversuchen. Diese Arbeit wurde von ANSES (Französisch Agentur für Lebensmittel, Umwelt- und Arbeitsschutz) und durch einen Zuschuss von der Stiftung France Parkinson unterstützt.

Alle Verfahren und Protokolle mit Tieren waren nach EG-Richtlinie 86/609 / EWG und nach kommt, der Französisch Nationalkomitee für die Prüfung der Ethik in der Tierversuche (Protokoll 11-0043) ratifiziert. Die Tiere wurden untergebracht und versorgt in ANSES genehmigt Versuchsanlagen in Lyon (Genehmigung B 69387 0801). 1. Herstellung der Mäuse <ol><li> Euthanize Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von letalen Dosis von Natrium-Pentobarbital. </li><li> Rufen Sie die gesamte Gehirn aus dem Schädel der Maus und legen Sie sie in einem 35 mm Kunststoff-Petrischale auf Eis bis zur Extraktion. </li><li> Extrahieren Sie das Halsmark. HINWEIS: Extract aS entweder von einem der Gehirnhälften nach sagittalen Schnitte oder seziert Gehirn der Maus, erhältlich nach den in Tabelle 1 aufgeführten Experimente. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Experiment </td><td> Mice Inokulum (Hirn-Äquivalent) </td><td> Überlebenszeit (Dpi) </td><td> Median / maximale Überlebens (Tage alt) </td><td> aS d Nachweis durch ELISA / WB / IHC </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Ungeimpften Mäusen </td><td> 441 ± 166 </td><td> 419/736 </td><td> 8/8 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Inokulierten Mäusen (0,2 mg) </td><td> 150 ± 52 </td><td> 140/241 </td><td> 9/9 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Liste der Experimente an M83 Mäusen durchgeführt. Die Impfungen wurden nach 6 Wochen bei Versuch 2 im striato kortikalen Bereich mit 20 ul eines Gehirnhomogenisat eines kranken Maus (1% G / V in 5% Glucose) nach durchgeführt wird, Anästhesie von 6 Wochen alt homozygote Mäuse M83 um 3% Isofluran Einatmen. dpi: Tage nach inoculation. 2. aS Extraktion von Gehirnhälften <ol><li> Sagittal geschnitten das Gehirn zwei Hälften zu erhalten. Wiegen Sie jede Hälfte in einem ribolysis Röhrchen mit Mahlkugeln. </li><li> Vorbereitung High Salt (HS) Puffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 750 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% Phosphatase und Protease-Inhibitor-Cocktails. Hinzuzufügen Hochsalzpuffer zu den Gehirnhälften bis 20% (Gewicht / Volumen) Homogenate erhalten. </li><li> Vorbereitung der Proben aus den Gehirnhälften unter Verwendung eines mechanischen Homogenisators bei 6,0 m / s für 23 s zweimal. Nach der ersten 23 sec Homogenisierung, legen Sie die Röhrchen mit den Homogenaten auf Eis für 2 min vor der zweiten 23-sec-Zyklus. </li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 1000 × g für 5 min auf ungeschliffenen Gehirnteilen zu beseitigen. Wiederherstellen der Überstände, teilen sich in 200 ul Aliquots und halten sie bei -80 ° C für die anschließende ELISA-Analyse. </li></ol> 3. aS Extraktion aus Dissected Hirnregionen <ol><li> Sezieren eingesamte Gehirn in einem 35 mm Kunststoff-Petrischale auf Eis mit einem geringen Stromlupe (8-fache Vergrößerung) mit Hilfe von zwei forcipes deren Enden zusammen, außer wenn der Zerlegung des Hippocampus gehalten. 10 Minuten dürfen nicht überschritten werden, um Gehirn Integrität zu bewahren. Legen Sie das Gehirn wieder richtig herum und rufen Sie die folgende Gehirnregionen in dieser Reihenfolge: <ol><li> Getrennten der zwei Riechkolben mit einer Pinzette gerade hinter der Lampe angeordnet. Nehmen Sie es aus dem Gehirn durch eine Abwärtsbewegung. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite Lampe. </li><li> Gently Keil in die Zange zwischen den beiden Cortex und verschieben Sie es nach vorne, um die Dissoziation der beiden Cortex erleichtern. Halten das Gehirn in Platz mit einer Pinzette, verwenden Sie eine andere, um die Rinde aus dem Hippocampus zu trennen. </li><li> Positionieren Sie die Pinzette 2 mm unterhalb der Hirnrinde. Aufrechterhaltung eines leichten Druck an der Zange, bis die Oberseite des Hippokampus sichtbar ist. Ziehen Sie weg der erste Teil des Kortex, und wiederholen Sie mit dem zweiten Teil. Verwenden Sie die Pinzette, um die beiden zu trennen Cortexab Hippocampus und Bewegung in Richtung der Vorderseite des Gehirns. </li><li> Positionieren Sie die offene Zange um einen der hippocampi. Schließen Sie die Zange an der Unterseite des Hippocampus dann nehmen Sie es vorsichtig, Wiederherstellung so weit wie möglich. Wiederholen Sie den Vorgang für die zweite Hippocampus. </li><li> Positionieren Sie die offene Zange unterhalb einer der striata und sanft trennen sie vom Gehirn. Verwenden Sie die Pinzette, um alle verbleibenden Kortex aus dem Striatum zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite Striatum. </li><li> Mithilfe der Pinzette vorsichtig betätigen um 2 mm die Kontur des Kleinhirns, um eine Trennung des Kleinhirns aus dem Gehirn zu erleichtern. Legen Sie die Pinzette gerade hinter dem Kleinhirn und entfernen Sie sie, indem Sie die Pinzette nach vorn. </li><li> Verwenden Sie den breiten Teil der Zange, um das Mittelhirn, um zu erhöhen, klar zu sehen, wo es den Hirnstamm verbindet. Stellen Sie eine vertikale Inzision an der Kreuzung entfernen Sie dann die Hirnstamm. </li><li> Positionieren Sie die Zange hinter dem Mittelhirn, die ichs von vier abgerundeten Strukturen. Einzuschneiden vertikal, bis der Mittelhirn wurde vollständig vom übrigen Gehirn abgetrennt. </li></ol></li><li> Vorbereitung Homogenaten variable% (Gewicht / Volumen) in HS Puffer, abhängig von der Menge des verfügbaren Geweben, also 5% Homogenat für ein Gewicht zwischen 10 und 30 mg, 10% für ein Gewicht zwischen 30 und 80 mg, 20% für ein Gewicht von über 80 mg. <ol><li> Fügen Sie ein ausreichendes Volumen von HS-Puffer zu den seziert Hirnregionen, um die erwartete% Homogenat zu erhalten. </li><li> Vortex und überprüfen Sie, dass die Gewebe sind vollständig in der HS-Puffer eingetaucht. </li><li> Homogenisieren Proben aus den seziert Hirnregionen oder Halsmark mit einer Gewebemühle aus einem Borosilikatglas Rohr und zwei Stößel, A und B zusammengesetzt ist vorbereitet </li><li> Pour jede Gehirnregion, direkt in das Rohr gequetscht werden. Legen Stößel A in das Rohr und zurückgezogen werden. Wiederholen Sie diese Bewegung etwa zehnmal, um das Gewebe zu distanzieren. Dann nutzen Stößel B um continue Mahlen des Gewebes mit weiteren 20 Bewegungen. Übertragen Sie die Homogenate in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml Transferpipette. </li></ol></li><li> Zentrifugieren Sie die Probe bei 1000 × g für 5 min bei 4 ° C, um alle ungemahlenen Gehirnteilen zu beseitigen. Rufen Sie die Überstände, unterteilen Sie diese in 200 ul Aliquots und halten sie bei -80 ° C für die anschließende ELISA-Analyse. </li></ol> 4. Erkennung von aS durch ELISA <ol><li> Verdünnt den Beschichtungsantikörper zu 0,01 ng / ml. Entweder anti-aS Kaninchen polyklonale oder monoklonale Antikörper Klon 42 in 50 mM Na 2 CO 3 / NaHCO 3 (pH 9,6). </li><li> Bestreichen Sie die 96-Well-Mikroplatten mit 100 ul pro Vertiefung dieser Beschichtungslösung, und lassen Sie bei 4 ° CO / N. Verwenden Sie die Anti-aS polyklonalen Kaninchen-Antikörper, der in der Beschichtungslösung für ELISAs mit Detektionsantikörper syn514, Klon 42, LB509, AS11, 4D6 oder 8A5. Verwenden des Anti aS monoklonale Antikörper Klon 42 als Beschichtungslösungin Kombination mit der anti-pSer129 aS Nachweisantikörper. HINWEIS: Wenn nötig, können die Platten bei 4 ° C für eine Woche vor dem ELISA aufbewahrt werden ausgeführt. </li><li> Verwenden Sie einen Plattenwäscher, um die Platten fünfmal mit 300 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween 20 (PBST) pro Vertiefung waschen. Von diesem Schritt an ist Inkubation bei RT. </li><li> Fügen Sie 200 ul PBS T20 Blockierungspuffer pro Vertiefung. Es wird 1 h bei 150 Upm. Fünfmal mit PBST, waschen. </li><li> Verdünnen Sie die Hirnhomogenaten (Verdünnung 1: 100 der 20% Homogenate, 1.50 der 10% Homogenate und 1.25 der 5% Homogenate in PBST BSA 1%), und fügen Sie 100 ul in jede Vertiefung. Dann inkubieren für 2 Stunden unter Schütteln bei 150 Umdrehungen pro Minute. Fünfmal mit PBST, waschen. </li><li> Fügen Sie die verschiedenen aS Nachweis-Antikörper in PBST mit BSA 1% an den in der Materialliste genannten Verdünnungen. Inkubieren für 1 h bei 150 Upm. Fünfmal mit PBST, waschen. </li><li> Fügen Sie entweder Anti-Maus oder Anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugate, verdünnt 1: 8.000 in PBST mit 1% BSA für 1 h ergänzt unter Schütteln bei 150 UpM. Fünfmal mit PBST, waschen. </li><li> 100 l 3,3 &#39;, 5,5&#39;-Tetramethylbenzidin (TMB) in jede Vertiefung und Inkubation für 15 min im Dunkeln unter Schütteln bei 150 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 ul 1 N HCl pro Vertiefung messen Sie dann die Absorption bei 450 nm mit der Mikroplatten-Reader. </li><li> Für die Datenanalyse, subtrahieren Sie die in einem gut mit allen Reagenzien, außer irgend Maus Hirnproben (leere well) aus den für jede der untersuchten Proben gemessenen OD-Werte erhaltenen OD-Wert. </li></ol> 5. Epitopkartierung <ol><li> Zuführen Epitopkartierung nach der von Osman 16 beschriebenen Verfahrens. Kurz gesagt, spot Peptide des menschlichen α-Synuclein-Sequenz mit 12 Aminosäuren auf Nitrocellulose mit 10 überlappenden Aminosäuren. </li><li> Blockieren mit 50 mM Tris / 150 mM NaCl-Puffer pH 10, das 0,05% Tween 20 und 5% Milchpulver. Inkubieren des Antikörpers in der Blockierungslösung bei einer Konzentration von 2 ug Antikörper pro ml bei 2-10 ° CO / N. </li><li> Dreimal mit 50 mM Tris / 150 mM NaCl-Puffer, pH 10, enthaltend 0,05% Tween 20 Inkubation mit Ziege-Anti-Maus-IgG-HRP-Konjugat Waschen der Membran. Die Membran noch fünf Mal mit dem gleichen Puffer dann Fleck mit einem Western-Blot-TMB Färbekit waschen. </li></ol> 6. Statistische Analyse <ol><li> Verwenden Sie die R-Software und nlme Paket zu Mixed-Effects-Regressionen durchführen, um OD modellieren. Für jeden Vergleich, führen Sie eine gemischte Wirkung Regressionsmodell. Verwenden Sie eine feste Wirkung auf eine symptomatische von asymptomatischen Gruppen zu unterscheiden. </li><li> Verwenden Sie ein Zufallseffekt, um die Variabilität der Wiederholungen für eine bestimmte Maus anzupassen. Überprüfen homoscedasticity durch die Untersuchung der Residuen und, wenn nötig, verwenden Sie die Varianz Funktionen, um die Varianz Struktur innerhalb der Gruppe von Fehlern in Einklang mit Pinheiro und Bates 1 zu modellieren7. Legen Sie 0,05 als Signifikanzschwelle von P. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen offenzulegen.

Die Verwendung eines ELISA wurde gezeigt, spezifisch nachzuweisen aS D direkt von Maushirn-Homogenaten bei der Krankheit in den M83 transgenes Mausmodell. In der Tat, könnte dies ohne weiteres zu unterscheiden ELISA kranken Mäusen M83 M83 von gesunden Mäusen mit nur ganze Hirnhomogenaten in Hochsalzpuffer. Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Ergebnisse mit diesen ELISA sind: richtig sezieren die verschiedenen Regionen der Maus-Gehirne von der Entwicklung der notwendigen...

Die meisten aktuellen Methoden zur Erkennung von erkrankungsassoziiertem α-Synuclein (αSD) in experimentellen Modellen der Parkinson-Krankheit (PD), wie Immunhistochemie oder Western Blot, sind zeitaufwendig und nicht quantitativ. Diese neurodegenerative Erkrankung ist durch die Aggregation von Alpha-Synuclein, hauptsächlich in Form von Einschlüssen, die eine aggregierte Form des normalerweise löslichen präsynaptischen Proteins αS1,2 enthalten (Lewy-Körperchen und Lewy-Neuriten), gekennzeichnet. Normalerweise nur marginal phosphoryliert, ist αS in diesen Einschlüssen an seiner Serin-129-Position hyperphosphoryliert3 und kann durch Antikörper überwacht werden, die spezifisch gegen phosphoryliertes αS auf Ser129 gerichtet sind, und bietet so einen zuverlässigen Marker für die Pathologie.
Jüngste Forschungen legen nahe, dass ein "prionenartiger" Mechanismus an der Ausbreitung der αS-Aggregation innerhalb des Nervensystems eines betroffenen Patienten4,5 beteiligt sein könnte. Diese Studien berichteten über die Beschleunigung einer Synucleinopathie durch die Inokulation von Hirnextrakten, die αSD enthielten, in ein transgenes Mausmodell (M83), das ein A53T mutiertes humanes αS-Protein exprimiert, das mit einer schweren motorischen Beeinträchtigung verbunden ist, die bei den Mäusen im Alter auftritt6. In gleicher Weise bestätigte die intrazerebrale Inokulation von aggregiertem rekombinant αS im selben M83-Mausmodell die Beschleunigung der Aggregation5. Die Induktion von Ablagerungen von phosphoryliertem αS wurde auch nach der Inokulation von C57Bl/6 Wildtyp-Mäusen mit entweder fibrillärem rekombinantem αS oder Hirnextrakten von menschlichen DLB-Patienten7,8 berichtet. Sacino et al.9 zeigten kürzlich, dass nach Injektion von fibrillärem humanem αS eine weit verbreitete und progressive zerebrale αS-Einschlussbildung in M83-Mäusen, aber nicht in E46K-transgenen Mäusen oder nicht-transgenen Mäusen induziert werden konnte, bei denen die induzierten αS-Einschlüsse vorübergehend waren und hauptsächlich auf die Injektionsstelle beschränkt blieben. Jüngste Studien an Affen bestätigten die Ausbreitung von αS-Aggregaten nach Inokulation von PD-abgeleiteten Extrakten in Arten, die näher an Menschen stehen10.
Die Verbindung zwischen αS-Veränderungen und der Parkinson-Krankheit legt nahe, dass αSD ein potenzieller Biomarker für die Parkinson-Krankheit ist11. Eine aktuelle Studie zeigte die Erkennung von oligomeren löslichen Aggregaten von α-Synuclein in menschlichem zerebrospinalen Flüssigkeit (CSF) und Plasma als potenziellen Biomarker für die Parkinson-Krankheit basierend auf einem konventionellen Sandwich-ELISA-System mit demselben Antikörper zur Erfassung und zum Nachweis von αS12. Basierend auf derselben Methode wurden multimere Proteine in biologischen Proben, einschließlich des Gehirns, erkannt, da es mehrere Kopien von Epitopen in den zusammengesetzten Formen gibt13. Sehr kürzlich wurde pathologisches αS im CSF von Patienten mit einer nachgewiesenen Lewy-Körperchen-Pathologie mittels eines ELISA-Kits mit einem hochspezifischen Antikörper gegen αSD (5G4) und einem Immunpräzipitations-Assay nachgewiesen14. Diese Methoden könnten Patienten mit PD/DLB von anderen Arten der Demenz unterscheiden.
Die "prionenartige" Ausbreitung der αS-Aggregation wurde in dem transgenen Mausmodell M83 mit einem ELISA-Ansatz weiter untersucht, der speziell entwickelt wurde, um αSD15 zu identifizieren. In dieser Studie berichten wir über das detaillierte ELISA-Protokoll, das verwendet wurde, um αSD quantitativ in kranken Mäusen (ob inokuliert mit αSD von kranken M83-Mäusen oder nicht) und insbesondere in den Hirnregionen nachzuweisen, die speziell von dem pathologischen Prozess in diesem transgenen M83-Mausmodell betroffen sind4.

<table><tbody><tr><td>LB509</td><td>Abcam</td><td>ab27766</td><td>Detection antibody 1/2,000</td></tr><tr><td>AS11</td><td>Gefertigt bei Anses</td><td></td><td>Detection antibody 1/1,000</td></tr><tr><td>4D6</td><td>Abcam</td><td>ab1903</td><td>Detection antibody 1/2,000</td></tr><tr><td>PSer129</td><td>Abcam</td><td>ab59264</td><td>Detection antibody 1/3,000</td></tr><tr><td>PSer129&nbsp;EP1536Y</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td>Detection antibody 1/1,000</td></tr><tr><td>syn514</td><td>Abcam</td><td>ab24717</td><td>Detection antibody 1/500</td></tr><tr><td>clone 42</td><td>BD Biosciences</td><td>610787</td><td>Coating and detection antibody (1/2,000)</td></tr><tr><td>8A5</td><td>Zugehörig von Dr. Anderson</td><td></td><td>Detection antibody 1/2,000</td></tr><tr><td>polyclonal anti-&alpha;syn antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5038P</td><td>Coating antibody</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG HRP conjugate</td><td>Southern Biotech</td><td>1010-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG HRP conjugate</td><td>Southern Biotech</td><td>4010-05</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG HRP conjugate</td><td>Dianova</td><td>115-035-164</td><td></td></tr><tr><td>HS buffer</td><td></td><td></td><td>Adjust at pH 7.5 and keep at 4 &#176;C</td></tr><tr><td><ul>
<li>Tris-HCl 50&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>NaCl 750 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>EDTA 5 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>EU0007-B</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>DTT 1 mM </li>
</ul></td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>Adjust at pH 7.5</td></tr><tr><td><ul>
<li>Na2HPO4 1&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1309</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>KH2PO4 1.5&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>2018</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>NaCl&nbsp; 137 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>KCl 2.7 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>P017</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Euromedex</td><td>2001-C</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>DTT 1 mM</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Stock solution 100 mM, toxic</td></tr><tr><td>1% phosphatase cocktail</td><td>Pierce</td><td>78428</td><td></td></tr><tr><td>1% protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>04&nbsp;693&nbsp;132&nbsp;001</td><td>50x concentrated</td></tr><tr><td>Microplate MaxiSorpTM</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tampon carbonate 50 mM pH 9.6</td></tr><tr><td><ul>
<li>Na2CO3, 10H2O </li>
</ul></td><td>Sigma</td><td>71360</td><td>2.86 g/L</td></tr><tr><td><ul>
<li>NaHCO3 </li>
</ul></td><td>Merk</td><td>6329</td><td>3.36 g/L, pH&nbsp;9.6</td></tr><tr><td>Superblock T20 PBS blocking buffer</td><td>Pierce</td><td>E6423H</td><td>10x concentrated</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td>Used for ELISA</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Analytik Jena AG</td><td>847-0104200302</td><td>Used for epitope mapping</td></tr><tr><td>HCl 1&nbsp;N</td><td>Chimie plus</td><td>40030</td><td></td></tr><tr><td>Ribolyser</td><td>Thermo</td><td>Fast prep FP120</td><td>keep on ice at this step</td></tr><tr><td>Grinding tubes</td><td>Biorad</td><td>355-1197</td><td></td></tr><tr><td>Plate washer</td><td>Tecan</td><td>Columbus Pro</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Biorad</td><td>Model 680</td><td></td></tr><tr><td>Low power magnifier&nbsp;</td><td>VWR</td><td>630-1062</td><td>8X magnification</td></tr><tr><td>Forceps Dumont#7</td><td>WPI</td><td>14097</td><td>For dissection steps</td></tr><tr><td>Transfer pipette 1ml Samso</td><td>Samso</td><td>043231</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>Dutscher</td><td>033290</td><td></td></tr></tbody></table>

nachweis von krankheitsassoziierten α-synuclein durch verbesserte elisa im gehirn von transgenen mäusen expression menschen a53t mutierte α-synuclein

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

Neben etablierten Verfahren wie Western Blot, werden neue Verfahren benötigt wird, um schnell und leicht in experimentellen Modellen der Synucleopathien quantifizieren Krankheit assoziierten α-Synuclein (aS D). Eine transgene Mauslinie (M83) Überexpression des menschlichen A53T aS und spontan die Entwicklung einer dramatischen klinischen Phänotyp zwischen acht und 22 Monate alt sind, gekennzeichnet durch Symptome wie Gewichtsverlust, Erschöpfung, und schwere motorische Einschränkungen, wurde in dieser Studie verwendet. Für die molekulare Analyse von &amp; alpha; S D (krankheitsassoziierten aS) in diesen Mäusen ein ELISA wurde entwickelt, um spezifisch zu quantifizieren aS D in kranken Mäusen. Analyse des Zentralnervensystems in diesem Mausmodell zeigte die Anwesenheit von &amp; alpha; S D hauptsächlich in den kaudalen Hirnregionen und des Rückenmarks. Es gab keine Unterschiede in der &amp; alpha; S D Verteilung zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen, die zu einer klinischen Erkrankung, dh in uninoculATED und normal alternden transgenen Mäusen und bei Mäusen mit Gehirnextrakten von kranken Mäusen eingeimpft. Der spezifische Nachweis von &amp; alpha; S D Immunreaktivität unter Verwendung eines Antikörpers gegen Ser129 phosphoryliert aS durch ELISA im wesentlichen mit der durch Western-Blot und Immunhistochemie erhalten korreliert. Unerwarteterweise wurden ähnliche Ergebnisse mit mehreren anderen Antikörpern gegen den C-terminalen Teil des &amp; alpha; S beobachtet. Die Ausbreitung von aS D, was auf die Beteiligung eines &quot;Prion-ähnlichen&quot; -Mechanismus kann somit leicht überprüft und in diesem Mausmodell unter Verwendung eines ELISA-Ansatz quantifiziert werden.

In dieser Studie verwendeten ELISAs spezifisch identifizierten Krankheit assoziierten &amp; alpha; S (&amp; alpha; S D) in Hirnhomogenaten in einem Hochsalzpuffer von kranken M83 Mäusen hergestellt. Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch pSer129 aS (p = 0,0074), der ELISA leicht unterscheidet alte, kranke Mäuse (&gt; 8 Monate alt) von jungen (2-5 Monate), M83 gesunden Mäusen (Abbildung 1). Mehrere andere Antikörper zeigten ähnlich hohe Signale (&gt; 0,6 OD) nur in Hirnhomogenaten von kr...

Es wird ein ELISA beschrieben, der einen neuartigen quantitativen Ansatz bietet. Er erkennt spezifisch krankheitsassoziiertes α-Synuclein (αSD) in einem transgenen Mausmodell (M83) der Synucleinopathie unter Verwendung mehrerer Antikörper entweder gegen die Serin129-phosphorylierte αS-Form oder den C-terminalen Teil des Proteins.

Nachweis von krankheitsassoziierten α-Synuclein durch verbesserte ELISA im Gehirn von transgenen Mäusen Expression Menschen A53T Mutierte α-Synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Ansammlung des mit der Krankheit assoziierten Alpha-Synucleins in einem transgenen Mausmodell der Parkinson-Krankheit mithilfe eines quantitativen Eliza-Ansatzes zu überwachen. Dies wird erreicht, indem man zunächst nicht inokulierten Mäusen erlaubt, normal zu altern, oder indem Mäuse intrazerebral mit einem Hirnextrakt aus kranken M 83 inokuliert werden. Nachdem die Mäuse klinische Krankheit entwickelt haben und getötet wurden, werden Hirnregionen der Mäuse seziert.Als Nächstes werden aus jeder Hirnregion Homogenate in hochsalzigem Puffer hergestellt und Eliza an den Homogenaten durchgeführt, um das mit der Krankheit assoziierte Alpha-Synuclein in jeder Hirnregion zu quantifizieren. Die Eliza-Ergebnisse zeigen, dass sich die krankhafte Form des Alpha-Synuclein-Proteins hauptsächlich in den Coddle-Hirnregionen, einschließlich des Mesencephalon und des Hirnstamms, sowie in den Rückenmarken der Mäuse anreichert. Der Hauptvorteil dieser Eliza-Technik im Vergleich zu zuvor verfügbaren Methoden wie Western Blot oder Immunhistochemie besteht darin, dass sie eine schnelle und zuverlässige Quantifizierung des mit der Krankheit assoziierten Alpha-Synucleins ermöglicht.In diesem experimentellen Modell kann diese Methode helfen, die Ansammlung und Ausbreitung dieses Proteins im zentralen Nervensystem dieser MA drei Mäuse zu überwachen. Dies deutet auf eine Beteiligung eines Gehirn-ähnlichen Mechanismus bis zur Entwicklung der klinischen Wissenschaft hin. Weiterentwicklungen dieser Methode könnten in Zukunft für die Untersuchung verschiedener biologischer Proben wie Liquor cerebrospinalis oder Blut in Betracht gezogen werden, die möglicherweise auch veränderte Alpha-Formen enthalten, was zeigt, dass dieses Verfahren von einem Techniker aus unserem Labor durchgeführt wird.Alle Prozeduren und Protokolle, die Tiere betreffen, entsprachen der EG-Richtlinie 86 6 0 9 EEC und wurden vom französischen Nationalkomitee für Ethik und Tierexperimente ratifiziert. Zur Berücksichtigung der Ethik und Tierexperimente wurden die Tiere in von A und S'S zugelassenen Experimentiereinrichtungen in Leon Young nach der Euthanasie der Mäuse und dem Entfernen von Gehirn und Rückenmark untergebracht und gepflegt. Gemäß dem Textprotokoll wird ein ganzes Gehirn in einer Petrischale auf Eis unter geringer Vergrößerung platziert.Beginnen Sie damit, eines der beiden Riechkolben zu trennen, indem Sie eine Pinzette direkt hinter dem Bulbus platzieren. Mit einer abwärts gerichteten Bewegung lösen Sie ihn vom Gehirn und entfernen dann den zweiten Bulbus auf ähnliche Weise. Während Sie nun mit einer Pinzette das Gehirn an Ort und Stelle halten, schieben Sie vorsichtig ein zweites Paar Pinzetten zwischen die linke und rechte Rinde und bewegen sie nach vorne, um die beiden Hälften zu trennen.Halten Sie nun weiterhin das Gehirn an Ort und Stelle. Positionieren Sie die zweite Pinzette zwei Millimeter hinter der Rinde und halten Sie den Druck nach oben, um die Rinde von der Hippocampus abzuheben. Entfernen Sie dann den ersten Teil der Rinde, indem Sie am Hippocampus beginnen und sich zur Vorderseite des Gehirns bewegen.Wiederholen Sie dies mit der zweiten Hälfte. Positionieren Sie die offene Pinzette dann um einen der Hippocampi. Schließen Sie dann vorsichtig die Pinzette am unteren Ende des Organs und entfernen Sie es vorsichtig.Wiederholen Sie dies mit dem zweiten Hippocampus. Positionieren Sie die Pinzette hinter einem der Stria und trennen Sie ihn vorsichtig vom Gehirn. Verwenden Sie die Pinzette, um den verbleibenden Cortex vom Striatum zu entfernen, bevor Sie den zweiten Stria entfernen, um das Kleinhirn vom Rest des Gehirns zu trennen. Drücken Sie vorsichtig das Umriss des Kleinhirns.Platzieren Sie dann die Pinzette hinter dem Kleinhirn und bewegen Sie die Pinzette nach vorne, um es zu entfernen, wobei Sie den breiten Teil der Pinzetten verwenden, um sie als Cephaloon anzuheben, der aus vier runden Strukturen besteht, um deutlich zu sehen, wo es sich dem Hirnstamm anschließt. Machen Sie dann einen vertikalen Schnitt an der Verbindung, bevor Sie den Hirnstamm entfernen. Positionieren Sie die Pinzette hinter dem Mesencephalon und heben Sie sie in der Größe vertikal an, um es vollständig vom restlichen Gehirn zu trennen. Um das Gehirn homogen zuzubereiten, fügen Sie ein angemessenes Volumen an HS-Puffer zu den sezierten Gehirnregionen hinzu, um einen erwarteten Prozentsatz des Homogenats zu erreichen, wie in der folgenden Tabelle gezeigt.Verwenden Sie einen Gewebezerkleinerer, der aus einem silikathaltigen Glasrohr und den Rohrschälern A und B besteht. Gießen Sie eine zu zerkleinerde Hirnregion in das Rohr. Homogenisieren Sie dann das Gewebe 10 Mal mit dem Schäler A, um es zu dissoziieren. Wechseln Sie dann zu Schäler B und homogenisieren Sie zusätzlich 20 Mal.Übertragen Sie das Homogenat mit einer Transferpipette in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und wiederholen Sie die Homogenisierung mit den restlichen Hirnproben. Zentrifugieren Sie die Proben 1000 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entnehmen Sie dann den Überstand und teilen Sie ihn in 200 Mikroliter Ali Watts auf. Bei minus 80 Grad Celsius lagern, bis die Eliza-Analyse durchgeführt wird, um Eliza an Gehirnhomogenat durchzuführen.Beginnen Sie damit, 50 Mikromolar Carbonatenpuffer zu verwenden, um den Beschichtungs-Anti-Alpha-Synuclein-Antikörper, Kaninchenpolyklonal oder monoklonal Clone 42, auf 0,01 Nanogramm pro Milliliter mit 100 Mikroliter der Antikörper-Beschichtungslösung zu verdünnen. Beschichten Sie die 96-Well-Mikroplatten mit der Antikörper-Beschichtungslösung und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Fügen Sie 300 Mikroliter PBST zu den Wells hinzu und verwenden Sie einen Plattenwaschgerät, um die Platten fünfmal bei Raumtemperatur zu waschen.Fügen Sie als Nächstes 200 Mikroliter T 20 PBS-Blockierungspuffer zu jedem Well hinzu und schütteln Sie die Platten bei 150 U/min für eine Stunde, bevor Sie PBST verwenden, um die Platten fünfmal zu waschen. Dilutieren Sie das Gehirnhomogenat gemäß den hier aufgeführten Richtlinien und fügen Sie 100 Mikroliter zu jedem Well hinzu. Inkubieren Sie dann bei Raumtemperatur und 150 U/min für zwei Stunden, bevor Sie PBST verwenden, um die Platten zu waschen. Fügen Sie nach dem letzten Waschen die notwendigen Alpha-Synuclein-Detektionsantikörper hinzu, die gemäß Tabelle 2 des Textprotokolls in PBS BST und 1%BSA verdünnt sind, und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur und 150 U/min für eine Stunde, bevor Sie die Platten fünfmal wie zuvor waschen.Fügen Sie als Nächstes entweder Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugate hinzu, die auf eins zu 8000 in PBST 1%BSA verdünnt sind, und inkubieren Sie sie bei 150 U/min für eine Stunde, bevor Sie die Platten fünfmal waschen. Fügen Sie dann 100 Mikroliter TMB-Lösung zu jedem Well hinzu und inkubieren Sie sie bei 150 U/min für 15 Minuten im Dunkeln. Stoppen Sie die Reaktion durch Hinzufügen von 100 Mikroliter eins normaler Salzsäure pro Well.Verwenden Sie dann einen Mikroplattenleser, um die Absorption bei 450 Nanometern für die Datenanalyse zu messen. Subtrahieren Sie den optischen Dichtewert, der im leeren Well erhalten wurde, das nur Puffer und Reagenzien enthält, von der optischen Dichte.Die aus Hirnproben gewonnenen Werte wurden gemäß dem Textprotokoll in dieser Studie statistisch analysiert. Die Elizas identifizierten speziell das mit der Krankheit assoziierte pser 1 29 Alpha-Synuclein in Gehirnhomogenaten von alten kranken M 83. Mäuse waren bei jungen M 83-Mäusen nicht vorhanden. Zusätzlich getestete Antikörper wie LB 5 0 9 zeigten starke Signale bei kranken, aber nicht bei gesunden Mäusen.Die analytische Empfindlichkeit des in diesem Video beschriebenen ELIZA wurde mit einer zuvor beschriebenen Western-Blot-Methode verglichen. Etwa 10 Mikrogramm Gehirnäquivalente waren ausreichend, um ein positives P oder

detection-disease-associated-synuclein-enhanced-elisa-brain

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Inkubieren Sie mit einem proteolytischen Enzym, um die normalen Prionen zu verdauen, wobei die resistenten Aggregate intakt bleiben.

Nachweis von fehlgefalteten Prionenproteinaggregaten im Hirngewebe von Mäusen mittels Western Blotting

Quelle: Bétemps, D., et al.,  Nachweis von krankheitsassoziiertem α-Synuclein durch verstärkten ELISA im Gehirn transgener Mäuse, die humanes A53T-mutiertes α-Synuclein überexprimieren. J. Vis. Exp. (2015). Dieses Video zeigt das Verfahren zum Nachweis des neurodegenerativen krankheitsassoziierten Proteins α-Synuclein im Hirngewebe von transgenen Mäusen mittels ELISA. Die Schritte umfassen die Homogenisierung des Gewebes, die Zentrifugation und den ELISA-Nachweis des α-Synuclein-Proteins zur...

Nachweis von neurodegenerativem Protein α-Synuclein mittels ELISA

Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und kostengünstige Screening-Methode zur Identifizierung von Transkriptionsregulatoren mit Hochdurchsatz-Roboter-Transfektionen und ein hausgemachtes Dual-Luciferase-Assay glühen. Dieses Protokoll erzeugt schnell direkten Seite-an-Seite funktionellen Daten für Tausende von Genen und ist leicht modifizierbar, um jedes Gen von Interesse zielen.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung von zunehmend unlöslichem/aggregiertem alpha-Synuclein (α-syn) aus postmortalem menschlichem Hirngewebe. Durch die Verwendung von Puffern mit zunehmender Detergensfestigkeit und Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugationstechniken können die variablen Eigenschaften der α-syn-Aggregation in erkranktem und nicht erkranktem Gewebe untersucht werden.

Sequentielle Extraktion von löslichen und unlöslichen Alpha-Synuclein von Parkinson-Brains

Dieses Manuskript beschreibt, wie die virale vektorvermittelte lokale Genabgabe eine attraktive Möglichkeit bietet, Transgene im zentralen Nervensystem zu exprimieren.  Das Protokoll beschreibt alle wichtigen Schritte zur Durchführung einer viralen Vektorinjektion in die Substantia nigra der Ratte, um ein auf viralen Vektoren basierendes Tiermodell für die Parkinson-Krankheit zu entwickeln.

Entwicklung eines Alpha-Synuklein Based Rattenmodell für Parkinson-Krankheit durch stereotaktische Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektor,

Periphere Injektion von alpha-Synuclein - Fibrillen in das Peritoneum oder die Zunge von Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) Mäuse, der humanen alpha-Synuclein mit der familial A53T - Mutation exprimieren und Glühwürmchen - Luciferase kann Neuropathologie, einschließlich neuroinflammation induziert in ihrem Zentralnervensystem.

Biolumineszenz-Bildgebung von Neuroinflammation in transgenen Mäusen nach peripherer Inokulation von Alpha-Synuclein

Das Ziel dieses Protokolls ist, ein Zell-basierte System, das die Bildung von Alpha-Synuclein repliziert in Vivoaggregiert zu bieten. Intrazelluläre Alpha-Synuclein Einschlüsse sind in primären Neuronen durch die Internalisierung ausgesät und Vermehrung von exogenen verabreicht native microsomen-assoziierten Alpha-Synuclein-Aggregaten von erkrankten Alpha-Synuclein transgenen Mäusen isoliert.

Exogene Verabreichung von Alpha-Synuclein Microsomen verbundenen Aggregate zur primären Neuronen als eine mächtige Zellmodell der Fibrillen Bildung

Hier, Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung der neuronalen Synuclein-Akkumulation in primären Maus-Dopamin-Neuronen. Phosphorylierte-Synuclein-Aggregate in Neuronen werden mit vorgebildeten ,-Synuclein-Fibrillen induziert. Die automatisierte Bildgebung von immunfluorest markierten Zellen und die unvoreingenommene Bildanalyse machen dieses robuste Protokoll für das Screening von Medikamenten mit mittlerem bis hohem Durchsatz geeignet, die die Akkumulation von Synuclein...

Studium der vorgeformten Fibril-induzierten Synuclein-Akkumulation in primären embryonalen Maus-Midbrain-Neuronen

Diese Arbeit analysiert die Vektordosis und die Expositionszeit, die erforderlich sind, um Neuroinflammation, Neurodegeneration und motorische Beeinträchtigung in diesem präklinischen Modell der Parkinson-Krankheit zu induzieren. Diese Vektoren, die das menschliche α-Synuclein kodieren, werden in die Substantia nigra geliefert, um die mit der Parkinson-Krankheit verbundene Synuclein-Pathologie zu rekapitulieren.

Analyse des Parkinson-Mausmodells, das durch Adeno-assoziierte virale Vektoren induziert wird, die menschliches α-Synuclein kodieren

Eine bequeme Schwerkraft-gefütterte Perfusionsmethode zur histologischen Analyse des zentralen Nervensystems der Maus wird vorgestellt. Der immunfluoreszierende Nachweis von phosphoryliertem α-Synuclein wird in einem Mausmodell der Parkinson-Krankheit demonstriert. Diese Arbeit beschreibt auch umfassend die transkardialen Perfusions-, Dissektions-, Gewebegefrier- / Einbettungs- und gefrorenen Schnittschritte.

Eine schwerkraftgespeiste transkardiale Perfusionsmethode zur histologischen Analyse des zentralen Nervensystems der Maus

Ein in vivo physiologisches Modell von α-Synuclein ist erforderlich, um die Pathogenese der Parkinson-Krankheit zu untersuchen und zu verstehen. Wir beschreiben eine Methode zur Überwachung der Zytotoxizität und Aggregatbildung von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells.

Eine Methode zur Untersuchung der Toxizität und Aggregation von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells

Erfahren Sie, wie man krankheitsassoziiertes α-Synuclein in transgenen Mäusen mittels verbesserter ELISA quantifiziert. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Analyse von Proteinakkumulation in verschiedenen Gehirnregionen.

Nachweis von krankheitsassoziierten α-Synuclein durch verbesserte ELISA im Gehirn von transgenen Mäusen Expression Menschen A53T Mutierte α-Synuclein (Video) | JoVE Journal

Nachweis von krankheitsassoziierten α-Synuclein durch verbesserte ELISA im Gehirn von transgenen Mäusen Expression Menschen A53T Mutierte α-Synuclein

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