Name: Scalable Platte mit 96 Vertiefungen Basierend iPSC Kultur und Produktion Mit einem Robotic Flüssigkeitshandhabungssystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Erfahren Sie eine skalierbare iPSC-Kulturmethode mit einem robotischen Flüssigkeitshandhabungssystem in 96-Well-Platten. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Aufrechterhaltung von Pluripotenz und die Differenzierung in Kardiomyozyten.

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Diese Arbeit wurde teilweise wurde durch NIH Zuschüsse, R44 und R01 HL109505 GM087784 unterstützt. Autoren danken der technischen und OEM-Team von Gilson, INC für erweiterte technische Unterstützung.

Die Autoren MKC, MJG, EEB, NJD und RO sind oder waren zum Zeitpunkt der Entwicklung Mitarbeiter InvivoSciences, INC, die die hier beschriebenen Roboter-Protokolle konzipiert und entwickelt. TW ist der CSO für InvivoSciences INC. SH ist Mitarbeiter von Gilson INC.

In der vorliegenden Studie ein Verfahren zur Roboterkultur für iPSC Produktion, die miniaturisiert und automatisiert die Fütterung und Durchgang in eine 96-Well-Plattenformat und gleichzeitig eine effiziente Scale-up haben wir. Ein Flüssigkeitshandhabungsroboter wurde verwendet, um routinemäßig zu füttern iPSC Kolonien und Gang sie in regelmäßigen Abständen durch enzymatische Spaltung. Der Roboter wurde so programmiert, dass der extrazellulären Matrix-Gel-beschichteten Platten produzieren und führen Sie eine Aussaat Dichtegradienten. Wenn Fibroblasten und Fettgewebe abgeleiteten iPSCs wurden in diesem System für mehr als 20 Passagen, etwa 3 Monate lang kultiviert wurde Pluripotenz aufrechterhalten, wie auch stabilen Karyotyp. Beide Zelllinien wurden in der Lage Differenzierung zu Kardiomyozyten. Zusammen, die Sammlung von Protokollen hier beschriebenen können Anwender mit sehr wenig Stammzellkultur Erfahrung oder nur begrenzten Zugang zu spezialisierten Kulturanlagen, die Kultur Stammzellen und eine hohe Zellproduktion oder mehreren Leitungen Umgang mit minimaler Arbeit und Kosten. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Die Roboter-Protokolle hier detailliert ein Verfahren zum wirtschaftlichen Maßstab aus iPSC Herstellung und Handhabung. Ein Vorteil ist, skalierbaren Stammzellkultur in einem etablierten Platten basiertes Format hier gezeigt und zuvor 44,47 - 49, um Pluripotenz aufrechterhalten. Während andere Formate von skalierbaren Stammzellkultur Ausbeute pluripotenten Zellen 20,23,29 diese Platte basierte Methode erfordert im wesentlichen keine Veränderung der Kultur-Format, wie die Anpassung an Suspension, die Verwendung von Antischaum Chemikalien oder längerer Verwendung von Rho-Kinase-Inhibitor 20. Diese Platte basierend Verfahren kann daher schnell und vorherzusehen war, unterzubringen neuen Linien, weil die Kulturbedingungen sind ähnlich. Da der Einsatz von iPS für Krankheit Modellierung erhöht 4,6,19,50 werden neue iPSC Linien kontinuierlich erzeugt. Die hier beschriebenen Techniken sind am besten geeignet zur Kultur neue Zeilen in mittleren bis hohen Volumen und den Durchsatz, da die Schranke auf dem Format Übergang low. Dies gilt auch für die Arbeit und Ausrüstung notwendig, um die Kolonien zu erhalten. Schließlich, da das Format und Handhabung ähnlich der zur Ableitung und Validierung iPSC Leitungen Kultur Leistung, wie eine gerichtete Differenzierung Umwelt sind, ist wahrscheinlich mehr vorhersagbar. Figur 8 veranschaulicht eine Strategie zur Maßstabsvergrößerung der Herstellung von Stammzellen in 96-Well-Platten. Eine Platte (Zyklus 0) wird verwendet, um Roboter Saatgut 12 neue Platten, eine 12-fache Erhöhung (Zyklus 0-1). Nach einigen Tagen der Fütterung, eine der zwölf Platten agiert, um einen weiteren Satz von zwölf Platten (Zyklus 1 Zyklus 2) Samen. Die verbleibenden elf Platten sind nun für andere Verwendungen verfügbar sind und für die Herstellung Komponente des Systems. Bei diesem Tempo wird Gang von einer Platte bieten 11 Platten pro Zyklus oder alle 3-4 Tage. Diese Methodik kann mehr skaliert, wenn mehrere Platten werden passagiert, wie in dem Übergang von Zyklus 2 Zyklus 3 gezeigten Zyklus 3 ist, sind zwei Plattenimmer dann verwendet, um die Kolonie zu erhalten und Saatgut 24 neue Platten. Die verbleibenden 22 Platten werden dann zur Verwendung nach jedem Durchgang Zyklus zur Verfügung. An irgendeiner Stelle in der Wartungszyklus kann der Benutzer mehrere Platten zur Steigerung der Produktion Samen. Ein Beispiel wäre, um Durchgang jede Spalte für zwei Wachstumsperioden betragen. Der erste Durchgang wandelt einen Platte in zwölf Platten und jeder der zwölf Platten verwendet wird, um Platten 144 Samen. In diesem Fall beginnt ein Benutzer mit einer Platte und nach zwei Durchgängen oder etwa 1,5-2 Wochen Kultur mit 144 Platten. Beispielsweise ergeben die Fibroblasten und Fett iPSC Linien etwa 25 bis 75.000.000 Zellen pro Platte mit 96 Vertiefungen, wenn bereit, Durchgang. 144 Platten könnte daher repräsentieren etwa 4-7 x 10 9 Zellen. Was ist der Arbeitsaufwand für die 144 Platten mit 96 Vertiefungen Roboter trägt? Eines der Ziele für diese Arbeit war skalierbaren Stammzellproduktion, die Arbeit reduziert im Vergleich zu herkömmlichen (dh 6-Well-Platte) Stammzellkultur. Der Roboter accomplishes dies durch die Linderung der Notwendigkeit, jede Platte physisch hand während Fütterung und Passagieren. Während 96-Well-Platte Produktion Skalen linear, wie es wäre in der traditionellen 6-Well-Platten, ist die Zeit, ein Techniker verbringt die Arbeit mit den Platten deutlich weniger mit Roboter-Kultur. Die Produktionseffizienz von Roboterkultur aus dieser Differenz (Figur 9) abgeleitet wird. Es wurde festgestellt Techniker konnten eine 6-Well-Platte aus dem Inkubator der Platte in etwa 3,5 Minuten zu entfernen, überprüfen Sie es auf dem Mikroskop, dann absaugen und zu füttern. Demgegenüber verbringen Techniker etwa 30 sec eine 96-Well-Platte aus dem Inkubator entfernt und deren Prüfung unter dem Mikroskop auf Dichte und Verunreinigungen vor der Platzierung auf den Roboter. Mit einem erweiterten Fütterungsprotokoll ähnlich dem oben beschriebenen können sechs Platten mit 96 Vertiefungen geladen und zugeführt werden, was in etwa 21 min, bzw. 3,5 min pro Platte erfolgt. Die Gesamtzeit, um eine Platte zu ernähren ist vergleichbar zwischen Roboteric und manuellen Methoden, sondern auf Handanlage 6 Platten ein Techniker wird für alle 21 min benötigt, während die Techniker nur 3 min Umgang mit den sechs Platten für den Roboter (30 sec Inspektion pro Platte) verbringt. Wie Abbildung 9 zeigt, ist die Zeit ein Techniker verbringt Handhabung 144 Platten mit dem Roboter ist etwa 1,2 Stunden, im Gegensatz zu 8 Stunden von Hand und der Roboter werden nie einen Fehler machen, die Handhabung der Platten oder Überleiten von Flüssigkeiten. Die hier beschriebenen 96-well iPSC Kulturmethoden eine tractable Plattform für komplexe Screening-Aufgaben. Weil jede Vertiefung genetisch identisch und mit der gleichen Dichte aus der gleichen Ausgangspool ausgesät können Variablen über die Platte verteilt sind und durch den Roboter mit handelsüblichen Behältern, um Bedingungen zu trennen aufrechterhalten werden. Dies wäre nützlich für Experimente wie Stammzellenwachstumsmedien Entwicklung 34,35,47, Substrat oder Kulturbedingung Prüfung und Toxizitätsstudien unter Verwendung von Stammzellen51. Da jede Stammzelllinie ist in Bezug auf die optimale Koloniegröße und Durchgang Anforderungen einzigartig, kann man dieses System nutzen, um Aussaatdichte, Fütterung Frequenzgang und Handhabung durch die Manipulation der Spalten geerntet, die mechanische Bewegung während des Durchgangs und die Fütterung Frequenz zu modulieren. Durchlaufen dieser Variablen ermöglicht es dem Benutzer, eine Reihe von Bedingungen, die zur Kultur einer neuen Linie schnell zu finden oder neue Kulturtechniken. Das Robotersystem ist auch in der Lage ist die Aufrechterhaltung 96 parallel aber unabhängig Stammzellenkolonien. Wenn iPSC aus somatischen Zellen abgeleitet oder nach genetischer Manipulation kloniert werden viele parallel Klone gescreent, um potenzielle iPSC Linien ergeben. Sobald einzelne Zellen werden in 96-Well-Platten ausgesät, kann dieses System zu füttern und Durchgang der 96-Well-Platten halten jede Kolonie getrennt. Dies ermöglicht einen sehr hohen Durchsatz bei der Auswahl der potentiellen Klonen und beseitigt die Schwierigkeiten bei der Kultivierung von 96 körperlich parallelen Linien. Diese Methode auch einellows Produktion jedes Klons so skaliert, dass Material für die parallele Analyse ohne weiteres verfügbar ist. Schließlich stellen wir uns Integration dieser Kulturtechniken mit einer Roboter-Plattensystem, das Handels Platten zu und von den Inkubator ermöglicht vollautomatische Kultur liefert. Dies könnte mit komplexeren Robotik, die für eine größere Ausdehnung zu ermöglichen, da die hier beschriebenen grundlegenden Protokolle sind auf andere Platte basierte Systeme übertragbar erreicht werden. Die ersten wichtigen Schritte, die in den Protokollen zu adressieren sind diejenigen, die verhindern, und überprüfen Sie die Verunreinigungen wie die Schritte 1.5 und 4.2. Verunreinigungen, wie oben erörtert, kann erfolgreich vermieden werden, wenn gute steriler Technik und gesundem Menschenverstand eingesetzt werden wird. Es ist zwingend notwendig, unabhängig von Stammzellkultur-Format, dass der Betreiber-Check für Kontamination und damit in diesem Protokoll an den angegebenen Schritte wird deutlich das Risiko für die Kontamination zu verringern. Proper extrazellulären Matrix-Gel-Anwendung ist eine zweite esszielle Schritt zum Erfolg dieses Protokolls. Ohne den 96-Well-Platten richtig Beschichten werden die Stammzellen nicht wachsen. Ein häufiges Problem ist unvollständig und Beschichtung. Die Erfahrung hat gezeigt, dass Luftblasen, elektrostatische Anziehung und Kapillarwirkung behindern auch komplette Beschichtung. Das Vornässen Schritt (1,6) entwickelt, um auch Seitenbeschichtung deutlich verbessern und sollte nicht übersprungen werden. Diese Vorbenetzung Schritt erscheint, um die scheinbare Hydrophobie des Kunststoff 96-Well-Platte, so daß zu reduzieren, wenn die extrazelluläre Matrix-Gel-Beschichtung aufgebracht wird gleichmäßig über den Boden und die Seiten gut verteilt. Es wird auch empfohlen, um leicht auf die 96-Lochplatten gegen eine saubere Hand einmal beschichtet, um auch extrazelluläre Matrix-Gel-Lösung Verteilung zu gewährleisten. Die Dissoziation Parameter sind auch wichtig, um zu optimieren. Erweiterte Inkubation mit Enzym oder EDTA basiert Dissoziation Reagenz wird in einzelnen Zellen, die möglicherweise nicht das Ziel während des Durchgangs werden die Folge sein. Daher der Betreibersollte besonderes Augenmerk auf wie Dissoziation Zeit, Verreiben Kraft und Wasch Wiederholungen beeinflussen Koloniemorphologie und Gesundheit und passen zu zahlen. Das Verständnis der Beschränkungen in Bezug auf den hier beschriebenen Techniken sind ausschlaggebend für die erfolgreiche Operation. Wie in irgendeinem anderen Zellkultur-Einstellung, die Verwendung von 96-Well-Platten zeigt eine relativ hohe Kontaminationsgefahr. Wie oben beschrieben, ist ein Techniker Handhabungs jede Platte während der Zuführung und die Passage; beispielsweise beim Öffnen des Deckels, indem die Platte auf dem Roboter-Bett, und Prüfen der Platte auf dem Mikroskop. Daher ist, wie nach dem Schritt 1.5 erwähnt, ist es unerlässlich, die Innenseite jeder Platte Deckel nicht zu berühren oder aussetzen, diesen Teil zu einer potenziell kontaminierten Fläche wie die geneigte Heizblöcke oder vertikale Stifte auf dem Bett. Während der Protokollentwicklung wurde diese Einschränkung entdeckt und war der Anstoß, um eine Zahnstange, um Platte Deckel zu halten, um die Sterilität zu erhalten entwickeln. Ebenso sind die Trog Stauseen, Pipettenspitzen und other Lieferungen auf der Liquid-Handling-Roboter Bett sind potentielle Kontaminationsquellen, da sie offen für Umwelt und durch den Techniker behandelt sind. Daher sollten gute sterile Technik, die als Reduktionsbewegungen über ausgesetzt Kultur Materialien oder Flüssigkeiten offen angelegt, so werden. Eine weitere Einschränkung ist, dass, wenn das Protokoll skaliert, visuelles Prüfen jedes gut&gt; 100 96-Well-Platten ist umständlich. Dies kann mit durch Sichtkontrolle die ganze Platte auf Anzeichen von Kontamination, wie trüben Medien behandelt werden, um verdächtige Brunnen zu identifizieren. Für zukünftige Maßstab up wird die Verwendung eines automatisierten Mikroskop und Indikator für Zellwachstum und mögliche Verunreinigungen eingebracht werden. Zusammenfassend ist die hier beschriebene Hochdurchsatz-96-Well-basierte Plattform bietet eine reproduzierbare, hohe Wiedergabetreue Verfahren zur Stammzellkultur und Produktion in einem Plattenformat. Dieses Verfahren reduziert die erforderliche Erfahrung, Ausrüstung notwendig und Arbeitszeit gewidmet Stammzellkultur, währenddie Aufrechterhaltung der Vorteile der traditionellen adhärenten Kultur.

6 - Die Verwendung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) hat sich seit ihrer Ableitung im Jahr 2007 für 1 Verbindung Test, der regenerativen Medizin und Krankheit Modellierung 2 erhöht. Dieser Forderung kommt von iPSC die Fähigkeit, eine große Zahl von pluripotenten Zellen, die in somatische Zellen bei einer beispiellosen Quantität differenziert werden kann ergeben. Wie verwiesen Differenzierung Techniken zu verbessern 7-10 und Entwicklung der menschlichen Zell- oder Gewebemodellierung und Zelltherapie erhöht 11-14, nimmt auch die Voraussetzung für die Massenproduktion von hochwertigen iPSCs. Es ist weithin zitiert, dass unter anderen Krankheiten, Herzinfarkt oder B-Zell-Funktions Ersatz wird hunderte Millionen erforderlich, um Milliarden von iPSC abgeleiteten somatischen Zellen 15-18. Außerdem immer komplexer 3D-Gewebemodelle für Wirkstoffforschung und therapy wird eine große Zahl von Zellen 9,13,19 verlangen. In all diesen Beispielen, definierte, gleichmäßige und reproduzierbare iPSCs müssen verfügbar sein und einfach herzustellen sein. Zur Herstellung der Stammzell abgeleitet Biopharmazie und Zellen für Tissue Engineering und der Transplantation ist eine kostengünstige Zellfertigungstechnik unerlässlich. 25 oder Suspension mit dem Einsatz von Mikroträgersubstrate 26 - - 28 zum Teil, weil diese Techniken erfolgreich für große, nicht-iPSC, eukaryotischen basierte Produktion eingesetzt skaliert Herstellung von iPS-Zellen wurde auf Suspensionskultur 20 konzentriert. Mehrere Gruppen haben Suspensionskultur-Systeme, die pluripotenten Stammzellen 20,21,23,24,29 ergeben demonstriert. Allerdings sind diese Ansätze verwenden teure und komplexe Systeme nicht ohne weiteres verfügbar, um Forschern die Entwicklung neuer Differenzierungsprogramme, Fahr Tissue Engineering und tut laboratory Skala Forschung. Außerdem Federung und Mikro iPSC Kulturen erfordern Anpassung und Techniken oder Chemikalien nicht in traditionellen haft iPSC Kultur gefunden, wie kontinuierliche Verwendung von Rho-Kinase-Inhibitor, Antischaummittel und Filtration, um die Aggregation zu regulieren. Körperliche Belastung für die Zellen häufiger in Suspensionskultur, durch mechanische Bewegung als auch bei Mikro Zusammenstoß eingeleitet. Diese Probleme begrenzen die Berechenbarkeit und Geschwindigkeit, mit der neu generierten Stammzelllinien können in Suspension kultiviert werden. Andere haben Roboter-Plattenhandling-Systeme, die Platte Kultur Techniken 30,31 nachahmen entwickelt, aber diese Plattformen verlangen erhebliche Investitionen für Ausrüstung und Know-how, um zusätzlich zu den grundlegenden Herausforderungen mit Stammzellkultur assoziiert zu betreiben. Die folgende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Praxis einer skalierbaren iPSC Kultursystem, das eine in sich geschlossene, Standard-8-Kanal-Roboter-Flüssigkeit verwendetHandler und 96-Well-Platten. Diese Methode wurde entwickelt, um Labormaßstab iPSC Kultur und High-Volume-Produktion iPSC brücken (zB 10 7 bis 1,5 x 10 9 Zellen pro Woche pro Techniker) es denjenigen die Entwicklung neuer Technologien, um iPSC leicht skalieren Produktion ohne große Hardware oder Arbeits Investitionen. Diese Methode ist relativ kostengünstig einzurichten, erfordert wenig bis gar keine Stammzellkultur, Programmierung oder Engineering-Erfahrung, hat eine kleine Stellfläche Ausrüstung, ohne die Notwendigkeit für einen dedizierten Zellkultur Kapuze und nutzt Standard-Zellkulturanlagen zu mittleren bis hohen Durchsatz ermöglichen automatisierte Zellproduktion. Ziel war es, ein System, das skalierbare Stammzellkultur, die von Labors neue Zellkultur Stammzellen verwendet werden können zu entwickeln, die, die manuelle Pflege ein Hindernis für die Entwicklung ihrer Ideen oder diejenigen, die eine wirtschaftliche Möglichkeit, eine große Anzahl von Stammzellen zu produzieren finden. Die hier vorgestellte Plattform entfernt Techniker Einfluss aufStammzellkultur und normalisiert die Fütterung und Passage, um die kontinuierlich Stammzellproduktion zu ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Platten</td><td>: Corning</td><td>3596</td>, <td>96-Well; Well-Volumen: 360&nbsp; &#956; l; Zellwachstumsfläche: 0,32&nbsp; cm2; Einzeln verpackter</td></tr><tr><td>Seahorse Trog</td><td>SeahorseBio</td><td>201308-100</td><td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td></tr><tr><td>Gilson Tips</td><td>Gilson</td><td>F167023</td><td>10 Racks Gilson 96 Tips D200 Tips</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12500062</td><td>DMEM/F12 Pulver. In 1 l gereinigtem Wasser in Zellkulturqualität und Sterilfilter resuspendieren.</td></tr><tr><td>Wachstumsfaktor reduziert Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Wird im Text als "extrazelluläres Matrixgel" bezeichnet. Matrigel GFR, 10&nbsp; ml</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5857</td><td>mTeSR1 Komplettset für die hES-Erhaltung.</td></tr><tr><td>E8 Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td>TeSR-E8 Kit für die hESC/hiPSC-Wartung</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>AdooQ BioScience</td><td>A11001-50</td><td>Gesteinsinchinitor Y-27632 2HCI</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>ACCUTASE</td><td>Wird im Text als "proteolytisches und kollagenolytisches Dissoziationsreagenz" bezeichnet. Accutase 500&nbsp; ml sterile Zelllösung</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher SH30256FS</td><td></td><td>PBS ohne Ca Mg 500&nbsp; ml, 6/pk</td></tr><tr><td>Gilson PIPETMAX</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAX</td><td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td></tr></tbody></table>

scalable platte mit 96 vertiefungen basierend ipsc kultur und produktion mit einem robotic flüssigkeitshandhabungssystem

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

Kontinuierliche Weiterentwicklung in pluripotente Stammzellkultur ist, die Lücke zwischen Labor und Krankenbett für die Verwendung dieser Zellen in der regenerativen Medizin, Arzneimittelforschung und Sicherheitsprüfung. Zur Herstellung der Stammzell abgeleitet Biopharmazie und Zellen für Tissue Engineering und der Transplantation ist eine kostengünstige Zellfertigungstechnik unerlässlich. Aufrechterhaltung der Pluripotenz und stabile Leistung von Zellen in Downstream-Anwendungen (beispielsweise Zelldifferenzierung) über die Zeit ist von größter Bedeutung, um im großen Maßstab Zellproduktion. Noch so schwer sein kann, zu erreichen insbesondere wenn Zellen kultiviert werden manuell in dem der Betreiber kann erhebliche Variabilität einführen sowie prohibitiv teuer Maßstab übertragbar ist. Hochdurchsatz, groß angelegte Stammzellproduktion zu ermöglichen und zu entfernen Bedienereinfluss neuartigen Stammzellkultur-Protokolle mit einem Tischmultikanal Flüssigkeitshandhabungsroboter entwickelt wurden, die eine minimale Beteiligung Techniker oder Erfahrung erfordern. MitDiese Protokolle menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) wurden in Feeder-freien Bedingungen kultiviert direkt von einem gefrorenen Lager und in 96-Well-Platten gehalten. Abhängig von der Zelllinie und gewünschten Maßstab Aufnahmegeschwindigkeit, kann der Bediener leicht bestimmen, wann die Passage auf der Basis einer Reihe von Bildern, die optimalen Kolonie Dichten zur Aufspaltung. Dann werden die notwendigen Reagenzien sind bereit, eine Kolonie Split auf neue Platten ohne einen Zentrifugationsschritt durchzuführen. Nach 20 Durchgängen (ca. 3 Monate) aufrechterhalten zwei iPSC Linien stabil Karyotypen, ausgedrückt Stammzellmarkern und differenziert zu Kardiomyozyten mit hohem Wirkungsgrad. Das System kann anschließende Hochdurchsatz-Screening neuer Differenzierungsprotokollen oder genetische Manipulation für 96-Well-Platten entwickelt auszuführen. Diese Technologie wird den Arbeitsaufwand zu verringern und technische, eine große Anzahl von identischen Stammzellen für eine Vielzahl von Anwendungen.

Die beschriebenen Protokolle ermöglichen es Laboren, skalierbare, adhärente Stammzellkulturen mit minimalem Arbeitsaufwand, Erfahrung und Ausrüstungsinvestitionen mit einem programmierbaren Liquid-Handling-Roboter und 96-Well-Platten durchzuführen. iPSCs, die mehr als 20 Mal auf diesem System durchlaufen wurden, behielten die Pluripotenz bei, normalisierte Karyotypen und differenzierten sich zu Kardiomyozyten.

Scalable Platte mit 96 Vertiefungen Basierend iPSC Kultur und Produktion Mit einem Robotic Flüssigkeitshandhabungssystem

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine skalierbare, pluripotente Zellkultur reproduzierbar aufzubauen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein vorprogrammierter Flüssigkeitshandhabungsroboter verwendet wird, um humane pluripotente Stammzellen in unterschiedlichen Dichten auszusäen. In einem 96-Well-Platte werden im zweiten Schritt die Wells mit optimalen Koloniedichten visuell zur Verpackung identifiziert.Die induzierten humanen pluripotenten Stammzellen werden anschließend auf neue Platten ausgesät, um eine automatische Versorgung und weitere Aufbereitung zu ermöglichen. Letztendlich erlaubt dieses Verfahren die Auswahl der optimalen Aussaatdichten zur Vermehrung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen, die später in Kardiomyozyten differenziert werden sollen. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Entwicklung personalisierter und regenerativer Therapien auf mittlerer Skala.Der URI-Potent-Kulturroboter eignet sich zur Herstellung mehrerer hundert Millionen URI-potenter Stammzellen innerhalb weniger Tage, die anschließend in verschiedene Zelltypen differenziert werden können, um personalisierte Arzneimitteltests oder Zell- und Gewebeimplantattherapien durchzuführen. Obwohl diese Methode bereits zur Untersuchung von Aussaatdichten für eine optimale Expansion pluripotenter Zellkulturen angewandt wurde, kann sie ebenfalls zur Optimierung und Identifizierung neuartiger Differenzierungsprotokolle für verschiedene andere Zelltypen verwendet werden. Demonstration der Prozedur wird pharmazeutische Wissenschaftlerin Neil Daily aus meinem Labor übernehmen. Bevor Sie mit dem Fütterungsverfahren beginnen, überprüfen Sie die 96-Well-Platte mit den Stammzellkolonien auf Kontaminationen und stellen Sie sicher, dass die Zellkolonie unterhalb der idealen Passage-Dichte liegt.Wenn sich die Zellen in gutem Zustand befinden, stellen Sie die Platte in das Bett. Positionieren Sie drei auf der geneigten Rampe bei 37 Grad Celsius des Flüssigkeitsmanipulationsroboters und laden Sie das Spitzenmagazin in das Bett. Positionieren Sie eine mit pipettenspitzen für 200 Mikroliter bei Raumtemperatur.Platzieren Sie eine Viermuldenwanne in der Bettposition zwei und füllen Sie Mulde drei der Wanne mit acht Milliliter frischem, auf Raumtemperatur gebrachtem Stammzellwachstumsmedium ohne RO-Kinaseinhibitor. Übertragen Sie dann die Platte auf das Plattenhaltergestell und wählen Sie über das Touchpad der Robotiksteuerung nacheinander „Protokoll ausführen: Koloniefütterung, eine Platte“ und anschließend „Testlauf“, um mithilfe des Schritt-für-Schritt-Assistenten das ausgewählte Programm vorab zu testen. Sobald das Protokoll genehmigt ist, wählen Sie „Protokoll ausführen“. Nach der Fütterung nehmen Sie die 96-Well-Stammzellkolonieplatte wieder auf.Notieren Sie dann die Details des Fütterungsvorgangs auf dem Schalenboden und stellen Sie die Schale für 24 Stunden zurück in den Zellkultur-Inkubator, bis zur nächsten Fütterung oder Passage. Die Wahl der Aufspaltungsgrube hängt von der Koloniedichte ab. Mehrere Tage nachdem ein Aussaatdichtegradient auf dieser Schale eingerichtet wurde, sehen wir eine Grube, die zu dicht ist, um ideal aufzuspalten, und eine Grube, die nach mehreren Fütterungszyklen zu spärlich ist, um passagiert zu werden.Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen den meisten Kolonien in der 96-Loch-Platte 25 % des Durchmessers der benachbarten Kolonie beträgt, da andernfalls ein anschließendes Füttern dazu führen würde, dass die Kolonien ineinanderwachsen. Falls die Kolonie nicht kontaminiert ist, stellen Sie die Platte ins Bett. Positionieren Sie drei auf der 37-Grad-Rampe und laden Sie das Tip-Rack ins Bett.Platzieren Sie eine mit Pipettenspitzen für 200 Mikroliter bei Raumtemperatur. Stellen Sie eine Viermuldenwanne in die Bettposition zwei und geben Sie 8,5 Milliliter Stammzellwachstumsmedium, ergänzt mit dem Rho-Kinase-Inhibitor Y 2 7 6 3 2, in Mulde drei, 3,5 Milliliter eines 30 %igen proteolytischen und kollagenolytischen Dissoziationsreagens in Mulde zwei und 4,5 Milliliter PBS in Mulde vier, wobei Mulde vier leer bleibt.Als Nächstes stellen Sie eine neue, vorerwärmte 37 Grad Celsius extrazelluläre Matrixgel-beschichtete 96-Well-Platte in Bett-Position fünf und überführen die Deckel der alten und der neuen Platte in den Plattendockhalter. Verwenden Sie nun das Touchpad der Robotersteuerung, um nacheinander „Protokoll ausführen: Kolonie-Teilung 1 zu 12, Spalte 1“ und danach „Weiter“ auszuwählen. Wählen Sie anschließend „Testlauf“, um mit dem Schritt-für-Schritt-Assistenten ein ausgewähltes Programm vorab zu testen, gefolgt von „Protokoll ausführen“.Wenn das Passagierungsprotokoll abgeschlossen ist, nehmen Sie beide Platten zurück. Beschriften Sie die neue Platte mit den relevanten Informationen und stellen Sie die Platten in den Inkubator zurück. Innerhalb von 24 Stunden sollten sich die Zellen und Kolonien innerhalb von zwei bis drei Stunden nach der Teilung an der Platte anheften und aufgrund des Vorhandenseins des RO-Kinase-Inhibitors stark ausgebreitet erscheinen.Nach der ersten Fütterung ohne RO-Kinaseinhibitor verdichten sich die Zellen und zeigen die charakteristische kieselsteinartige Stammzell-Morphologie. Chromosomale Abnormalitäten werden häufig während der Stammzellkultur beobachtet, beeinflussen jedoch möglicherweise nicht die Verteilung von Pluripotenzmarkern wie jenen, die in diesen Bildern dargestellt sind. Tatsächlich zeigte die Karyotyp-Analyse von Zellen, die mit dem gerade demonstrierten Protokoll kultiviert wurden, dass beide robotisch passagierten induzierbaren pluripotenten Stammzelllinien 46 normale Chromosomen aufwiesen, was darauf hindeutet, dass das robotische Kultivierungsverfahren keine darüber hinausgehende chromosomale Instabilität verursachte, als dies normalerweise auftreten könnte. Um etablierte Genexpressionsmarker von Stammzellen in robotisch kultivierten induzierbaren pluripotenten Stammzelllinien zu untersuchen, wurde ebenfalls die Gesamt-RNA isoliert.Beide induzierbaren pluripotenten Stammzelllinien in diesem Experiment wiesen einen ähnlichen Ausdruck von Pluripotenzmarkern auf, während die aus jeder Linie differenzierten Kardiomyozyten dies nicht taten, ebenso wenig wie eine separate Linie humaner dermaler Fibroblasten. Außerdem zeigten beide induzierbaren pluripotenten Stammzelllinien nach Differenzierung in Kardiomyozyten eine deutliche Bildung von Sarkomeren. Insgesamt legen diese Daten nahe, dass drei Monate und mehr als 20 Passagen einer robotergestützten Kultur zu chromosomal normalen Zellen führten, die ein Transkriptionsprogramm aufwiesen, das mit Pluripotenz vereinbar ist, und die zudem in der Lage waren, sich in Kardiomyozyten zu differenzieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diesen oder einen ähnlichen Flüssigkeitsmanipulationsroboter verwenden können, um pluripotente Zellen auf skalierbare Weise zu kultivieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Large Insert Environmental Genomic Bibliothek Produktion

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A Quantitative Analysis Fitness-Workflow

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