Name: Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Erfahren Sie, wie das TetON-System in Zebrafischen zur gewebespezifischen Genexpression in der regenerierenden Schwanzflosse eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht induzierbare und reversible Genregulation zur Untersuchung molekularer Mechanismen.

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Die Autoren danken Christa Haase, Doris Weber und Brigitte Korte für die technische Unterstützung. Arbeit im Labor Weidinger durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1 unterstützt, WE 4223 / 4-1 und von der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie über eine Oskar-Lapp-Stipendium und ein Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die erwachsenen Zebrafisch hat eine erstaunliche Fähigkeit, viele der inneren Organe und Anhänge erfolgreich zu regenerieren. Ein gründliches Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen erfordert gewebespezifische Analyse von Gen-Funktionen und Signalwege. Auf dem Weg zu diesem bietet die Teton-System ein effizientes Werkzeug für die raumzeitlich gesteuerte Genexpression in embryonalen und erwachsenen Zebrafisch. Die Teton System Konstrukte und Methoden in dieser Handschrift beschrieben wurden erfolgreich in ...

Der Zebrafisch ist ein gut etabliertes Wirbelmodellorganismus, um viele Aspekte der Entwicklung, der Physiologie, Krankheiten und Regeneration zu studieren. Mit der wachsenden Annahme der Zebrafisch als Modell für die post-embryonale biologische Prozesse, experimenteller Werkzeuge zur induzierbaren, gewebsspezifischen Manipulation der Genexpression oder Signalwege immer wichtiger geworden. Besonders haben Studien in Orgel und Anhängsel Regeneration im erwachsenen Zebrafisch aus einem Mangel an Tools für die Präparation der raum-zeitlichen Anforderungen von Signalwegen in diesen Regenerationsprozesse erlitten. Derzeit sind drei verschiedene Systeme verwendet worden, um bedingte, gewebespezifische Genexpression in regenerierenden Organen erwachsenen Zebrafisch zu erzielen: das Cre-lox-System, Mosaik Expression von Hitzeschock induzierbares Transposon-Transgenen mit vermittelte somatischen Transgenität und die TetOn System 1 -3. TetOn bezieht sich auf eine Variante eines Tetracyclin-contgewalzten Transkriptionsaktivierungssystems, wobei die Expression in Gegenwart des Antibiotikums Tetracyclin oder einem Derivat, beispielsweise Doxycyclin aktiviert. Die Cre-lox-System, wie es bisher in ausgewachsene Fische verwendet wurde, stützt sich auf eine Tamoxifen-gesteuert Cre-Rekombinase (CreERT2), deren Expression räumlich durch gewebespezifische regulatorische Elemente beschränkt. Cre gesteuerte Entnahme einer Stop-Kassette ermöglicht die Expression des Gens von Interesse von einem Promotor, der in allen Zelltypen 1 aktiv sein soll angetrieben. Transposon-vermittelte Erzeugung von mosaik ausgedrückt somatischen Transgenen stellt ein System für die induzierbare Expression des Transgens in den einzelnen Zelllinien. Die Injektion von Zebrafischembryonen mit einem Tol2 Transposon trägt ein Gen von Interesse unter der Transkriptionskontrolle eines Hitzeschockpromotor Ergebnisse in chimären Individuen in der Regel trägt das Transgen nur in diskreten Zelllinien aus einer regenerierenden Orgel 2. Während beide Systeme ermöglichen bedingte Gewebe spesche Genexpression ist das Cre-lox-System nicht reversibel, und die Strategie mit einem Transposon-beruhenden klonalen Kennzeichnung leidet ihre stochastische Natur. So haben wir und andere kürzlich transgenen Teton Systeme für den Einsatz in Zebrafisch, der zeitlich und räumlich gesteuerte Genexpression, die zusätzlich abstimmbaren und reversible 3-5 ist zu erleichtern angepasst. Die Teton System besteht hier aus einem transgenen Fahrer (TetActivator), in dem ein Doxycyclin (DOX) -induzierbaren Transkriptionsaktivator (verbesserte Umkehr Tetracyclin-Transaktivator, irtTA, kurze TETA) ist unter Kontrolle von gewebespezifischen genomischen regulatorischen Sequenzen. Zweitens bedarf es einer transgenen Responderlinie (TetResponder), die ein Gen von Interesse unter der Transkriptionskontrolle des Tetracyclin-Operator Häfen (Tet-Response-Element; Tetre) (Abbildung 1A). Somit ermöglicht die Verwendung von spezifischen Kombinationen von TetActivator und TetResponder Leitungen für bedingten gewebespezifischenFIC Manipulation der Genexpression. Wir haben vor kurzem nutzte die Teton-System für gewebespezifische Funktionen des Wnt / beta-Catenin-Signalweg in der erwachsenen Zebrafisch Regenerieren Schwanzflosse 3 zu untersuchen. In dem Protokoll hier skizzierten beschreiben wir einen Workflow für Aufbau und Nutzung der Teton-System in Zebrafisch, insbesondere für Studien der fin Regeneration. Dieses enthält detaillierte Anweisungen zum stabilen transgenen TetActivator und TetResponder Linien zu erzeugen, und ein Protokoll für die Induktion Transgen in Embryonen und erwachsenen Zebrafisch. Ferner beschreiben wir Verfahren zur Überprüfung der gewebespezifischen Genexpression in der Rippe Regenerat, einschließlich eines Protokolls zur Herstellung von Gefrierschnitten von adulten Zebrafischflossen. Zusätzlich diskutieren wir Überlegungen für den Entwurf des TetActivator Transgen, die Wahl eines Transgeneseverfahren und Nachweis von TetResponder Ausdruck. Daher ist das übergeordnete Ziel dieses Protokolls als Blaupause dienenfür den Aufbau einer funktionellen Teton Systems im Zebrafisch zu bedingten gewebespezifische Genexpression, die zu jedem Gewebe von Interesse angewendet werden kann, zu erreichen. Wir haben eine TetActivator der Vektor ermöglicht für I-SceI oder Tol2 vermittelte Erzeugung stabiler TetActivator Linien mit kurzen genomischen regulatorischen Sequenzen erzeugt (Enhancer Fragmente; Weidinger lab Plasmid Datenbank nicht 1247;. 1B). Dieses Konstrukt enthält eine TetActivator Kassette, bestehend aus dem M2 mutierten Variante der reversen Tet-Repressor-Domäne mit dem Herpes simplex-Virus VP16-Transaktivierungsdomäne-Derivat 3F [irtTAM2 (3F)] fusioniert. Expression des TetActivator (TETA) kann leicht überwacht werden, da es coexprimiert mit dem Fluorophor AmCyan aus demselben offenen Leserahmen; a p2a Peptid vermittelt ribosomalen Skipping, die bei der Herstellung von TETA und AmCyan als separate Proteine ​​bei einer 1 führen sollte: 1-Verhältnis 5,6. Das Konstrukt enthält auch eine poylinker 5 &#39;der TetActivator Kassette, um die Einführung der genomischen regulatorischen Sequenzen von Interesse unter Verwendung herkömmlicher Klonierungsverfahren zu erleichtern. , Der in ein bakterielles künstliches Chromosom rekombiniert werden können (BAC), die eine große genomische Region (; Zusätzlich haben wir ein Konstrukt, bestehend aus dem oben beschriebenen Kassetten TetActivator plus Kanamycin-Selektionskassette (. 1C Weidinger lab Plasmid Datenbank nicht 1180) erstellt in der Regel in dem Startcodon eines Gens, dessen Expressionsmuster ist durch das Transgen nachgeahmt werden). Beide Konstrukte sind von der Weidinger Labor auf Anfrage erhältlich.

<table><tbody><tr><td>Zuchtboxen</td><td>Aqua Schwarz</td><td>AquaBox 1</td><td></td></tr><tr><td>Zusammengesetztes Fluoreszenzmikroskop</td><td>z.B. Leica, Zeiss</td><td>variiert je nach Hersteller</td><td>zur Abbildung von fluoreszierenden Gewebeschnitten</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>z.B. Leica, Zeiss</td><td>variiert je nach Hersteller</td><td>zur Abbildung von fluoreszierenden Gewebeschnitten</td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>z.B. Leica, Thermo-Scientific</td><td>variiert mit dem Hersteller</td><td>für Kryosektionen</td></tr><tr><td>4', 6-Diamidino-2-phenylinodol (Dapi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>verwenden 1/5.000 in PBS zur Visualisierung von Zellkernen</td></tr><tr><td>Doxycyclin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>bereiten Brühen in 50% EtOH bei 50 mg/ml (97 mM) für TetResponder-Induktion</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td> <td>vor4% (w/v) Paraformaldehyd in PBS, pH 7,5 zur Fixierung</td></tr><tr><td>1x Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS)</td><td></td><td></td><td>1,7 mM KH2PO4, 5,2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7,5</td></tr><tr><td>1x Phosphat-Puffer Kochsalzlösung + Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td>1x PBS mit 0,1% Tween 20</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus Adhäsionsmikroskop-Objektträger</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>1014356190</td><td>für die Entnahme von Gewebeschnitten</td></tr><tr><td>Stereo-Fluoreszenzmikroskop</td>, <td>z. B. Leica, Zeiss,</td><td>variiert mit dem Hersteller</td><td>für die fluoreszenzbasierte Genotypisierung</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>, z. B. Biorad, Applied Biosystems</td><td>variiert mit dem Hersteller</td><td>für PCR-basierte Genotypisierung</td></tr><tr><td>Tissue Freezing Medium (TFM)</td><td>Triangel Biomedical Sciences</td><td>TFM-C</td><td>für die Einbettung von Gewebe Proben</td></tr><tr><td>Tricain (L-Ethyl-m-amino-benzoat-methansulfonat/MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>zur Anästhesie Anwendung bei 1 mg/ml im E3-Embryomedium</td></tr></tbody></table>

die nutzung der teton-system, um molekulare mechanismen bei zebrafisch regeneration studieren

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Der Zebrafisch ist zu einem sehr wichtigen Modellorganismus für die Erforschung der Entwicklung, Physiologie, Krankheit und Geweberegeneration von Wirbeltieren geworden. Ein umfassendes Verständnis der beteiligten molekularen und zellulären Mechanismen erfordert experimentelle Werkzeuge, die eine induzierbare, gewebespezifische Manipulation der Genexpression oder der Signalwege ermöglichen. Daher haben wir und andere das TetON-System kürzlich für den Einsatz im Zebrafisch angepasst. Das TetON-System ermöglicht die zeitlich und räumlich kontrollierte Genexpression, und wir haben dieses Werkzeug kürzlich verwendet, um gewebespezifische Funktionen des Wnt/beta-Catenin-Signalwegs während der Regeneration der Schwanzflossen von Zebrafischen zu untersuchen. Hier beschreiben wir den Arbeitsablauf für die Verwendung des TetON-Systems, um eine induzierbare, gewebespezifische Genexpression in der adulten regenerierenden Zebrafisch-Schwanzflosse zu erreichen. Dazu gehören die Generierung stabiler transgener TetActivator- und TetResponder-Linien, die Transgen-Induktion und Techniken zur Verifizierung der gewebespezifischen Genexpression im Flossenregenerat. Somit dient dieses Protokoll als Blaupause für den Aufbau eines funktionsfähigen TetON-Systems im Zebrafisch und dessen anschließende Verwendung, insbesondere für die Untersuchung der Flossenregeneration.

Um eine Funktions Teton System für gewebespezifische induzierbaren Genexpression, transgene TetActivator und TetResponder Linien etablieren müssen generiert werden (Abbildung 1A). Dies wird durch Mikroinjektion TetActivator (1B - C) erreicht oder TetResponder (1E) Konstrukte in frühen Zebrafischembryonen und anschließender Keimbahn-Integration. Funktions TetActivator Konstrukte können entweder durch Klonen von kurzen Regulationssequenzen (Enhancer-Eleme...

Hier skizzieren wir den Arbeitsablauf für die Verwendung des TetON-Systems, um eine gewebespezifische Genexpression in der adulten regenerierenden Zebrafisch-Schwanzflosse zu erreichen.

Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein funktionales TED-on-System in Zebrafischen zu etablieren, um eine bedingte, gewebespezifische Genexpression zu erreichen, wie in diesem Video am Beispiel der regenerierenden Schwanzflosse gezeigt. Dies wird zunächst durch die Erzeugung transgener Tet-Aktivator-Linien erreicht, die einen Tetracyclin-induziblen transkriptionellen Aktivator exprimieren, der mit Am-Cyanin in dem gewünschten Gewebe markiert ist, sowie durch Tet-Responder-Linien, die ein Ype-markiertes Gen der Interesse unter Kontrolle von Tet-antwortenden Elementen enthalten. Anschließend werden spezifische Kombinationen von doppelt transgenen Fischen mit Tet-Aktivator und Tet-Responder etabliert.Anschließend wird die gewebespezifische Expression des Tet-Antwortgens durch Gabe von Doxycyclin induziert. Abschließend wird die Expression des Tet-Antwortgens im Gewebe durch Herstellung von Schnittpräparaten von Flossenregeneraten überprüft. Letztendlich wird die gewebespezifische Expression des Tet-Antwortgens mittels Immunfluoreszenz sichtbar gemacht.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie der durch Hitzeschock induzierten Genexpression, liegt darin, dass das Deed-on-System eine induzierbare und reversible Genexpression auf gewebespezifische Weise ermöglicht. Diese Methode kann dazu beitragen, ein tieferes Verständnis der molekularen Signalnetzwerke zu erlangen, die die Regeneration der Flossen von Zebrabärblingen steuern, da sie die Analyse von Signalwegen und Genfunktionen in einzelnen Geweben erlaubt. Obwohl wir diese Technologie zur Untersuchung der Flossenregeneration von Zebrabärblingen verwenden, kann sie auch in vielen anderen Bereichen von großem Nutzen sein, in denen eine gewebespezifische Modulation der Genfunktion erforderlich ist. Nachdem Tet-Responder-Fischlinien gemäß dem Textprotokoll erzeugt wurden, wird die Keimbahnintegration und Induzierbarkeit des Transgens überprüft, indem einzelne Fische der G0-Generation mit einer zuvor etablierten Tet-Aktivator-Linie verpaart werden. Anschließend werden die Embryonen gewonnen und bis zu einem Entwicklungsstadium aufgezogen, in dem die Induktion des Tet-Responders beurteilt werden kann. Bereiten Sie eine 2000 x Doxycyclin-Stocklösung vor, indem Sie Doxycyclin mit 50 % Ethanol auflösen, um eine Konzentration von 50 Milligramm pro Milliliter zu erreichen.Bewahren Sie Aliquote der Docks, vor Licht geschützt, bei minus 20 Grad Celsius auf. Bereiten Sie anschließend E3-Embryomedium mit Docks in einer Endkonzentration von 25 Mikrogramm pro Milliliter vor. Gießen Sie danach den größten Teil des E3-Mediums von den Embryonen ab.Ersetzen Sie es durch Dosierungen mit E drei Medium und kehren Sie die Embryonen für mindestens sechs Stunden auf 28,5 Grad Celsius zurück. Verwenden Sie nach der Inkubation ein fluoreszierendes Stereomikroskop, um die Embryonen auf Y pet-Fluoreszenz zu prüfen. Stellen Sie mehrere stabile transgene Tet-Antwortlinien aus den gerade identifizierten Fundertieren her. Wählen Sie Linien aus, die stark induzieren und innerhalb des erwarteten Expressionsbereichs sowie zwischen einzelnen Embryonen geringe Mosaikbildung und geringe Variabilität aufweisen. Sobald TED-Aktivator- und Tet-Responder-Fischnlinien etabliert sind, kreuzen Sie Träger der Tet-Aktivatorlinie mit Trägern der Tet-Responderlinie, um doppelt transgene Fische zu erzeugen. Selektieren Sie die Embryonen, die das Tet-Aktivator-Transgen tragen, durch Nachweis der am Cyan-Fluoreszenz im Stereomikroskop und ziehen Sie die am Cyan-positiven Embryonen bis zur Adultphase auf.Identifizieren Sie doppelt transgene adulte Fische, die zusätzlich zum Tet-Aktivator den Tet-Responder tragen, mittels PCR-basierter Genotypisierung oder anhand ihrer Fähigkeit, die Expression des Tet-Responders im betreffenden Gewebe zu induzieren, um eine Schwanzflossenamputation durchzuführen. Betäuben Sie adulte Zebrafische in einem Becher mit Fischwasser, das 160 Mikrogramm pro Milliliter Trica enthält. Sobald sich der Fisch nicht mehr bewegt, übertragen Sie ihn vorsichtig mit einer Pinzette auf eine umgedrehte Petrischale und führen mit einem Skalpell eine partielle Amputation der Schwanzflosse durch, um die Behandlung mit Docs durchzuführen. Bereiten Sie Zuchtboxen mit einem Liter Fischsystemwasser vor, das 25 Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin enthält.Als negativen Kontrolle 250 Mikroliter Ethanol anstelle von Doxycyclin zu Zuchtgefäßen mit einem Liter Fischsystemwasser hinzufügen, bis zu 10 doppelt transgene Fische in jedes Zuchtgefäß überführen und die Gefäße zur Stressreduktion im Dunkeln aufbewahren. Nach mindestens sechs Stunden die behandelten Fische anästhesieren und auf eine mit nassem Aros beschichtete Schale übertragen und mit einer Pinzette die Schwanzflosse auseinanderziehen. Anschließend die Fische unter einem Fluoreszenzmikroskop daraufhin untersuchen, ob Y PET im regenerierenden Gewebe sichtbar wird.Anschließend können die Fische für weitere Behandlungen verwendet oder in das Fischhaltungssystem zurückgegeben werden, um die Induktion des Reporter-Transgens nach partieller Flossenamputation und Doks-Behandlung zu beenden. Amputieren Sie die Flossenregenerate erneut etwa vier bis fünf knöcherne Segmente proximal zur ursprünglichen Amputationsebene und zu einem Zeitpunkt, der von Ihrem experimentellen Aufbau abhängt, wie zuvor in diesem Video beschrieben. Legen Sie die Geweberegenerate mit einer Pinzette vorsichtig flach in eine kleine Petrischale, wobei Sie nur den Stumpfteil des Gewebes anfassen. Die Schale soll 4 % (Gewicht pro Volumen) PFA in PBS enthalten, und die Fixierung erfolgt über Nacht bei vier Grad Celsius. Am folgenden Tag waschen Sie die Regenerate zweimal mit PBS, bevor Sie sie zur Entmineralisierung der Knochenmatrix über Nacht bei vier Grad Celsius in 0,5 M E-D-T-A-PBS überführen. Danach inkubieren Sie die Regenerate bei Raumtemperatur jeweils 30 Minuten in einer sukzessiven Sucrose-PBS-Reihe und schließlich 30 Minuten in einem Gemisch aus gleichen Teilen 30 %iger Sucrose-PBS und Gewebeeinbettungsmedium.Überführen Sie die Flossen in ein Gewebefriere medium und inkubieren Sie sie mindestens zwei Stunden bei vier Grad Celsius. Danach platzieren Sie Kryoschneidformen auf einem Objektträger und füllen diese mit Gewebefriere medium. Überführen Sie die Regenerate in die Kryoschneidformen und orientieren Sie das Gewebe, um longitudinale oder transversale Schnitte zu erhalten.Stellen Sie sicher, dass das Regenerat gerade ist, um das Schneiden von Schnitten zu erleichtern. Gemeinsam mit dem Objektträger bringen Sie die Kryokassetten auf ein Metallgestell, das auf einer Trockeneis-Schicht steht, um den Gefriervorgang einzuleiten. Sobald das Medium fest ist, bringen Sie die Kryokassetten zurück auf Raumtemperatur, um das Auftauen des Mediums an der Grenzfläche zum Kunststoffmedium zu ermöglichen.Drücken Sie dann mithilfe eines Instruments wie einem Stift den gefrorenen Block aus der Kryoform und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius, bis er mit einem Kryomikrotom geschnitten wird. Sammeln Sie 10 bis 14 Mikrometer dicke Schnitte auf Haftobjektträgern und bewahren Sie die Objektträger bei minus 20 Grad Celsius auf, bis sie benötigt werden. Zur Charakterisierung der Tet-Antwort auf Flossenschnitten behandeln Sie die Schnitte 30 Minuten lang mit auf minus 20 Grad Celsius gekühltem 100 %igem Methanol.Entfernen Sie die Flüssigkeit vorsichtig mit einem Papiertuch. Waschen Sie die Schnitte anschließend zweimal mit PBT und einmal mit PBS, jeweils fünf Minuten lang. Inkubieren Sie die Schnitte 10 Minuten in Dappy, bevor Sie sie zweimal mit PBS, jeweils 10 Minuten lang, waschen.Verwenden Sie anschließend den Antifa-Montagemittel und ein Deckglas, um die Proben zu montieren, bevor Sie mit konfokaler oder Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie die Proben abbilden, nachdem ein funktionelles TET-On-System in Zebrafischen etabliert wurde. Dieses System kann verwendet werden, um die Funktion von Genen oder Signalwegen in einzelnen Geweben zu testen. Wie hier gezeigt, induziert der HER-4.3-Promotor-gesteuerte Tet-Aktivator die Expression des TED-Responders nur in einer Untermenge von Geweben; YFP-Fluoreszenz wird im proliferativen proximalen Blastem nachgewiesen, während das distale Blastem und das Epidermis frei von Expression sind.Die Expression des WINT-Beta-Catenin-Antagonisten wirkt in einem der HER-4.3-Domänen, die die proliferierenden Zellen der Blastema enthält, hat jedoch überraschenderweise keine Auswirkung auf die proliferierenden Regenerationszellen. Dies legt nahe, dass Wind-Betain und die Signalübertragung in den proliferierenden proximalen Blastemazellen keine wesentliche Rolle bei der Regulation der Proliferation der Blasten-ML-Zellen spielen. Im Gegensatz dazu stört die Verwendung der Ubiquitin-Promotor-gesteuerten Tet-Aktivatorlinie zur Induktion der Axin-1-Expression in allen Geweben des Flossenregenerats die proliferierenden Regenerationszellen stark.Außerdem stört die Expression von Axon 1 in der HER 4.3-Domäne, die Osteoblasten nicht einschließt, stark die Knochenbildung im Regenerat. Somit zeigt die gewebespezifische Störung der Wind-Signalübertragung mittels des TE-on-Systems unerwartete indirekte Funktionen der Wind-Signalübertragung bei der Regulation der Zellproliferation und der Knochenregeneration auf. Beherrscht man diese Technik einmal, kann sie zur induzierbaren, gezielten Genexpression in jedem beliebigen Gewebe verwendet werden.Wir haben diese Methode erfolgreich angewandt, um die gewebespezifischen Funktionen der Windbett-Nikotinsignalübertragung in der regenerierenden Schwanzflosse von S-Fischen zu untersuchen. Die Anwendung dieser Methode wird dazu beitragen, ein umfassenderes Verständnis der molekularen Determinanten zu erlangen, die die Geweberegeneration regulieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir beschreiben ein Verfahren zur bedingten Knockdown die Expression eines Zielproteins im Erwachsenenalter Zebrafisch Flossenregeneration. Diese Technik beinhaltet Mikrospritzvorrichtung und Elektroporation Antisense-Oligonukleotid in Morpholinos Flossengewebes das Testen des Proteins Rolle in verschiedenen Stadien der Flossenregeneration, einschließlich Wundheilung, Blastembildung und regenerative Auswachsen ermöglicht.

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in das Regenerations Adult Zebrafisch Leitwerk

Die hier vorgestellte Methode umfasst die genaue Verletzung des Lebens Zebrafischembryonen mit hochenergetischer Laserpulse und der anschließenden Analyse dieser Verletzungen und deren Wiederherstellung mit der Zeit. Wir zeigen auch, wie genetisch markierten einzelne oder Gruppen von Skelettmuskelzellen kann während und nach der Laser-Licht induzierten Schäden verfolgt werden.

Laser-Schädigung der Zebrafisch Embryonale Skeletal Muscle

Nach Durchtrennung des Rücken, erwachsenen Zebrafisch haben die funktionelle Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der Larven Transparenz und schnellere Erholung zu nehmen, stellen wir ein Verfahren zur Durchtrennung des Rückenmarks Larven. Nach Durchtrennung beobachten wir sensorischen Erholung ab 2 Tage nach der Verletzung, und C-Bogen-Bewegung um 3 Tage nach der Verletzung.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Ein anpassungsfähiges reversen genetischen Methode für Zebrafisch-Gen-Funktion während der späteren Phasen der Entwicklung und physiologischen Homöostase wie Geweberegeneration unter Verwendung intraventrikuläre Injektion von Gen-spezifischen morpholinos beurteilen.

Rückwärts Genetische Morpholino Ansatz mit Herz ventrikuläre Injektion auf mehrere Schwer zu Zielgeweben in der Zebrafisch-Larve Transfektion

Um die zellulären und molekularen Mechanismen der Neurogenese und Regeneration adulter Zebrafische zu beleuchten, haben wir ein Protokoll für invasive Operationen entwickelt, die mechanische Verletzungen im adulten Telencephalon des Zebrafisches verursachen, und die anschließende Überwachung von Veränderungen in der gestochenen Hemisphäre durch Immunhistochemie oder in situ Hybridisierung.

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Hier stellen wir eine zuverlässige Methode vor, um die Nierenregeneration bei Erwachsenen zu untersuchen, indem eine akute Nierenschädigung durch Gentamicin-Injektion induziert wird. Wir zeigen, dass die Schädigung von der Gentamicin-Dosierung und der Umgebungstemperatur abhängt, indem wir in situ Hybridisierung verwenden, um lhx1a+ zu markieren und neue Nephrone zu entwickeln.

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erfassung der Dynamik der Regeneration von Schwanzflossen von Zebrafischlarven auf einer Ganzgewebeskala mit Hilfe von Hellfeld-basierter Stereomikroskopie. Diese Technik ermöglicht es, die Regenerationsdynamik mit einer Einzelzellauflösung zu erfassen. Diese Methodik kann an jedes Stereomikroskop angepasst werden, das mit einer CCD-Kamera und einer Zeitraffer-Software ausgestattet ist.

Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, die bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie beeinträchtigt sind, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Ein mechanisches Hirnverletzungsmodell im erwachsenen Zebrafisch wird beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die ihre hohe Regenerationsfähigkeit regulieren. Die Methode erklärt, wie eine Stichwundenverletzung im optischen Tectum mehrerer Arten kleiner Fische erzeugt wird, um die regenerativen Reaktionen mittels fluoreszierender Immunfärbung zu bewerten.

Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion gewebespezifischer und hochreproduzierbarer Verletzungen in Zebrafischlarven unter Verwendung eines Laserläsionssystems in Kombination mit einer automatisierten mikrofluidischen Plattform für die Larvenhandhabung.

Kontrollierte halbautomatische laserinduzierte Verletzungen zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischlarven

Hier stellen wir ein Protokoll zur Transplantation von Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in Zebrafischembryonen und -larven in jedem Stadium zwischen mindestens 1 und 7 Tagen nach der Befruchtung vor.

Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen

Erfahren Sie, wie das TetON-System in Zebrafischen zur gewebespezifischen Genexpression in der regenerierenden Schwanzflosse eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht induzierbare und reversible Genregulation zur Untersuchung molekularer Mechanismen.

Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

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