Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein funktionales TED-on-System in Zebrafischen zu etablieren, um eine bedingte, gewebespezifische Genexpression zu erreichen, wie in diesem Video am Beispiel der regenerierenden Schwanzflosse gezeigt. Dies wird zunächst durch die Erzeugung transgener Tet-Aktivator-Linien erreicht, die einen Tetracyclin-induziblen transkriptionellen Aktivator exprimieren, der mit Am-Cyanin in dem gewünschten Gewebe markiert ist, sowie durch Tet-Responder-Linien, die ein Ype-markiertes Gen der Interesse unter Kontrolle von Tet-antwortenden Elementen enthalten. Anschließend werden spezifische Kombinationen von doppelt transgenen Fischen mit Tet-Aktivator und Tet-Responder etabliert.

Anschließend wird die gewebespezifische Expression des Tet-Antwortgens durch Gabe von Doxycyclin induziert. Abschließend wird die Expression des Tet-Antwortgens im Gewebe durch Herstellung von Schnittpräparaten von Flossenregeneraten überprüft. Letztendlich wird die gewebespezifische Expression des Tet-Antwortgens mittels Immunfluoreszenz sichtbar gemacht.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie der durch Hitzeschock induzierten Genexpression, liegt darin, dass das Deed-on-System eine induzierbare und reversible Genexpression auf gewebespezifische Weise ermöglicht. Diese Methode kann dazu beitragen, ein tieferes Verständnis der molekularen Signalnetzwerke zu erlangen, die die Regeneration der Flossen von Zebrabärblingen steuern, da sie die Analyse von Signalwegen und Genfunktionen in einzelnen Geweben erlaubt. Obwohl wir diese Technologie zur Untersuchung der Flossenregeneration von Zebrabärblingen verwenden, kann sie auch in vielen anderen Bereichen von großem Nutzen sein, in denen eine gewebespezifische Modulation der Genfunktion erforderlich ist.

Nachdem Tet-Responder-Fischlinien gemäß dem Textprotokoll erzeugt wurden, wird die Keimbahnintegration und Induzierbarkeit des Transgens überprüft, indem einzelne Fische der G0-Generation mit einer zuvor etablierten Tet-Aktivator-Linie verpaart werden. Anschließend werden die Embryonen gewonnen und bis zu einem Entwicklungsstadium aufgezogen, in dem die Induktion des Tet-Responders beurteilt werden kann. Bereiten Sie eine 2000 x Doxycyclin-Stocklösung vor, indem Sie Doxycyclin mit 50 % Ethanol auflösen, um eine Konzentration von 50 Milligramm pro Milliliter zu erreichen.

Bewahren Sie Aliquote der Docks, vor Licht geschützt, bei minus 20 Grad Celsius auf. Bereiten Sie anschließend E3-Embryomedium mit Docks in einer Endkonzentration von 25 Mikrogramm pro Milliliter vor. Gießen Sie danach den größten Teil des E3-Mediums von den Embryonen ab.

Ersetzen Sie es durch Dosierungen mit E drei Medium und kehren Sie die Embryonen für mindestens sechs Stunden auf 28,5 Grad Celsius zurück. Verwenden Sie nach der Inkubation ein fluoreszierendes Stereomikroskop, um die Embryonen auf Y pet-Fluoreszenz zu prüfen. Stellen Sie mehrere stabile transgene Tet-Antwortlinien aus den gerade identifizierten Fundertieren her.

Wählen Sie Linien aus, die stark induzieren und innerhalb des erwarteten Expressionsbereichs sowie zwischen einzelnen Embryonen geringe Mosaikbildung und geringe Variabilität aufweisen. Sobald TED-Aktivator- und Tet-Responder-Fischnlinien etabliert sind, kreuzen Sie Träger der Tet-Aktivatorlinie mit Trägern der Tet-Responderlinie, um doppelt transgene Fische zu erzeugen. Selektieren Sie die Embryonen, die das Tet-Aktivator-Transgen tragen, durch Nachweis der am Cyan-Fluoreszenz im Stereomikroskop und ziehen Sie die am Cyan-positiven Embryonen bis zur Adultphase auf.

Identifizieren Sie doppelt transgene adulte Fische, die zusätzlich zum Tet-Aktivator den Tet-Responder tragen, mittels PCR-basierter Genotypisierung oder anhand ihrer Fähigkeit, die Expression des Tet-Responders im betreffenden Gewebe zu induzieren, um eine Schwanzflossenamputation durchzuführen. Betäuben Sie adulte Zebrafische in einem Becher mit Fischwasser, das 160 Mikrogramm pro Milliliter Trica enthält. Sobald sich der Fisch nicht mehr bewegt, übertragen Sie ihn vorsichtig mit einer Pinzette auf eine umgedrehte Petrischale und führen mit einem Skalpell eine partielle Amputation der Schwanzflosse durch, um die Behandlung mit Docs durchzuführen. Bereiten Sie Zuchtboxen mit einem Liter Fischsystemwasser vor, das 25 Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin enthält.

Als negativen Kontrolle 250 Mikroliter Ethanol anstelle von Doxycyclin zu Zuchtgefäßen mit einem Liter Fischsystemwasser hinzufügen, bis zu 10 doppelt transgene Fische in jedes Zuchtgefäß überführen und die Gefäße zur Stressreduktion im Dunkeln aufbewahren. Nach mindestens sechs Stunden die behandelten Fische anästhesieren und auf eine mit nassem Aros beschichtete Schale übertragen und mit einer Pinzette die Schwanzflosse auseinanderziehen. Anschließend die Fische unter einem Fluoreszenzmikroskop daraufhin untersuchen, ob Y PET im regenerierenden Gewebe sichtbar wird.

Anschließend können die Fische für weitere Behandlungen verwendet oder in das Fischhaltungssystem zurückgegeben werden, um die Induktion des Reporter-Transgens nach partieller Flossenamputation und Doks-Behandlung zu beenden. Amputieren Sie die Flossenregenerate erneut etwa vier bis fünf knöcherne Segmente proximal zur ursprünglichen Amputationsebene und zu einem Zeitpunkt, der von Ihrem experimentellen Aufbau abhängt, wie zuvor in diesem Video beschrieben. Legen Sie die Geweberegenerate mit einer Pinzette vorsichtig flach in eine kleine Petrischale, wobei Sie nur den Stumpfteil des Gewebes anfassen. Die Schale soll 4 % (Gewicht pro Volumen) PFA in PBS enthalten, und die Fixierung erfolgt über Nacht bei vier Grad Celsius. Am folgenden Tag waschen Sie die Regenerate zweimal mit PBS, bevor Sie sie zur Entmineralisierung der Knochenmatrix über Nacht bei vier Grad Celsius in 0,5 M E-D-T-A-PBS überführen. Danach inkubieren Sie die Regenerate bei Raumtemperatur jeweils 30 Minuten in einer sukzessiven Sucrose-PBS-Reihe und schließlich 30 Minuten in einem Gemisch aus gleichen Teilen 30 %iger Sucrose-PBS und Gewebeeinbettungsmedium.

Überführen Sie die Flossen in ein Gewebefriere medium und inkubieren Sie sie mindestens zwei Stunden bei vier Grad Celsius. Danach platzieren Sie Kryoschneidformen auf einem Objektträger und füllen diese mit Gewebefriere medium. Überführen Sie die Regenerate in die Kryoschneidformen und orientieren Sie das Gewebe, um longitudinale oder transversale Schnitte zu erhalten.

Stellen Sie sicher, dass das Regenerat gerade ist, um das Schneiden von Schnitten zu erleichtern. Gemeinsam mit dem Objektträger bringen Sie die Kryokassetten auf ein Metallgestell, das auf einer Trockeneis-Schicht steht, um den Gefriervorgang einzuleiten. Sobald das Medium fest ist, bringen Sie die Kryokassetten zurück auf Raumtemperatur, um das Auftauen des Mediums an der Grenzfläche zum Kunststoffmedium zu ermöglichen.

Drücken Sie dann mithilfe eines Instruments wie einem Stift den gefrorenen Block aus der Kryoform und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius, bis er mit einem Kryomikrotom geschnitten wird. Sammeln Sie 10 bis 14 Mikrometer dicke Schnitte auf Haftobjektträgern und bewahren Sie die Objektträger bei minus 20 Grad Celsius auf, bis sie benötigt werden. Zur Charakterisierung der Tet-Antwort auf Flossenschnitten behandeln Sie die Schnitte 30 Minuten lang mit auf minus 20 Grad Celsius gekühltem 100 %igem Methanol.

Entfernen Sie die Flüssigkeit vorsichtig mit einem Papiertuch. Waschen Sie die Schnitte anschließend zweimal mit PBT und einmal mit PBS, jeweils fünf Minuten lang. Inkubieren Sie die Schnitte 10 Minuten in Dappy, bevor Sie sie zweimal mit PBS, jeweils 10 Minuten lang, waschen.

Verwenden Sie anschließend den Antifa-Montagemittel und ein Deckglas, um die Proben zu montieren, bevor Sie mit konfokaler oder Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie die Proben abbilden, nachdem ein funktionelles TET-On-System in Zebrafischen etabliert wurde. Dieses System kann verwendet werden, um die Funktion von Genen oder Signalwegen in einzelnen Geweben zu testen. Wie hier gezeigt, induziert der HER-4.3-Promotor-gesteuerte Tet-Aktivator die Expression des TED-Responders nur in einer Untermenge von Geweben; YFP-Fluoreszenz wird im proliferativen proximalen Blastem nachgewiesen, während das distale Blastem und das Epidermis frei von Expression sind.

Die Expression des WINT-Beta-Catenin-Antagonisten wirkt in einem der HER-4.3-Domänen, die die proliferierenden Zellen der Blastema enthält, hat jedoch überraschenderweise keine Auswirkung auf die proliferierenden Regenerationszellen. Dies legt nahe, dass Wind-Betain und die Signalübertragung in den proliferierenden proximalen Blastemazellen keine wesentliche Rolle bei der Regulation der Proliferation der Blasten-ML-Zellen spielen. Im Gegensatz dazu stört die Verwendung der Ubiquitin-Promotor-gesteuerten Tet-Aktivatorlinie zur Induktion der Axin-1-Expression in allen Geweben des Flossenregenerats die proliferierenden Regenerationszellen stark.

Außerdem stört die Expression von Axon 1 in der HER 4.3-Domäne, die Osteoblasten nicht einschließt, stark die Knochenbildung im Regenerat. Somit zeigt die gewebespezifische Störung der Wind-Signalübertragung mittels des TE-on-Systems unerwartete indirekte Funktionen der Wind-Signalübertragung bei der Regulation der Zellproliferation und der Knochenregeneration auf. Beherrscht man diese Technik einmal, kann sie zur induzierbaren, gezielten Genexpression in jedem beliebigen Gewebe verwendet werden.

Wir haben diese Methode erfolgreich angewandt, um die gewebespezifischen Funktionen der Windbett-Nikotinsignalübertragung in der regenerierenden Schwanzflosse von S-Fischen zu untersuchen. Die Anwendung dieser Methode wird dazu beitragen, ein umfassenderes Verständnis der molekularen Determinanten zu erlangen, die die Geweberegeneration regulieren.