Next Generation Sequencing für den Nachweis von Mutationen umsetzbare in fester und flüssiger Tumoren

Das übergeordnete Ziel dieses zielgerichteten Amplikon-Assays der nächsten Generation ist es, pathogene Mutationen in Patiententumoren für den therapeutischen Einsatz zu erkennen, einschließlich Diagnose, Prognose und Ansprechen auf eine zielgerichtete Therapie. Diese Methode beantwortet wichtige Fragen, z. B. ob ein Patient eine Mutation in einem Gen hat, die von einer gezielten oder alternativen Therapie profitieren kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass umsetzbare Mutationen, sowohl häufige als auch seltene, in vielen Genen in jedem Tumorgewebe mit einem einzigen Assay nachgewiesen werden können.

Da die Techniken und die Technologie so komplex und die Schritte so schwer zu erlernen sind, ist es wichtig, diese Methode visuell zu demonstrieren. Dies ist ein entscheidender Moment in der Weiterentwicklung der medizinischen Onkologie. Mit der Einführung von Next Generation Sequencing in der Klinik werden wir mehr und bessere Krebsbehandlungen für unsere Patienten haben.

Unsere CPD-Technologen, Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy und Joe Grubb, werden dieses Verfahren demonstrieren. Ich werde auch bei diesem Prozess helfen, um die komplexeren Teile des Assays zu zeigen. Nach der Extraktion der genomischen DNA gemäß dem Textprotokoll werden gemäß dem Protokoll des Herstellers zwei Mikroliter der extrahierten DNA auf ein Fluorometer geleitet, um die Arbeitskonzentration der Probe zu erhalten.

Um eine Amplikon-Bibliothek zu erstellen, fügen Sie in einer 96-Well-Platte mit halbem Rand, der sogenannten Hyb-Platte, das erforderliche Volumen an niedrigem EDTA-TE, fünf Mikroliter des Oligo-Rohrs des Panels und 100 bis 250 Nanogramm genomische DNA in jede entsprechende Vertiefung hinzu. Dies ist der wichtigste Schritt, da jede Verwechslung hier schwerwiegende Folgen haben wird. Nach der Zugabe der Oligo-Hybridisierung für die Sequenzierung von Reagenz 1 und dem Schleudern gemäß dem Textprotokoll inkubieren Sie die Hyb-Platte im vorgeheizten Hybridisierungsinkubator bei 95 Grad Celsius für eine Minute.

Nachdem Sie den Inkubator langsam auf 40 Grad Celsius abgekühlt haben, nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und übertragen Sie das gesamte Volumen jeder Probe von der Hyb-Platte in die Mitte der zuvor vorbereiteten entsprechenden, vorgewaschenen Filterplatteneinheit (FPU). Decken Sie die FPU ab und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei 2.250 mal G und 20 Grad Celsius. Fügen Sie dann 45 Mikroliter SW1 hinzu und zentrifugieren Sie erneut.

Nach einer zweiten Wäsche mit SW1 und einer Wäsche mit UB1 geben Sie 45 Mikroliter Extension Ligation Mix 3 in jede Probenvertiefung und spritzen Sie es zum Mischen dreimal auf und ab. Verwenden Sie selbstklebende Aluminiumfolie, um die Platte zu versiegeln, und inkubieren Sie die gesamte FPU-Baugruppe 45 Minuten lang in einem vorgeheizten 37-Grad-Inkubator. Um die PCR-Amplifikation zu indizieren, ordnen Sie die Primer in der Index-Amplifikationsplatte (IAP-Vorrichtung) an und aliquotieren Sie die verwendeten Indizes in die entsprechenden Vertiefungen in der Platte, fügen Sie dann 22 Mikroliter des PCR-Mastermix, 2E12, hinzu und spritzen Sie ihn dreimal auf und ab.

Nachdem Sie die 45-minütige Extensionsligationsreaktion gemäß dem Textprotokoll heruntergeschleudert haben, fügen Sie 25 Mikroliter 50 Millimolar Natriumhydroxid in jede Probenvertiefung der FPU hinzu und spritzen Sie es mindestens sechsmal auf und ab, wobei Sie sicherstellen, dass die Pipettenspitze mit der Membran in Kontakt kommt. Pipettieren Sie dann mit leicht geneigter Platte und einer Mehrkanalpipette auf 20 Mikroliter das Natriumhydroxid in der FPU-Platte mindestens sechsmal auf und ab. Übertragen Sie die Elution von der FPU in die entsprechende Spalte des IAP.

Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die DNA gründlich mit dem PCR-Mastermix zu kombinieren, bevor Sie das im Textprotokoll beschriebene PCR-Programm ausführen. Nachdem Sie die Ausbeute der Bibliothek überprüft und die Proben mit magnetischen Reinigungsperlen gemäß dem Textprotokoll inkubiert haben, fügen Sie 30 Mikroliter EBT zu jeder Vertiefung der gewaschenen Kügelchen hinzu. Pipettieren Sie ein paar Mal auf und ab, um sicherzustellen, dass sich die Kügelchen von der Seite des Röhrchens lösen.

Sobald die Platte mit und dann ohne Schütteln inkubiert wurde, legen Sie die Platte auf den Magnetständer und übertragen Sie 20 Mikroliter des Überstands auf eine ganz neue Platte, die als Library Normalization Plate (LNP) bezeichnet wird. Nach der Herstellung der Normalisierungsmischung mit intermittierender Inversion und Vortexen der Lösung werden 45 Mikroliter zu jeder Probe des LNP hinzugefügt. Verwenden Sie dann eine durchsichtige Klebefolie, um die Platte zu versiegeln, und schütteln Sie sie 30 Minuten lang bei 1.800 U/min.

Entfernen Sie nach dem Waschen der Kügelchen das LNP vom Magnetständer und geben Sie zum Eluieren der Probe 30 Mikroliter frisches 0,1 normales Natriumhydroxid in jede Vertiefung. Schütteln Sie dann den LNP fünf Minuten lang bei 1.800 U/min. Setzen Sie den LNP wieder auf den Magnetständer und übertragen Sie nach dem Entfernen des Überstands 30 Mikroliter der Elution in den zuvor vorbereiteten Library Normalization Storage Buffer 1 in der Storage Plate.

Biegen Sie die Platte nach unten und geben Sie dann fünf Mikroliter jeder zu sequenzierenden Probe in ein markiertes 1,5-Milliliter-Röhrchen der Pooled Amplicon Library (PAL). Je nachdem, welche Sequenzierchemie verwendet wird, fügen Sie vier bis 10 Mikroliter des PAL zu 590 bis 596 Mikrolitern Puffer HT1 hinzu. Reinigen und beladen Sie die Durchflusszelle.

Laden Sie die Reagenzien. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um den Sequenzierungslauf zu starten. Nachdem der Sequenzierungslauf abgeschlossen ist, führen Sie die Bioinfomatics-Pipeline aus.

Analysieren Sie die Laufstatistiken, um sicherzustellen, dass die sequenzierte Bibliothek die im Labor ermittelten Qualitätskontrollmetriken bestanden hat. Überprüfen Sie schließlich in einem genomischen Datenviewer jede Variante manuell, indem Sie die BAM-Dateien anzeigen. Dies ist eine Zusammenfassung der wichtigsten Laufstatistiken, ohne die mittlere Abdeckung, die verwendet wird, um zu bestimmen, ob eine Probe der Bibliotheksvorbereitung bestanden hat QC.As hier für Fall eins zu sehen, entdeckte die Bioinformatik vier meldepflichtige AML-assoziierte Mutationen.

Eine Missense-Mustation in FLT3, eine Missense-Mutation in IDH2 und eine Frameshift-Mutation in NPM1. Mutationen in FLT3 werden bei etwa 25 % der erwachsenen Patienten mit AML beobachtet. Die prognostische Bedeutung von FLT3-Kinase-Domänen-Punktmutationen, wie sie bei diesem AML-Patienten beobachtet wurde, hat einen unklaren Einfluss auf die Prognose

Isocitrat-Dehydrogenase 2 oder IDH2 kodiert für einen epigenetischen Modifikator, der bei AML häufig mutiert ist. Mutationen im Gen für Nucleophosmin, kurz NPM1, sind eine der am häufigsten erworbenen Mutationen bei AML. In dieser Tabelle sind alle exonischen Varianten für Fall Zwei aufgeführt.

Es wurden zwei krankheitsassoziierte Mutationen nachgewiesen. Eine In-Frame-Insertion von ERBB2 im Exon 20 und eine Missense-Mutation in TP53. HER2/neu oder ERBB2 kodiert für einen Tyrosinkinase-Rezeptor.

Aktivierende HER2/neu-Exon-20-Insertionen werden bei zwei bis 4 % der Lungenadenokarzinome beobachtet und sind für die Mehrzahl der bei Lungenkrebs beobachteten HER2/neu-Mutationen verantwortlich. TP53-Veränderungen sind auch bei Krebs häufig. Es ist notwendig, genau auf die Qualität und die Quantität der extrahierten DNA zu achten.

Dies ist besonders wichtig für FFPE-Proben. Wir versuchen oft stark abgebaut mit einer Variablen die DNA-Ausbeute. Während des Validierungsprozesses des klinischen Assays sollten Metriken für die DNA-Qualität und -Quantität für jede Probe festgelegt werden, bevor die DNA in die Bibliotheksvorbereitung überführt wird.

Zusätzlich zur Bibliotheksvorbereitung ist es wichtig, einen bioinfomatischen Spionageplan zu validieren, indem Cutoff-Werte für den Sequenzlauf, Qualitätskontrollstatistiken, Statistiken zur Bibliotheksvorbereitung, die Muttiefe eines Amplicons und die minimale meldepflichtige Allelfrequenz bestimmt werden. Einmal gemeistert, kann die Bibliotheksvorbereitung an einem Arbeitstag durchgeführt werden. Der gesamte Assay-Workflow erfordert jedoch mehr Zeit für die DNA-Extraktion, Sequenzierung, Datenverarbeitung und Variantenprüfung.

Dieses Verfahren ist so konzipiert, dass nur die genomischen DNA-Mutationen an bestimmten wichtigen Hotspots untersucht werden. Andere Massen, die RNA verwenden, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie eine differentielle Expression von Genen, die Assoziation der Risikotumoren und die strukturellen Umlagerungen zu beantworten. Große Fortschritte zeichnen sich am Horizont ab.

Die Einführung der Automatisierung und die Integration eines einzigartigen molekularen Barcodes wird es Laboren ermöglichen, die Durchlaufzeit zu verkürzen, weniger Probeneingabe zu benötigen und Varianten mit einer sehr niedrigen Allelfrequenz zu erkennen. Der Nachweis von krankheitsassoziierten Mutationen in Krebsproben ist seit Jahrzehnten Standard in der Therapie. NGS ist ein weniger verzerrter Ansatz zur parallelen Sequenzierung mehrerer Gene, die mit vielen Krebsarten assoziiert sind, was zur Identifizierung mehrerer Mutationen und besserer Behandlungen für Patienten führt.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.