Name: Next Generation Sequencing für den Nachweis von Mutationen umsetzbare in fester und flüssiger Tumoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Lernen Sie Next-Generation-Sequencing zur Detektion von Mutationen in festen Tumoren und hämatologischen Malignomen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung therapeutisch relevanter Genveränderungen für die präzisionsonkologische Behandlung.

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Die Autoren möchten die Hilfe von Daniel Wild anerkennen für bei der Herstellung des Manuskripts und Hilfe zu lesen.

<ol><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).</li>
<li>Campbell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patterns+and+dynamics+of+genomic+instability+in+metastatic+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The patterns and dynamics of genomic instability in metastatic pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1109-1113 (2010).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+relapsed+acute+myeloid+leukaemia+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing.</a> Nature. 481 (7382), 506-509 (2012).</li>
<li>Frampton, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+clinical+cancer+genomic+profiling+test+based+on+massively+parallel+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing.</a> Nature Biotechnol. 31 (11), 1023-1031 (2013).</li>
<li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> N Engl J Med. 366 (12), 1079-1089 (2012).</li>
<li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC+%28the+Catalogue+of+Somatic+Mutations+in+Cancer+%29%3A+a+resource+to+investigate+acquired+mutations+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COSMIC (the Catalogue of Somatic Mutations in Cancer ): a resource to investigate acquired mutations in human cancer.</a> Nucleic Acids Res. 38 (Database Issue), 652-657 (2010).</li>
<li>Shih, A. H., Abdel-wahab, O., Patel, J. P., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mutations+in+epigenetic+regulators+in+myeloid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of mutations in epigenetic regulators in myeloid malignancies.</a> Nat Rev Cancer. 12 (9), 599-612 (2012).</li>
<li>Liersch, R., Müller-Tidow, C., Berdel, W. E., Krug, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+for+acute+myeloid+leukaemia+in+adults+-+biological+significance+and+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors for acute myeloid leukaemia in adults - biological significance and clinical use.</a> Br J Haematol. 165 (1), 17-38 (2014).</li>
<li>Bacher, U., Schnittger, S., Haferlach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics in acute myeloid leukemia.</a> Curr Opin Oncol. 22 (6), 646-655 (2010).</li>
<li>Subramanian, J., Govindan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+in+%26%2334%3BNever-smokers%26%2334%3B%3A+a+unique+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+%28Williston+Park%29%22%5BJournal%5D)">Lung cancer in &#34;Never-smokers&#34;: a unique entity.</a> Oncology (Williston Park). 24 (1), 29-35 (2010).</li>
<li>Sakashita, S., Sakashita, M., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+pathology+of+non-small+cell+lung+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Genes and pathology of non-small cell lung carcinoma.</a> Semin Oncol. 41 (1), 28-39 (2014).</li>
<li>Arcila, M. E., Chaft, J. E., Nafa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+clinicopathologic+associations%2C+and+molecular+spectrum+of+ERBB2+%28HER2%29+tyrosine+kinase+mutations+in+lung+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence clinicopathologic associations, and molecular spectrum of ERBB2 (HER2) tyrosine kinase mutations in lung adenocarcinomas.</a> Clin Cancer Res. 18 (18), (2012).</li>
<li>Gandhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+neratinib+in+combination+with+temsirolimus+in+patients+with+human+epidermal+growth+factor+receptor+2-dependent+and+other+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of neratinib in combination with temsirolimus in patients with human epidermal growth factor receptor 2-dependent and other solid tumors.</a> J Clin Oncol. 32 (2), 68-75 (2014).</li>
<li>Sheikhha, M. H., Awan, A., Tobal, K., Liu Yin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+FLT3+ITD+and+D835+mutations+in+AML+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+J%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of FLT3 ITD and D835 mutations in AML patients.</a> Hematol J. 4 (1), 41-46 (2003).</li>
<li>Mazières, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+that+harbors+an+HER2+mutation+epidemiologic+characteristics+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lung cancer that harbors an HER2 mutation epidemiologic characteristics and therapeutic perspectives.</a> J Clin Oncol. 31 (16), 1-8 (2014).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 495-500 (2011).</li>
<li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+exploring+the+world%27s+knowledge+of+somatic+mutations+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COSMIC: exploring the world's knowledge of somatic mutations in human cancer.</a> Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D805-D811 (2014).</li>
<li>Daber, R., Sukhadia, S., Morrissette, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+limitations+of+next+generation+sequencing+informatics%2C+an+approach+to+clinical+pipeline+validation+using+artificial+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Understanding the limitations of next generation sequencing informatics, an approach to clinical pipeline validation using artificial data sets.</a> Cancer Genetics. 206 (12), 441-448 (2013).</li>
<li>Haraksingh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Mapping+of+Copy+Number+Variation+in+Humans%3A+Comparative+Analysis+of+High+Resolution+Array+Platforms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Mapping of Copy Number Variation in Humans: Comparative Analysis of High Resolution Array Platforms.</a> PLoS ONE. 6 (11), e27859(2011).</li>
<li>de Leeuw, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+Array+Analysis+in+Constitutional+and+Cancer+Genome+Diagnostics+-+Copy+Number+Variants%2C+Genotyping+and+Quality+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">SNP Array Analysis in Constitutional and Cancer Genome Diagnostics - Copy Number Variants, Genotyping and Quality Control.</a> Cytogenet Genome Res. 135 (3-4), 212-221 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

<html> Da die beiden in diesem Manuskript beschrieben NGS Tests klinisch angeboten werden, ist die wichtigste praktische Überlegung Qualitätskontrolle. Insbesondere müssen daraufhin geprüft werden, um die Qualität und die Menge der extrahierten DNA bezahlt werden. Dies ist besonders wichtig für FFPE-Proben, die häufig mit variablen DNA-Ausbeute stark abgebaut werden. Eine Isopropanolpräzipitation Methode wurde zu maximieren, um DNA-Ausbeute von FFPE-Proben als spaltenbasierte Methoden manchmal mit begrenzten Elutionsvolumina zu DNA Scher gefunden wurden entwickelt, zu führen. Daher die meiste Zeit, wenn eine Probe zu niedrige Konzentration ergibt oder ist zu abgebauten für den Assay, ist es sehr wahrscheinlich aufgrund der Gewebegröße, Typ oder Fixierung und nicht das Extraktionsverfahren. Für Blut / Knochenmark - Proben, wenn ein Extraktionsversagen ist, ist es normalerweise wegen einer Probe ist hemodilute (dh nicht ausreichende Anzahl von weißen Blut oder Tumorzellen in diesem DRAW) oder ablatiert chemo. . Nt &quot;&gt; Bei der Validierung, Cutoffs für die Akzeptanz von DNA-Qualität und Menge festgelegt werden Die empfohlene Eingabe von 100-250 ng oft wird in dem Test verwendet, aber wenn die DNA-Qualität ist gut, dann niedrigere Eingangsmengen erfolgreich sein können. Darüber hinaus (ist also die Menge an amplifizierbaren DNA weniger als 100 bis 250 ng) , wenn die DNA - Qualität schlecht ist , dann höhere Eingangs Mengen , die Qualität der Sequenzierungsergebnisse verbessern kann (da die Menge an amplifizierbaren DNA erreichen die empfohlene Eingang) . Metriken für die DNA - Qualität und Quantität sollte vor dem Vorrücken der DNA in die Bibliothek Vorbereitung auf jede Probe angewendet werden. Diese Proben in einer &quot;Grauzone&quot; (siehe Abbildung 2) sollte im Ermessen des Laborleiters oder designee betrieben werden. Derzeit ist die beste Möglichkeit, vorherzusagen, wenn die DNA nicht gut durchführen während der Sequenzierung ist eine qPCR-basierte Assay durchzuführen, die für die Quantifizierung und Qualitätsbeurteilung von Input-DNA ermöglicht. Dieser Ansatz befasst sich mit der bioavailability von unterschiedlich großen Fragmente in der Probe, durch die Amplifikation von unterschiedlich großen Fragmente (beispielsweise 100 bp, 150 bp, 200 bp und 300 bp) und Vergleich Ausbeute. Derzeit beinhaltet Bibliothek Vorbereitung eine große Anzahl von manuellen Schritten, wo ein Fehltritt an einem von mehreren Verbindungsstellen der Bibliothek entweder scheitern lassen kann oder von schlechter Qualität sein. Die Mikrofluidik-Gel-Analyse ist die einzige QC Schritt eine Bibliothek prep Problem vor Sequenzierung zu überprüfen. Dementsprechend gibt es mehrere kritische Schritte, bei denen zusätzliche Achtsamkeit die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Reaktion erhöhen kann. Es ist zwingend notwendig, die richtige Probe und Oligonukleotidpool zu gewährleisten werden für jede Probe verwendet. Die Sicherstellung und richtig Aufnahme, dass jede Probe eine von 96 einzigartige Kombinationen von Dual-indiziert PCR Primerpaare enthält reduziert Chance für eine Probe mischen. Auch ist es wichtig, die Filterplatte (FPU) entwässert richtig zu gewährleisten; wenn es nicht richtig abfließt dies kann die exte verursachennsion-Ligatur Schritt der Bibliothek Vorbereitung suboptimal durchzuführen und zu schlechter Qualität Sequenzierungsdaten führen. Nach Bibliothek QC, ist es entscheidend, sicherzustellen, dass die LNB1 Kügelchen vollständig resuspendiert werden und dass die LNB1 / LNA1 Lösung wird gut gemischt, bevor es auf die Proben als die Konzentration dieser Mischung Zugabe verwendet wird, um die Molarität der Bibliothek zu bestimmen. Schließlich, wenn der Wulst Elutionsschritt zu einer suboptimalen Menge der Bibliothek führt die Perlen eluierenden off wird es clustering Dichte verringern und möglicherweise die Bibliothek verursachen nicht ausreichende mittlere Abdeckung erhalten. Im Gegensatz dazu wird ein Überschuss an Bibliothek führen zu einer schlechteren Qualität liest. Daher ist es wichtig, an der Sicke basierten Normalisierungsschritt konsistent sein optimale Bündelung zu gewährleisten und Clustering der Bibliotheken auf dem Sequenzer. Neben der Bibliothek Vorbereitung ist es entscheidend, eine Bioinformatik Pipeline zu validieren, die genaue Mutation Anrufe aus den rohen, demultiplexten fastq Dateien erzeugen. Die Wahl eineskundenspezifische Lösung kann sehr zeitaufwändig sein, da es viele Open-Source und kommerziell verfügbare Aligner, Variante Anrufer und NGS Software-Pakete sind, die man haben würde zu sichten. Benutzerdefinierte Algorithmen werden müssen, mit denen wesentliche Performance-Statistiken zu extrahieren, zu identifizieren einzigartige wiederkehrende Mutationen, die die meisten Open-Source-Tools ausgewichen, und Kopienzahl Status über jeden der Loci bestimmen. Während der Validierung einer Bioinformatik - Pipeline, ist es wichtig , die berichtspflichtigen Cutoffs für Varianten zu bestimmen , die den Anforderungen sowohl eine minimale Tiefe der Berichterstattung nach Qualität Filterung überschreiten (zB ein Minimum von 250 mal gelesen) und eine minimale Allelfrequenz (zB 4 %). Da dies ein Multiplex - Amplikon-basierten Assays, ist es wichtig , die minimale Tiefe der Berichterstattung bedeuten , um zu bestimmen (zB 1,000x) , dass die Bibliothek muss erreichen zu können , die leistungsschwächsten Amplicon auf die minimale Tiefe zu bekommen von liest. Darüber hinaus bedeutet das gemultiplexte Art des Assays cAUSE Tor Effekte und diese &quot;Artefakte&quot; müssen vor dem Start entdeckt und sind vollständig überprüft werden. Eine weitere wichtige Einschränkung für die beschriebenen Test besteht ein Bedarf für Proben enthalten mehr als 10% Tumor um die validierten Mindest Allelfrequenz zu erzielen. Die Detektion von niedriger Frequenz, 1%, FLT3 Einfügungen ist Beweis dafür , dass eine manuelle Überprüfung in diesem Prozess noch wünschenswert ist. Selbst bei einer Allelfrequenz Cutoff-Gehalt von 5%, einige wichtige Mutationen vielleicht verpasst und somit manuelle Überprüfung ist unerlässlich, diese Varianten zu ermitteln. Für FLT3-ITD, 14 Sichtprüfung von Exon wird für alle AML - Patienten durchgeführt , bleibt nicht unbemerkt eine geringe oder große Ein- / Doppelarbeit zu gewährleisten. HER2 Exon 20 Einfügungen zusätzlich die üblicherweise neben der Primersequenz sind, müssen manuelle Eingriffe. Trotz einer robusten Bioinformatik Pipeline hat, könnte noch einige Varianten zu übersehen, die nur die Natur ist ein harter Schnitt zu habenoff für die meisten die Statistiken oben erwähnt. Bessere Bioinformatik wäre notwendig, um dieses Problem zu lindern, ebenso wie eine bessere Bibliothek Vorbereitung und / oder Sequenzierung Methoden, weil es vorteilhafter ist, Daten von guter Qualität haben bei noch niedrigeren Cutoffs, die weniger Artefakte und False Positives enthalten. Die Detektion und Interpretation von Allelfrequenzen kann aufgrund der Schwierigkeit bei der Tumorprozentbestimmung und Amplifizierung Vorspannung von einigen Regionen des Genoms schwierig sein. Zusätzlich kann Allelfrequenzen über 50% festgestellt werden, wie im Fall beobachtet 2. Diese als Verlust der Heterozygotie interpretiert wird (LOH) -Ereignis, entweder durch den Verlust des normalen Allels, auf die scheinbare Zunahme der Mutante führt liest ein Verstärkung des mutanten Allels (zB 2 - Mutante und eine normale Kopie) oder andere Mechanismen. Diese Mechanismen können durch die Verwendung von Array komparative genomische Hybridisierung (aCGH 19) und / oder eine SNP - Genotypisierung Array erläutert. 20. Die aktuellen Ziel Anreicherung Methoden stützen sich auf ganztägige Verfahren entweder ineffizient oder Hybrid-Capture-Multiplex-PCR-Techniken, die für mehr Sequenzierung Abdeckung einer einzigen Probe und mehr vom Ziel-Sequenzierung liest in der Notwendigkeit, zur Folge haben. Weitere Anwendungen für NGS Molekulare Onkologie in naher Zukunft erwartet wird einfacher Bibliothek Herstellungsverfahren umfassen , die vollständig automatisierbar und in der Lage sein können Proben mit sehr geringen Mengen an Ausgangs - DNA zu verarbeiten (dh weniger als 1 ng) sowie Proben mit stark abgebaut DNA. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, wird die meisten Methoden vermutlich sein PCR-Basis, entweder ein mehrstufiges PCR Ansatz zu sein oder eine massiv-parallele Singleplex PCR-Ansatz. Darüber hinaus hat Molekular Strichcode- einzelner Amplicons gezeigt worden, um dramatisch Hintergrund Sequenzierungs Rauschen zu reduzieren und Untersuchung von Proben mit geringeren Anteilen an Tumorzellen ermöglichen unteren Allelfrequenzen erreichen und bewegen circulat zur Erfassunging Tumorzellen. Nachweis von krankheitsassoziierten Mutationen bei Krebsproben seit Jahrzehnten Sorgfalt Standard. Historisch wurden oft sequentiell getestet, Gene ein Gen / Exon zu einer Zeit, mit der Identifizierung eines an das Ende der Testsequenz führende Mutation. Das Aufkommen von NGS hat mehrere Gene zu sequenzieren, die mit vielen Krebsarten in parallel, was zu der Identifizierung von Mehrfachmutationen für eine weniger vorgespannten Ansatz erlaubt, die mit Neoplasie assoziiert sind. Die klinische Brauchbarkeit von NGS zum Nachweis von somatischen Mutationen in Krebs ist immer deutlicher. Tatsächlich stellt NGS-basierte Analyse von Tumorproben ein neues Paradigma, das traditionelle, einzelnes Gen-Tests in Frage stellt, aber die klinischen Nutzen ist sehr klar. Klinische Laboratorien haben heute die spannende Möglichkeit, sorgfältige Methodenvalidierung und Testinterpretation mit der Anwendung dieser leistungsfähigen Technologie vermählen.

Next-Generation-Sequencing (NGS) der klinischen Onkologie Proben wurde weiter verbreitet mehrere Jahre in den letzten werden als wissenschaftliche Literatur weist auf die Bedeutung der Identifizierung anzielbare genetischen Veränderungen und prädiktive / prognostische molekulare Marker wächst. Multi-Gen - Panel analysiert und ganze Exoms Sequenzierungsuntersuchungen in beiden epithelialen 1,2 und hämatologischen malignen Erkrankungen 3 haben das Konzept der Tumorheterogenität und klonalen Evolution als Krankheit fortschreitet und Schübe verfestigt. Zusätzlich, im Gegensatz zu konkurrierenden Technologien wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion (PCR) oder Sanger - Sequenzierung, kann NGS meisten genomischen Veränderungen in allen klinisch relevanten Krebsgene in einem einzigen Assay - 4 ermitteln. Das Zentrum für personalisierte Diagnose zunächst mit zwei klinischen NGS-Panels, eine benutzerdefinierte Hämatologische Panel (Häm-NGS Panel) und einem Off-the-shelf-Krebs-Panel für FFPE Proben (Solid-NGS Panel) ins Leben gerufen (siehe <strong&gt; 1). Diese Platten bedecken klinisch relevant oder hohe Interesse Regionen der ausgewählten Gene; nicht alle Gene oder Exons vollständig abgedeckt sind. Amplicons werden durch Sondenhybridisierung, die durch Verlängerung und Ligation. Die Zielregionen werden weiter verstärkt für die Sequenzierung unter Verwendung gepoolten PCR mit universellem Dual-indexiert Primern, so dass bis zu 96 Proben werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52758/52758fig1.jpg" /> Abb . 1: Liste der in den Panels Covered Gene Bibliothek Vorbereitung wird durchgeführt , und zwar mit dem benutzerdefinierten Hämatologische Panel (Häm-NGS Panel) von 33 Genen oder der Off-the-Shelf - Amplicon Krebs - Panel (Solid-NGS) von 47 Genen. Nicht alle Gene oder Exons sind in voller Höhe gedeckt, da einige Amplikons nur bestimmte Hotspots abdecken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/52758fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/52758fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen. &lt;</a>/ A&gt; Der Inhalt für die Häm-NGS - Panel wurde von verschiedenen Quellen abgeleitet, sondern dreht sich um 16 Gene bei akuter myeloischer Leukämie mutiert (AML) , die zuvor als Beweis ein hohes Maß an klinischen Nutzen 5 beschrieben. Das Solid-NGS Das Bedienfeld ist im Handel mit den Zielregionen basieren auf allgemein mutierte Gene in der Krebs produziert , wie im Katalog der somatische Mutationen in Krebs (COSMIC) Datenbank 6 gemeldet. Mehrere wichtige Schritte charakterisieren den gesamten Workflow für die klinische NGS. Nachdem der Arzt den Test bestellt, bestimmt ein Pathologe Angemessenheit der Probe für die Tumor Prozentsatz und Probenvolumen folgende Analyse. In unserer Einrichtung, benötigen wir mindestens 10% Tumor aufgrund des Hintergrundsequenzierungsfehlerrate ( &quot;Rauschen&quot;) der Technologie und die Effizienz der gezielten Ansatz. Wenn das Gewebe für den Test ausreichend ist, wird genomische DNA extrahiert. Diese DNA wird dann auf mehrere Qualitätskontrolle unterzogen (QC) Schritte. Wenn der DNA QC passiert, wird eine Amplicon-Bibliothek generiert und sequenziert. Die resultierenden Daten werden durch eine in-house Bioinformatik Pipeline analysiert. Nach bioinformatische Analyse werden Varianten manuell überprüft und für die Pathogenität vor dem Einbau in einer klinischen Bericht interpretiert. Im Folgenden zwei Fälle beschreiben, die durch diesen strengen Workflow ging und führte schließlich in klinische Behandlung zu Veränderungen. Fall 1 - Akute myeloische Leukämie Eine Knochenmark-Biopsie von Patient A war Diagnose für AML, ohne Reifung. Zytogenetische Untersuchungen wurden an der Knochenmarksprobe und zeigten eine normale weibliche Karyotyp gesendet. Es gab 95% zirkulierenden Blasten vorhanden, so dass eine periphere Blutprobe wurde für personalisierte Diagnosetests auf der Häm-NGS-Panel gesendet. Akute myeloische Leukämie (AML) ist eine hämatologische Malignität der myeloischen Linie von weißen Blutkörperchen. die Detektionsvon Gen - Mutationen bei AML hat für Prognose und Therapie zunehmend an Bedeutung gewonnen, mit rezidivierenden Genmutationen 7 als wichtig in der Pathogenese und Prognose anerkannt. Mutationen in NPM1 und CEBPA wurden mit einer günstigen Prognose Risiko verbunden, während interne Tandemverdopplungen (ITD) in FLT3 haben mit einem weniger günstigen Ergebnis 8 in Verbindung gebracht worden. Eine wachsende Zahl von Beweisen unterstützt eine pathogene Rolle für diese und andere Mutationen bei AML 9. Fall 2 - Lungenadenokarzinom Eine Biopsie eines linken supraklavikulären Masse von Patient B zeigte Lungenadenokarzinom. Biopsy Material aus der Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Lymphknoten Masse wurde für genomische Tests (Solid-NGS Panel) gesendet, wie Rollen / Locken mit mehr als 50% Tumor, zu erkennen, ob eine Mutation für gezielte therapeutische Intervention anwesend war. Lung cancer ist die häufigste Ursache von Krebs bedingte Sterblichkeit in den Vereinigten Staaten und gliedert sich in zwei Haupttypen, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und kleinzelligen Lungenkarzinom (SCLC). NSCLC kann weiter als entweder Adenokarzinom oder Plattenepithelkarzinom definiert werden, bezogen auf die Histologie der Läsion. Lung Adenokarzinom ist die häufigste Subtyp von Lungenkrebs, beide gesehen bei Rauchern und Nichtrauchern, und ist die häufigste Form von Lungenkrebs für Nichtraucher 10. Molekulare Untersuchungen der Lunge Adenokarzinome haben Mutation in mehrere Onkogene 11 identifiziert. Die am häufigsten verwendeten Treiber - Mutationen bei Rauchern identifiziert sind Mutationen im KRAS und BRAF. Die häufigsten Mutationen bei Nichtrauchern sind Mutationen in EGFR und Umlagerungen die Gene ALK, RET und ROS1 beteiligt sind . Lungentumore wurden mit einem in-frame Exon 20 Insertion in dem Gen , ERBB2 (HER2 / neu) beschrieben. Die häufigste Anomalie in HER2 / neu ist eine Verstärkung dieses Locus in Brustkrebs , für die eine gezielte Therapie verfügbar ist (Trastuzumab: ein humanisierter monoklonaler Antikörper gegen HER2 / neu). Die HER2 / neu - Exon 20 Insertion , die in 2 beobachtet wird - 4% der Lunge adenocarcimomas 12 Teilantwort auf die Kombinationstherapie mit HER2 / neu und mTOR - Inhibitoren (Neratinib und Temsirolimus, jeweils) 13 gezeigt hat.

<table><tbody><tr><td>ScreenTape für genomische DNA</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5365</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzien für genomische DNA</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5366</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 Reagenzien</td><td>Agilent Technology</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent Technology</td><td>G2965A</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation Analysesoftware</td><td>Agilent Technology</td><td>A.01.04 oder höher</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Röhrchen-Aufbewahrungsgestelle</td><td>Beliebiger Hersteller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15/50 ml Röhrchengestell</td><td>Beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Plattengestell</td><td>Beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette, Einkanal, 0,5&ndash; 2,5 &mu; l</td> Pipette <td>eines beliebigen Herstellers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, einkanalig, 1&ndash; 10 &mu; l</td> Pipette <td>eines beliebigen Herstellers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, einkanalig, 2&ndash; 20 &mu; l</td> Pipette <td>eines beliebigen Herstellers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, einkanalig, 10&ndash; 100 &mu; l</td> Pipette <td>eines beliebigen Anbieters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Einkanal, 20 Zoll; 200 &mu; l</td> Pipette <td>eines beliebigen Herstellers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, einkanalig, 100&ndash; 1.000 &mu; l</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipettiere</td><td>Alle Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Alle Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eiskübel</td><td>Alle Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge (für Röhrchen und Streifenröhrchen)</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gefrierschrank, -20 &deg; C</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg; C Kühlschrank</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasser oder Perlbad</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator (37 Grad; c)</td>Serologische Pipetten <td>aller Hersteller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 1&nbsp; ml</td> Serologische Pipetten <td>aller Hersteller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 5&nbsp; ml</td>: Serologische Pipetten <td>beliebiger Hersteller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 10&nbsp; ml</td> Serologische Pipetten <td>beliebiger Hersteller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 25&nbsp; ml</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Handschuhe</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen/Kapselblätter</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Konische Tube</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Konische Tube</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papierhandtücher</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 proof Ethanol</td> Jeder <td>Anbieter</td><td></td><td>Lagern Sie in einem brennbaren Schrank</td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropanol)</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td>Lagern Sie in einem brennbaren Schrank</td></tr><tr><td>25 ml Reservoirs</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 N NaOH</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette, 8-Kanal, 1 &ndash; 10 &mu; l</td> Pipette <td>beliebiger Hersteller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 8 Kanäle, 10 &ndash; 100 μm; l</td> Pipette <td>eines beliebigen Herstellers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 8 Kanäle, 20 &ndash; 300 μmu; l</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eiskübel</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserspritzflasche</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr> Alkohol <tr><td>Spritzflasche</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linsenreinigungspapier</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teller, 96-Well-PCR, Semi-Skirted</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube Streifen, 8-Well, 0,2&nbsp; ml</td><td>Beliebig Vendor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>BioShake IQ or 3000-T elm</td><td>Bulldog Bio/Q.Instruments</td><td>1808-0506/ 1808-0517</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 S - LabChipDS</td><td>Messschieber</td><td>128876</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 D - LabChipDS</td><td>Messschieber</td><td>132848</td><td></td></tr><tr><td>DropSense96</td><td>Messschieber (Trinean)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DropQuant Software</td><td>Caliper (Trinean)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate Sealing Film</td><td>Denville</td><td>B1212-5S</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium Seal Foil</td><td>Denville</td><td>B1212-6S</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefrei, Reinwasser System</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5424 Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22621408</td><td></td></tr><tr><td>5804R Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td>Sowohl 15-ml-Röhrchen- als auch Plattenrotatoren, vorzugsweise eine Zentrifuge, die bis zu 2.500 x g aufgehen kann.</td></tr><tr><td>Safe-Lock Röhrchen 1,5 ml, Natural</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Röhrchen, DNA LoBind Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>5430R Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>022620645</td><td>Jede Plattenrotatorzentrifuge funktioniert</td></tr><tr><td>Hybex Mikroproben-Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>1057-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Hybex 0,2 ml Röhrchenblock</td><td>Fisher Scientific</td><td>1057-31-0</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Amplicon &ndash; Krebs Panel</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1008</td><td>96 Reaktionen</td></tr><tr><td>TruSeq Custom Amplicon</td><td>Illumina</td><td>PE-940-1011</td><td>96 Reaktionen</td></tr><tr><td>TruSeq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td>96 Indizes, 384 Proben</td></tr><tr><td>MiSeq Reagenzienkit v3, 500 Zyklen</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagenzienkit v2, 300 Zyklen</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagenzienkit v2, 500 Zyklen</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Experiment Manager</td><td>Illumina</td><td>1.3 oder höher</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reporter</td><td>Illumina</td><td>2.0 oder höher</td><td></td></tr><tr><td>Viewer für die Sequenzierungsanalyse</td><td>Illumina</td><td>1.8 oder höher</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Index Plate Fixture and Collar Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1007</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq v2</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Custom Amplicon Filterplatte</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1006</td><td></td></tr><tr><td>Index Adapter Ersatzkappen</td><td>Illumina</td><td>11294657</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 0,5 ml Röhrchen</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Broad Range Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>DynaMa6-96 Magnetischer Ständer, seitlicher Rand</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700 (Gold/Silber-Block)</td><td>Life Technologies</td><td>N8050200</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Blood Kit</td><td>Qiagen</td><td>158489</td><td></td></tr><tr><td>Entparaffinierungslösung (16 ml)</td><td>Qiagen</td><td>19093</td><td></td></tr><tr><td>Puffer ATL (4 x 50ml)</td><td>Qiagen</td><td>939011</td><td></td></tr><tr><td>Proteinfällungslösung (50 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158910</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Hydratationslösung (100 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158914</td><td></td></tr><tr><td>Glykogenlösung (500&nbsp; &mu; l)</td><td>Qiagen</td><td>158930</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>Rnase (5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser (10 x 50 ml)</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Stößel</td><td>USA Scientific</td><td>1415-5390</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 10 &#181; l längliche Filterpipettenspitzen in sterilisierten Racks, 10 Racks mit 96 Spitzen (960 Spitzen).</td><td>USA Scientific</td><td>1180-3810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 100 &#181; l natürliche, abgeschrägte Filterpipettopfungsspitzen in sterilisierten Racks, 10 Racks mit 96 Spitzen (960 Spitzen)</td><td>USA Scientific</td><td>1180-1840</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 200 &mu; l naturbelassene, abgeschrägte Filterpipettierspitzen in Racks, sterilisierte Racks, 10 Racks mit 96 Spitzen (960 Spitzen)</td><td>USA Scientific</td><td>1180-8810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 20 &mu; l naturbelassene, abgeschrägte Filter-Pipettenspitzen in Racks, sterilisierte Racks, 10 Racks mit 96 Spitzen (960 Spitzen)</td><td>USA Scientific</td><td>1180-1810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 1.000 &mu; l naturbelassene, abgestufte XL-Filter-Pipettenspitzen in</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1830</td><td></td></tr></tbody></table>

next generation sequencing für den nachweis von mutationen umsetzbare in fester und flüssiger tumoren

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Mit zunehmendem Verständnis der Treibermutationen, die für die Entstehung und das Fortschreiten von Krebserkrankungen notwendig sind, gewinnen wir wichtige Informationen darüber, wie spezifische molekulare Profile eines Tumors das Ansprechen auf therapeutische Wirkstoffe vorhersagen oder Erkenntnisse über die Prognose liefern können. An unserer Einrichtung wurde im Rahmen der klinischen Routineversorgung ein Tumor-Genotypisierungsprogramm eingerichtet, bei dem sowohl hämatologische als auch solide Tumore auf ein breites Spektrum von Mutationen untersucht wurden, wobei zwei Next-Generation-Sequencing-Panels (NGS) verwendet wurden: ein benutzerdefiniertes Panel für hämatologische Malignome mit 33 Genen für die Verwendung mit peripherem Blut und Knochenmark und ein kommerziell hergestelltes Panel für solide Tumore für die Verwendung mit formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe, das auf 47 Gene abzielt, die häufig bei Krebs mutiert sind. Unser Arbeitsablauf umfasst eine pathologische Überprüfung der Biopsie, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Menge an Tumor für den Assay vorhanden ist, gefolgt von einer individuellen DNA-Extraktion, die an der Probe durchgeführt wird. Die Qualitätskontrolle der Probe umfasst Schritte für Quantität, Qualität und Integrität, und erst nachdem die extrahierte DNA diese Metriken bestanden hat, wird eine Amplikonbibliothek erstellt und sequenziert. Die resultierenden Daten werden über eine hauseigene Bioinformatik-Pipeline analysiert und die Varianten auf Pathogenität überprüft und interpretiert. Hier geben wir eine Momentaufnahme des Nutzens jedes Panels anhand von zwei klinischen Fällen, um einen Einblick zu geben, wie ein gut gestalteter NGS-Workflow zur Optimierung der klinischen Ergebnisse beitragen kann.

Fall 1 - Häm-NGS - Panel Die DNA aus leukämischen peripheren Blut extrahiert war von ausreichender Qualität und Menge (176 ng / ul) für die Häm-NGS-Panel. Die gesamte mittlere Tiefe der Berichterstattung war 4,933x (über der minimalen mittleren Tiefe der Berichterstattung von 1,000x). Zusätzliche Laufstatistiken sind in Tabelle 3 dar . Von den 8 Regionen unterhalb 250x Abdeckung 3 durch unsachgemäße Beschneiden der Primer waren (dh, wurde die Primersequenz nicht richtig durch Sequenzierungsfehler entfernt), 1 war ein bekannter Artefakt des Assays, und die anderen vier waren Teilbereiche der Exons verschiedener Gene ohne berichtspflichtigen Varianten. Obwohl unsere einzige klinische Protokollvarianten von mindestens 250 liest abgedeckt Berichterstattung umfasst, werden alle Daten mit mindestens 100 liest in die Datenbank für die Überprüfung importiert. Datenverarbeitung from der Bioinformatik Pipeline entdeckt drei berichts, krankheitsassoziierte Mutationen; eine Missense - Mutation in FLT3, eine Missense - Mutation in IDH2 und eine Frameshift - Mutation in NPM1. Die exonische Varianten mit ihren Allelfrequenzen sind in Tabelle 4 beschrieben ist . Eine gemeinsame Mutation in FLT3 ist die FLT3 -Interne Tandemverdopplungs (ITD) , die nicht automatisch von der Pipeline und erfordert eine Sichtprüfung von Exon 14. Sichtprüfung von Exon 14 aufgerufen von FLT3 zeigte in der eingereichten Probe keine Insertion oder Vervielfältigung. Die FLT3 I836del war bei 1% Allelfrequenz und wurde nicht in den Abschlussbericht aufgenommen , weil sie unter dem validierten Mindest Allelfrequenz von 5%. Diese Mutation ist nicht auf dem gleichen DNA - Molekül als FLT3 D835Y Veränderung (dh in der gleichen Amplikon Region beobachtet, aber nicht in &quot;cis&quot; in einem der Sequenzierung liest) , und es wurde nur durch eine manuelle Überprüfung der .bam fi beobachtetles bei der Überprüfung der p.D835Y ändern. Die unteren Allelfrequenzen der beiden FLT3 Mutationen schlägt diese Mutationen Heterogenität und / oder klonalen Evolution darstellen können; jedoch könnte der Unterschied zu Testleistung für das Amplikon oder ein single-nucleotide polymorphism (SNP) liegen, in der Nähe von oder überlappend die Primersequenz, die die Amplifikation dieses Allels beeinflusst. Die Häm-NGS - Panel - Ergebnisse für Fall 1 mit AML identifizierten Mutationen in FLT3, IDH2 und NPM1, drei häufigsten mutierten Gene in AML. Mutationen im FLT3 in ~ 25% der erwachsenen Patienten mit AML (COSMIC Datenbank 17) und sind entweder beobachtet interne Tandemverdopplungen (ITD) oder Missense-Mutationen in der Tyrosinkinase-Domäne. Die FLT3-ITD sind die häufigsten Mutation und sind mit einer schlechten Reaktion auf Standard - Chemotherapie, während die prognostische Bedeutung der FLT3 - Kinase - domain Punktmutationen, wie sie in dieser AML Patienten gesehen, hat eine unklare Auswirkungen auf die Prognose 14. Isozitratdehydrogenase 2 (NADP +), mitochondriale (IDH2) ist ein Gen , das eine epigenetische Modifier kodiert , das häufig bei AML mutiert ist. Mutationen in der epigenetischen Modifikatoren sind relativ häufig bei AML, mit Mutationen in IDH1 und Dnmt3a repräsentieren andere Mutationen in dieser Klasse von Genen , die zu Gen Dysregulation führen. Mutationen in dem Gen für Nucleophosmin (NPM1) sind eine der häufigsten erworbene Mutationen in AML und werden in der Regel ein guter prognostischer Faktor sein (in Abwesenheit eines FLT3 - ITD) betrachtet. Co-Mutationen von NPM1 und IDH2 wurden in der Literatur als günstige prognostischer Indikator 5, mit einem 3-Jahres - Überlebensrate von 89% beschrieben. Dies stellt einen signifikanten Vorteil Überleben im Vergleich zur Gesamt 3-Jahres-ÜberlebenWildtyp NPM1 und IDH2 von 31%. Zum Beispiel enthält Mutation Standard-Pflege Praxis - Analyse für NPM 1 und FLT3-ITD - Mutationen. In diesem Szenario würde der Nachweis von nur einer NPM1 - Mutation nicht in geeigneter Weise stratify Patienten für Risiko, da die sekundären Mutationen günstig sein können (zB IDH2) oder ungünstig (zB TET2), das Vertrauen der Reduktion einer Knochenmarktransplantation zur Linderung. Fall 2 - Fest NGS - Panel DNA aus dem Gewebe extrahiert FFPE war von ausreichender Qualität und Quantität für die Fest NGS-Panel, mit einer Konzentration von 252 ng / ul und nur 4% der DNA unter 1000 Basenpaare (bp). Nach der Datenanalyse war die mittlere Tiefe der Berichterstattung 9167 liest (weit über unsere Mindesttiefe Cutoff von 1000 liest) ohne Regionen unter 250 Lesetiefe. Zusätzliche QC-Metriken sind shown in Tabelle 3. Daten werden verarbeitet durch die Bioinformatik Pipeline entdeckt zwei krankheitsassoziierte Mutationen: eine In-Frame Insertion in Exon 20 von ErbB2 (HER2 / neu) und eine Missense - Mutation in TP53. Alle exonische Varianten mit ihren Allelfrequenzen sind in Tabelle 5 dargestellt. Die Insertion in ERBB2 stellt tatsächlich einen tandem dupliziert (Her2 / neu) -Sequenz, wie in der Nomenklatur reflektiert. Identifizierung und Bestätigung der in-Rahmeneinfügeschaltung erforderlichen manuellen Überprüfung der Sequenzierung liest durch IGV. Die Detektion von Mutation Frequenzen von mehr als 50%, wie sie sowohl für die TP53 und der Her2 / neu - Mutationen ist von einem Verlust von Heterozygotie (LOH) Ereignis suggestive gesehen (siehe Diskussion). Die Fest NGS-Panel-Ergebnisse für Fall 2 mit Adenokarzinom der Lunge entdeckt Mutationen in ErbB2 (HER2 / neu) und TP53, zwei Gene nicht häufig getestet als Teil des aktuellen Standard-of-Care für Patienten mit Lungenkrebs. HER2 / neu kodiert für ein Tyrosinkinase-Rezeptor ähnlich zu einem anderen häufig mutierte Gen bei Lungenkrebs, EGFR . Aktivieren HER2 / neu Exon 20 Einfügungen in 2 beobachtet werden , - 4% der Lungenadenokarzinomen, entfallen für die Mehrheit der HER2 / neu - Mutationen in Lungenkrebs beobachtet, und sie werden typischerweise in Tumoren ohne Mutationen in anderen Treiber Gene wie EGFR und ALK 12 gesehen . Es gibt mehrere Beweislinien zeigen Potential für verschiedene Behandlungsmöglichkeiten für Patienten mit aktivierenden HER2 / neu Einfügungen, einschließlich Teilantwort auf die Kombinationstherapie mit HER2 / neu und mTOR - Inhibitoren 13 und signifikante Krankheitsbekämpfung mit dem monoklonalen Antikörper Trastuzumab in Verbindung mit einer Chemotherapie 15. Eine TP53 Veränderung zu entdecken , ist nicht uncommon in Krebs, aber zu diesem Zeitpunkt gibt es keine umsetzbaren Therapien. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Fall 1 </td><td> Fall 2 </td></tr><tr><td> Insgesamt starten Liest </td><td> 2215926 </td><td> 2129110 </td></tr><tr><td> Prozentsatz der Liest Mapping </td><td> 98.42% </td><td> 98.29% </td></tr><tr><td> Prozentsatz der Liest auf Ziel </td><td> 99.01% </td><td> 97.29% </td></tr><tr><td> Prozentsatz der Liest auf Ziel Nach Filter </td><td> 97.60% </td><td> 95.45% </td></tr><tr><td> Prozentsatz der verwendbaren Liest </td><td> 94.87% </td><td> 91.79% </td></tr><tr><td> Prozentsatz der Basen über 250x Coverage </td><td> 98.40% </td><td> 100% </td></tr><tr><td> Prozentsatz der Basen above 1000x Coverage </td><td> 95.90% </td><td> 99.70% </td></tr><tr><td> Coverage Unter 250x - Amplicon Nummer </td><td> 8 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3:. Sequencing Run QC Metrics Dies ist eine Zusammenfassung der wichtigsten Lauf Statistiken, ohne die mittlere Abdeckung, die für die Datenüberprüfung verwendet werden , um festzustellen , ob eine Bibliothek prep Probe QC bestanden hat. Der gesamte Prozess ist erfolgreich, wenn alle Prozentsätze über 90% sind, aber es ist möglich, mit Verschleppung von SW1 oder UB1 in der FPU Waschschritt oder Primer Übersprechen, haben niedrigere &quot;Prozent auf Target &#39;im Bereich von 80 - 90%. Wenn der &quot;Percent Mapped&quot; zu niedrig ist, das wäre eine Kontamination von Bakterien oder anderen DNA zeigen, wie alle Proben für die menschliche ausrichten sollte. Wenn eine dieser Spezifikationen unter 80% sind, wird die Probe zur weiteren Überprüfung markiert festzustellen, wie proceed und den Prozess zu verbessern. <img alt="Tabelle 4" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl4.jpg" /> Tabelle 4:.. Fall 1 Ergebnisse Erkannte pathogen, Krankheit assoziiert sind , Variante unbekannter Signifikanz (VUS) und wahrscheinlich gutartig exonische Varianten über den Berichtskriterien von 5% Allelfrequenz aufgelistet <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_4.xlsx" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_4.xlsx" target="_blank">diese Tabelle zu laden.</a> <img alt="Tabelle 5" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl5.jpg" /> Tabelle 5:.. Fall 2 Ergebnisse Erkannte pathogen, Krankheit assoziiert sind , Variante unbekannter Signifikanz (VUS) und wahrscheinlich gutartig exonische Varianten über den Berichtskriterien von 5% Allelfrequenz aufgelistet <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_5.xlsx" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_5.xlsx" target="_blank">diese Tabelle zu downloaden</a>. Supplemental Figur 1: Ein Beispiel für ein Amplikon-basierten SampleSheet.csv. Dieses Blatt vermittelt dem Sequenzer , welche Chemie (in diesem Fall Amplicon) zu laufen, was für Workflow (zB GenerateFastq), welche Anwendung und Assay (zB FastqOnly), wie viele Basen (oder liest) zu Folge (in diesem Fall 186 bp x 186 bp), und schließlich, was Proben mit bestimmten Indizes (in diesem Fall Dual Indizierung verbunden sind). Die Teile , die gelb markiert werden können, was auch immer geändert werden , der Experimentator will, aber in diesem Fall ist das Labor diese Parameter verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/SupplementaryFigure1.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/SupplementaryFigure1.pdf" target="_blank">diese Figur zum Download</a> bereit <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/SupplementaryFigure1.pdf" target="_blank">.</a>

Dieses Manuskript beschreibt klinische Protokolle für zwei Next-Generation-Sequencing-Panels. Ein Panel befasst sich mit hämatologischen Malignomen, während das andere Panel auf Gene abzielt, die in soliden Tumoren häufig mutiert sind. Die molekulare Klassifikation von Treibermutationen bei humanen Malignomen bietet wertvolle prognostische und prädiktive Informationen.

Next Generation Sequencing für den Nachweis von Mutationen umsetzbare in fester und flüssiger Tumoren

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Das übergeordnete Ziel dieses gezielten Amplikon-Assays mittels Next-Generation-Sequencing besteht darin, pathogene Mutationen in Tumoren von Patienten für therapeutische Anwendungen nachzuweisen, einschließlich Diagnose, Prognose und Ansprechen auf eine zielgerichtete Therapie. Diese Methode beantwortet wichtige Fragen, beispielsweise, ob ein Patient eine Mutation in einem Gen aufweist, von der eine zielgerichtete oder alternative Therapie profitieren könnte. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass behandelbare Mutationen, sowohl häufige als auch seltene, in vielen Genen in jedem Tumorgewebe mithilfe eines einzigen Assays erkannt werden können.Da die Techniken und Technologien äußerst komplex sind und die Schritte nur schwer zu erlernen, ist es entscheidend, diese Methode visuell zu demonstrieren. Dies markiert einen entscheidenden Fortschritt in der Medizinischen Onkologie. Durch die Einführung der Next-Generation-Sequenzierung in die klinische Praxis werden wir über mehr und bessere Krebstherapien für unsere Patienten verfügen.Unsere CPD-Technologen Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy und Joe Grubb werden dieses Verfahren demonstrieren. Ich werde ebenfalls bei diesem Prozess unterstützen, um die komplexeren Teile des Assays zu zeigen. Nach der Extraktion der genomischen DNA gemäß dem Textprotokoll führen Sie zwei Mikroliter der extrahierten DNA gemäß dem Herstellerprotokoll auf einem Fluorometer durch, um die Arbeitskonzentration der Probe zu ermitteln.Um eine Amplikon-Bibliothek herzustellen, geben Sie in eine halbschürzige 96-Loch-Platte, die als Hyb-Platte bezeichnet wird, das erforderliche Volumen an low-EDTA-TE-Puffer, fünf Mikroliter aus dem Oligo-Röhrchen des Panels und 100 bis 250 Nanogramm genomische DNA in jedes entsprechende Loch. Dies ist der wichtigste Schritt, da Verwechslungen hier schwerwiegende Folgen haben werden. Nach Zugabe des Oligo-Hybridisierungsreagenz für Sequenzierung Reagenz 1 und Zentrifugation gemäß dem schriftlichen Protokoll inkubieren Sie die Hyb-Platte im vorgewärmten Hybridisierungsinkubator bei 95 Grad Celsius für eine Minute.Nachdem der Inkubator langsam auf 40 Grad Celsius abgekühlt wurde, entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und übertragen das gesamte Volumen jeder Probe von der Hybridisierungsplatte in die Mitte der zuvor vorbereiteten, vorgewaschenen Filterplatten-Einheit (FPU). Decken Sie die FPU ab und zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 2.250 ×g und 20 Grad Celsius. Anschließend 45 Mikroliter SW1 hinzufügen und erneut zentrifugieren.Nach einer zweiten Waschung mit SW1 und einer Wäsche mit UB1 fügen Sie 45 Mikroliter Extension-Ligation-Mix 3 in jedes Probenloch hinzu und pipettieren Sie dreimal auf und ab, um es zu mischen. Versiegeln Sie die Platte mit haftender Aluminiumfolie und inkubieren Sie die gesamte FPU-Baugruppe 45 Minuten lang in einem vorgewärmten Inkubator bei 37 Grad Celsius. Um die PCR-Amplifikation zu indizieren, ordnen Sie die Primer in der Index-Amplifikationsplatte (IAP-Fixture) an, aliquotieren Sie die verwendeten Indizes in die entsprechenden Löcher der Platte und fügen Sie anschließend 22 Mikroliter des PCR-Master-Mixes 2E12 hinzu und pipettieren Sie dreimal auf und ab.Nachdem die 45-minütige Verlängerungsligationsreaktion gemäß dem Textprotokoll zentrifugiert wurde, 25 Mikroliter 50 Millimolarer Natriumhydroxidlösung zu jedem Probenbrunnen der FPU hinzufügen und mindestens sechsmal auf- und abpipettieren, wobei sichergestellt werden muss, dass die Pipettenspitze mit der Membran in Kontakt kommt. Dann, bei leicht gekippter Platte und mit einem Mehrkanalpipettierer auf 20 Mikroliter eingestellt, das Natriumhydroxid in der FPU-Platte mindestens sechsmal auf- und abpipettieren. Die Elution von der FPU auf die entsprechende Säule der IAP übertragen.Pipettieren Sie vorsichtig mehrmals auf und ab, um die DNA gründlich mit der PCR-Master-Mix zu vermischen, bevor Sie das im Textprotokoll beschriebene PCR-Programm durchführen. Nach Überprüfung der Bibliotheksausbeute und Inkubation der Proben mit magnetischen Reinigungsperlen gemäß dem Textprotokoll geben Sie 30 Mikroliter EBT in jedes Brunnenfeld der gewaschenen Perlen. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um sicherzustellen, dass die Perlen von der Röhrenwand abgelöst werden.Nach der Inkubation der Platte mit und anschließend ohne Schütteln wird die Platte auf den Magnethalter gestellt und 20 Mikroliter des Überstandes in eine völlig neue Platte übertragen, die als Bibliotheksnormierungsplatte oder LNP bezeichnet wird. Nach der Herstellung des Normierungsgemisches unter intermittierendem Umstülpen und Wirbeln der Lösung werden 45 Mikroliter zu jeder Probe der LNP hinzugegeben. Anschließend wird die Platte mit einer klaren Klebefolie abgedichtet und 30 Minuten lang bei 1.800 U/min geschüttelt.Nach dem Waschen der Beads entfernen Sie die LNP vom Magnetrack und geben zur Elution der Probe 30 Mikroliter frisches 0,1 normales Natriumhydroxid in jedes Well. Anschließend schütteln Sie die LNP fünf Minuten lang bei 1.800 U/min. Stellen Sie die LNP zurück auf den Magnetrack und übertragen Sie, nachdem sich der Überstand geklärt hat, 30 Mikroliter der Elutionslösung in zuvor vorbereitete Library Normalization Storage Buffer 1 in der Storage Plate.Biegen Sie die Platte nach unten und geben Sie fünf Mikroliter jeder zu sequenzierenden Probe in ein beschriftetes Röhrchen mit einem Pooled Amplicon Library (PAL) von 1,5 Milliliter. Je nach verwendeter Sequenzierchemie geben Sie vier bis 10 Mikroliter des PAL zu 590 bis 596 Mikrolitern Puffer HT1. Reinigen und laden Sie die Flusszelle.Laden Sie die Reagenzien auf. Befolgen Sie anschließend die Anweisungen auf dem Bildschirm, um den Sequenzierdurchlauf zu starten. Nach Abschluss des Sequenzierdurchlaufs führen Sie die Bioinformatik-Pipeline aus.Analysieren Sie die Laufstatistiken, um sicherzustellen, dass die sequenzierte Bibliothek die vom Labor festgelegten Qualitätskontrollkriterien erfüllt hat. Abschließend überprüfen Sie jeden Varianten manuell mithilfe eines Genomdatenbetrachters, indem Sie die BAM-Dateien betrachten. Dies ist eine Zusammenfassung der wichtigsten Laufstatistiken – ohne die mittlere Abdeckung –, die verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Bibliotheksvorbereitungsprobe die Qualitätskontrolle bestanden hat. Wie hier für Fall Eins zu sehen ist, hat die Bioinformatik vier berichtspflichtige, mit AML assoziierte Mutationen detektiert.Eine Missense-Mutation in FLT3, eine Missense-Mutation in IDH2 und eine Frameshift-Mutation in NPM1. Mutationen in FLT3 treten bei etwa 25 % der erwachsenen Patienten mit AML auf. Die prognostische Bedeutung von Punktmutationen in der Kinasedomäne von FLT3, wie sie bei diesem AML-Patienten beobachtet werden, hat einen unklaren Einfluss auf die Prognose.Isocitrat-Dehydrogenase 2, oder IDH2, kodiert einen epigenetischen Modifikator, der häufig bei AML mutiert ist. Mutationen im Gen für Nucleophosmin, oder NPM1, gehören zu den am häufigsten erworbenen Mutationen bei AML. Diese Tabelle listet alle exonischen Varianten für Fall Zwei auf.Es wurden zwei krankheitsassoziierte Mutationen nachgewiesen: eine In-Frame-Insertion im Exon 20 von ERBB2 und eine Missense-Mutation in TP53. HER2/neu bzw. ERBB2 kodiert einen Tyrosinkinaserezeptor.Aktivierende Insertionen im Exon 20 von HER2/neu treten bei zwei bis 4 % der Lungenadenokarzinome auf und machen den Großteil der bei Lungenkrebs beobachteten HER2/neu-Mutationen aus. Veränderungen in TP53 sind in Krebserkrankungen ebenfalls häufig. Es ist notwendig, besonders auf die Qualität und Quantität der extrahierten DNA zu achten.Dies ist besonders wichtig für FFPE-Proben, die oft stark degradiert sind und eine variable DNA-Ausbeute aufweisen. Während der Validierung des klinischen Assays sollten Metriken für die DNA-Qualität und -menge für jede Probe festgelegt werden, bevor die DNA in die Bibliotheksherstellung überführt wird.Zusätzlich zur Bibliotheksvorbereitung ist es entscheidend, einen Bioinformatik-Spy-Plan zu validieren, indem Cutoff-Werte für den Sequenzierlauf, Statistiken zur Qualitätskontrolle, zur Bibliotheksvorbereitung, zur Sequenziertiefe eines Amplikons sowie die minimale berichtsfähige Allelfrequenz bestimmt werden. Sobald die Bibliotheksvorbereitung beherrscht ist, kann sie an einem Arbeitstag durchgeführt werden. Der gesamte Assay-Workflow erfordert jedoch mehr Zeit für die DNA-Extraktion, Sequenzierung, Datenverarbeitung und die Überprüfung von Varianten.Dieses Verfahren dient ausschließlich der Untersuchung von Mutationen in der genomischen DNA an bestimmten wichtigen Hotspots. Weitere Analysen, die RNA verwenden, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu klären, wie beispielsweise die differentielle Expression von Genen, die Zuordnung von Tumorrisiken und strukturelle Umarrangierungen. Wichtige Fortschritte stehen bevor.Die Einführung der Automatisierung und die Integration einer einzigartigen molekularen Barcodekennung ermöglichen es Laboren, die Durchlaufzeiten zu verkürzen, geringere Probenvolumina zu verwenden und Varianten mit sehr niedriger Allelfrequenz nachzuweisen. Der Nachweis krankheitsassoziierter Mutationen in Tumorgewebeproben ist seit Jahrzehnten Standard der Versorgung. NGS ist ein weniger verzerrter Ansatz zur parallelen Sequenzierung mehrerer Gene, die mit zahlreichen Krebserkrankungen assoziiert sind, und führt so zur Identifizierung mehrerer Mutationen sowie zu verbesserten Therapieansätzen für Patienten.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Cancer Research

Krebsforschung

Wir beschreiben die Herstellung von mit Strichcode-DNA-Bibliotheken und die anschließende Hybridisierung Basis Exon Erfassung zur Erkennung von Schlüssel Krebs-assoziierten Mutationen in der klinischen Tumorproben von massiv parallelen Sequenzierung der "nächsten Generation". Gezielte Exon-Sequenzierung bietet die Vorteile der hohen Durchsatz, geringe Kosten, und tiefe Sequenzabdeckung, woraus sich eine hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Niederfrequenz-Mutationen.

Erkennen Somatische Genetische Veränderungen in Tumorproben von Exon-Abscheidung und-Massively Parallel Sequencing

Ein integriertes System für die gezielte Next-Generation-Sequenzierung von onkologischen Proben wird beschrieben. Dieses plattformübergreifende System ist für Tumorbiopsien von geringer Qualität und geringen Mengen optimiert, ermöglicht geringe DNA-Eingaben, umfasst gut charakterisierte Mehrvariantenkontrollen und verfügt über einen neuartigen Variantenaufrufer, der auf quantitativen präanalytischen Qualitätskontrollmaßnahmen basiert.

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen von niedriger Frequenz in CtDNA, ER-seq. Diese Methode unterscheidet sich durch seine einzigartige Verwendung von zwei Richtungen Fehlerkorrektur, einen speziellen Hintergrund Filter und effiziente molekulare Aneignung.

Nachweis von seltenen Mutationen im CtDNA mit Next Generation Sequencing

Erhalten qualitativ hochwertige genomischen DNA von Tumorgewebe ist ein wichtiger erster Schritt für die Analyse von genetischer Veränderungen, die Sequenzierung der nächsten Generation. In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine einfache und schnelle Methode, um Tumorzellen zu bereichern und intakte DNA von Touch Impressum Zytologische Proben erhalten.

Einfache und schnelle Methode, um qualitativ hochwertige Tumor DNA von klinischen pathologischen Proben mit Touch Impressum Zytologie zu erhalten

Nachweis von zirkulierenden Ribonukleinsäure (cRNA) aus Blut besteht ein ungedeckter Bedarf in der klinischen Diagnostik. Hier beschreiben wir Methoden, die cRNA von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs-Patienten mit empfindlichen und spezifischen digitalen Polymerase-Kettenreaktion zu charakterisieren. Die Tests treffen Entwurfsanforderungen zu Fusion Varianten innerhalb von 72 Stunden zu erkennen.

Eine Blut-basierte Test zum Nachweis von ROS1 und RET Fusion Transkripte von zirkulierenden Ribonukleinsäure mit digitalen Polymerase-Kettenreaktion

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Identifizierung klonaler und subklonaler Veränderungen zwischen verschiedenen Proben eines bestimmten Patienten. Obwohl sich die hier beschriebenen Experimente auf einen bestimmten Tumortyp konzentrieren, ist der Ansatz im Großen und Ganzen auf andere solide Tumoren anwendbar.

Vergleichende Lesionsanalyse durch einen gezielten Sequenzierungsansatz

Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines verankerten Multiplex-Polymerase-Kettenreaktions-basierten Bibliotheksvorbereitungskits, gefolgt von einer Sequenzierung der nächsten Generation, um onkogene Genfusionen in klinischen soliden Tumorproben zu bewerten. Es werden sowohl Die Nassbank- als auch die Datenanalyseschritte beschrieben.

Onkogene Genfusionsdetektion mit verankerter Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion gefolgt von Sequenzierung der nächsten Generation

In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes Protokoll für die nichtinvasive flüssige Biopsietechnik vor, einschließlich Blutentnahme, Plasma- und Buffy-Coat-Trennung, cfDNA- und Keimbahn-DNA-Extraktion, Quantifizierung von cfDNA- oder Keimbahn-DNA und cfDNA-Fragmentanreicherungsanalyse.

Nachweis zellfreier DNA in Blutplasmaproben von Krebspatienten

Die Zunahme molekularer Biomarker, die für die Behandlung von nicht-plattenepithelialem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NS-NSCLC) getestet werden sollen, hat zur Entwicklung schneller und zuverlässiger molekularer Nachweismethoden geführt. Wir beschreiben einen Arbeitsablauf für die Beurteilung genomischer Veränderungen bei NS-NSCLC-Patienten unter Verwendung eines ultraschnellen Next Generation Sequencing (NGS)-Ansatzes.

Ultraschnelle Amplicon-basierte Next-Generation-Sequenzierung bei nicht-plattenepithelialem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs

Dieses Protokoll beschreibt einen automatisierten, ISO15189-akkreditierten Next-Generation-Sequencing-Workflow zum Nachweis zielgerichteter genomischer Veränderungen in formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben des nicht-kleinzelligen Lungenkrebses (NSCLC).

Nachweis zielgerichteter Veränderungen bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs mittels Next-Generation-Sequencing

Lernen Sie Next-Generation-Sequencing zur Detektion von Mutationen in festen Tumoren und hämatologischen Malignomen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung therapeutisch relevanter Genveränderungen für die präzisionsonkologische Behandlung.

Next Generation Sequencing für den Nachweis von Mutationen umsetzbare in fester und flüssiger Tumoren

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