Next Generation Sequencing für den Nachweis von Mutationen umsetzbare in fester und flüssiger Tumoren

Das übergeordnete Ziel dieses gezielten Amplikon-Assays mittels Next-Generation-Sequencing besteht darin, pathogene Mutationen in Tumoren von Patienten für therapeutische Anwendungen nachzuweisen, einschließlich Diagnose, Prognose und Ansprechen auf eine zielgerichtete Therapie. Diese Methode beantwortet wichtige Fragen, beispielsweise, ob ein Patient eine Mutation in einem Gen aufweist, von der eine zielgerichtete oder alternative Therapie profitieren könnte. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass behandelbare Mutationen, sowohl häufige als auch seltene, in vielen Genen in jedem Tumorgewebe mithilfe eines einzigen Assays erkannt werden können.

Da die Techniken und Technologien äußerst komplex sind und die Schritte nur schwer zu erlernen, ist es entscheidend, diese Methode visuell zu demonstrieren. Dies markiert einen entscheidenden Fortschritt in der Medizinischen Onkologie. Durch die Einführung der Next-Generation-Sequenzierung in die klinische Praxis werden wir über mehr und bessere Krebstherapien für unsere Patienten verfügen.

Unsere CPD-Technologen Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy und Joe Grubb werden dieses Verfahren demonstrieren. Ich werde ebenfalls bei diesem Prozess unterstützen, um die komplexeren Teile des Assays zu zeigen. Nach der Extraktion der genomischen DNA gemäß dem Textprotokoll führen Sie zwei Mikroliter der extrahierten DNA gemäß dem Herstellerprotokoll auf einem Fluorometer durch, um die Arbeitskonzentration der Probe zu ermitteln.

Um eine Amplikon-Bibliothek herzustellen, geben Sie in eine halbschürzige 96-Loch-Platte, die als Hyb-Platte bezeichnet wird, das erforderliche Volumen an low-EDTA-TE-Puffer, fünf Mikroliter aus dem Oligo-Röhrchen des Panels und 100 bis 250 Nanogramm genomische DNA in jedes entsprechende Loch. Dies ist der wichtigste Schritt, da Verwechslungen hier schwerwiegende Folgen haben werden. Nach Zugabe des Oligo-Hybridisierungsreagenz für Sequenzierung Reagenz 1 und Zentrifugation gemäß dem schriftlichen Protokoll inkubieren Sie die Hyb-Platte im vorgewärmten Hybridisierungsinkubator bei 95 Grad Celsius für eine Minute.

Nachdem der Inkubator langsam auf 40 Grad Celsius abgekühlt wurde, entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und übertragen das gesamte Volumen jeder Probe von der Hybridisierungsplatte in die Mitte der zuvor vorbereiteten, vorgewaschenen Filterplatten-Einheit (FPU). Decken Sie die FPU ab und zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 2.250 ×g und 20 Grad Celsius. Anschließend 45 Mikroliter SW1 hinzufügen und erneut zentrifugieren.

Nach einer zweiten Waschung mit SW1 und einer Wäsche mit UB1 fügen Sie 45 Mikroliter Extension-Ligation-Mix 3 in jedes Probenloch hinzu und pipettieren Sie dreimal auf und ab, um es zu mischen. Versiegeln Sie die Platte mit haftender Aluminiumfolie und inkubieren Sie die gesamte FPU-Baugruppe 45 Minuten lang in einem vorgewärmten Inkubator bei 37 Grad Celsius. Um die PCR-Amplifikation zu indizieren, ordnen Sie die Primer in der Index-Amplifikationsplatte (IAP-Fixture) an, aliquotieren Sie die verwendeten Indizes in die entsprechenden Löcher der Platte und fügen Sie anschließend 22 Mikroliter des PCR-Master-Mixes 2E12 hinzu und pipettieren Sie dreimal auf und ab.

Nachdem die 45-minütige Verlängerungsligationsreaktion gemäß dem Textprotokoll zentrifugiert wurde, 25 Mikroliter 50 Millimolarer Natriumhydroxidlösung zu jedem Probenbrunnen der FPU hinzufügen und mindestens sechsmal auf- und abpipettieren, wobei sichergestellt werden muss, dass die Pipettenspitze mit der Membran in Kontakt kommt. Dann, bei leicht gekippter Platte und mit einem Mehrkanalpipettierer auf 20 Mikroliter eingestellt, das Natriumhydroxid in der FPU-Platte mindestens sechsmal auf- und abpipettieren. Die Elution von der FPU auf die entsprechende Säule der IAP übertragen.

Pipettieren Sie vorsichtig mehrmals auf und ab, um die DNA gründlich mit der PCR-Master-Mix zu vermischen, bevor Sie das im Textprotokoll beschriebene PCR-Programm durchführen. Nach Überprüfung der Bibliotheksausbeute und Inkubation der Proben mit magnetischen Reinigungsperlen gemäß dem Textprotokoll geben Sie 30 Mikroliter EBT in jedes Brunnenfeld der gewaschenen Perlen. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um sicherzustellen, dass die Perlen von der Röhrenwand abgelöst werden.

Nach der Inkubation der Platte mit und anschließend ohne Schütteln wird die Platte auf den Magnethalter gestellt und 20 Mikroliter des Überstandes in eine völlig neue Platte übertragen, die als Bibliotheksnormierungsplatte oder LNP bezeichnet wird. Nach der Herstellung des Normierungsgemisches unter intermittierendem Umstülpen und Wirbeln der Lösung werden 45 Mikroliter zu jeder Probe der LNP hinzugegeben. Anschließend wird die Platte mit einer klaren Klebefolie abgedichtet und 30 Minuten lang bei 1.800 U/min geschüttelt.

Nach dem Waschen der Beads entfernen Sie die LNP vom Magnetrack und geben zur Elution der Probe 30 Mikroliter frisches 0,1 normales Natriumhydroxid in jedes Well. Anschließend schütteln Sie die LNP fünf Minuten lang bei 1.800 U/min. Stellen Sie die LNP zurück auf den Magnetrack und übertragen Sie, nachdem sich der Überstand geklärt hat, 30 Mikroliter der Elutionslösung in zuvor vorbereitete Library Normalization Storage Buffer 1 in der Storage Plate.

Biegen Sie die Platte nach unten und geben Sie fünf Mikroliter jeder zu sequenzierenden Probe in ein beschriftetes Röhrchen mit einem Pooled Amplicon Library (PAL) von 1,5 Milliliter. Je nach verwendeter Sequenzierchemie geben Sie vier bis 10 Mikroliter des PAL zu 590 bis 596 Mikrolitern Puffer HT1. Reinigen und laden Sie die Flusszelle.

Laden Sie die Reagenzien auf. Befolgen Sie anschließend die Anweisungen auf dem Bildschirm, um den Sequenzierdurchlauf zu starten. Nach Abschluss des Sequenzierdurchlaufs führen Sie die Bioinformatik-Pipeline aus.

Analysieren Sie die Laufstatistiken, um sicherzustellen, dass die sequenzierte Bibliothek die vom Labor festgelegten Qualitätskontrollkriterien erfüllt hat. Abschließend überprüfen Sie jeden Varianten manuell mithilfe eines Genomdatenbetrachters, indem Sie die BAM-Dateien betrachten. Dies ist eine Zusammenfassung der wichtigsten Laufstatistiken – ohne die mittlere Abdeckung –, die verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Bibliotheksvorbereitungsprobe die Qualitätskontrolle bestanden hat. Wie hier für Fall Eins zu sehen ist, hat die Bioinformatik vier berichtspflichtige, mit AML assoziierte Mutationen detektiert.

Eine Missense-Mutation in FLT3, eine Missense-Mutation in IDH2 und eine Frameshift-Mutation in NPM1. Mutationen in FLT3 treten bei etwa 25 % der erwachsenen Patienten mit AML auf. Die prognostische Bedeutung von Punktmutationen in der Kinasedomäne von FLT3, wie sie bei diesem AML-Patienten beobachtet werden, hat einen unklaren Einfluss auf die Prognose.

Isocitrat-Dehydrogenase 2, oder IDH2, kodiert einen epigenetischen Modifikator, der häufig bei AML mutiert ist. Mutationen im Gen für Nucleophosmin, oder NPM1, gehören zu den am häufigsten erworbenen Mutationen bei AML. Diese Tabelle listet alle exonischen Varianten für Fall Zwei auf.

Es wurden zwei krankheitsassoziierte Mutationen nachgewiesen: eine In-Frame-Insertion im Exon 20 von ERBB2 und eine Missense-Mutation in TP53. HER2/neu bzw. ERBB2 kodiert einen Tyrosinkinaserezeptor.

Aktivierende Insertionen im Exon 20 von HER2/neu treten bei zwei bis 4 % der Lungenadenokarzinome auf und machen den Großteil der bei Lungenkrebs beobachteten HER2/neu-Mutationen aus. Veränderungen in TP53 sind in Krebserkrankungen ebenfalls häufig. Es ist notwendig, besonders auf die Qualität und Quantität der extrahierten DNA zu achten.

Dies ist besonders wichtig für FFPE-Proben, die oft stark degradiert sind und eine variable DNA-Ausbeute aufweisen. Während der Validierung des klinischen Assays sollten Metriken für die DNA-Qualität und -menge für jede Probe festgelegt werden, bevor die DNA in die Bibliotheksherstellung überführt wird.

Zusätzlich zur Bibliotheksvorbereitung ist es entscheidend, einen Bioinformatik-Spy-Plan zu validieren, indem Cutoff-Werte für den Sequenzierlauf, Statistiken zur Qualitätskontrolle, zur Bibliotheksvorbereitung, zur Sequenziertiefe eines Amplikons sowie die minimale berichtsfähige Allelfrequenz bestimmt werden. Sobald die Bibliotheksvorbereitung beherrscht ist, kann sie an einem Arbeitstag durchgeführt werden. Der gesamte Assay-Workflow erfordert jedoch mehr Zeit für die DNA-Extraktion, Sequenzierung, Datenverarbeitung und die Überprüfung von Varianten.

Dieses Verfahren dient ausschließlich der Untersuchung von Mutationen in der genomischen DNA an bestimmten wichtigen Hotspots. Weitere Analysen, die RNA verwenden, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu klären, wie beispielsweise die differentielle Expression von Genen, die Zuordnung von Tumorrisiken und strukturelle Umarrangierungen. Wichtige Fortschritte stehen bevor.

Die Einführung der Automatisierung und die Integration einer einzigartigen molekularen Barcodekennung ermöglichen es Laboren, die Durchlaufzeiten zu verkürzen, geringere Probenvolumina zu verwenden und Varianten mit sehr niedriger Allelfrequenz nachzuweisen. Der Nachweis krankheitsassoziierter Mutationen in Tumorgewebeproben ist seit Jahrzehnten Standard der Versorgung. NGS ist ein weniger verzerrter Ansatz zur parallelen Sequenzierung mehrerer Gene, die mit zahlreichen Krebserkrankungen assoziiert sind, und führt so zur Identifizierung mehrerer Mutationen sowie zu verbesserten Therapieansätzen für Patienten.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.