Name: Anwendung der DNA-spezifisches Färbemittel, Methyl Green in der Fluoreszenzmarkierung von Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Lernen Sie die Fluoreszenzmarkierung von Embryonen mit dem DNA-spezifischen Färbemittel Methylgrün für die konfokale Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht tiefes Bildgebung dicker biologischer Proben.

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Die Autoren danken Patxi Jaso für die Produktion des Videos, PEDECIBA und der Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII) für die Teilfinanzierung.

1. Reinigung des Dye <ol><li> Bereiten Sie einen 4% igen wässrigen Lösung von Methylgrün durch Auflösen von 0,4 g Fleck Pulver in 10 ml destilliertem Wasser. Gründlich mischen, bis sie vollständig gelöst wird. </li><li> Unter einer Abzugshaube, mischen Sie es mit mindestens 2 Teilen Chloroform. Es ist wichtig, vorher zu prüfen, ob die Rohre sind Chloroform beständig. </li><li> Gründlich mischen und zentrifugieren für 1 min bei 2.000 xg um die Phasentrennung zu beschleunigen. </li><li> Nach dem Zentrifugieren eine obere wässrige Phase mit Methyl-grün und eine untere organische Phase mit Chloroform und die üblichen Schadstoffkristallviolett erhalten. </li><li> Wiederherstellen der oberen Phase, und wiederholen Sie diesen Schritt, bis untere Phase völlig frei von Kristallviolett wird angezeigt. </li><li> Am Ende wird die obere Phase abgetrennt und in Wasser auf eine Endkonzentration von 2% Methylgrün verdünnt. Diese Stammlösung ist auf der Werkbank über Monate stabil ist und nicht den Inhalt vor Licht geschützt werden müssen. </li></ol><ol><li> Fixieren die Embryonen über Nacht in 4% Formaldehyd (aus Paraformaldehyd) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). HINWEIS: Das kann von ein paar Stunden, um über Nacht abhängig von der Dicke der Embryonen. In dem Beispiel fest wir 48 Stunden nach der Befruchtung (HPF) Zebrafischembryonen über Nacht. </li><li> Dreimal 5 min waschen die Embryonen in PBS-T (1% Triton X-100 in PBS). Die erhöhte Konzentration des Reinigungsmittels permeabel die Nagelhaut. </li><li> Bereiten Sie eine 1: 5,000-1: 10.000 Lösung von Methyl-grün (2% Stammlösung) in PBS-T. Die Gegenwart von Detergens während der Inkubation ist nützlich für dicke Proben, wie Zebrafischembryonen und Larven. </li><li> Die Embryonen in der Lösung für mindestens 6 h Inkubation bei 4ºC unter leichtem Schütteln. Auch die Dicke des Embryos ist die Kalibrierparameter für die Dauer der Inkubationszeit. </li><li> Waschen Sie die Embryonen 3 times mit PBS für 30 min, um die Reinigungsmittelüberschuß zu entfernen. Methyl grüne Fluoreszenz ist nur offensichtlich, wenn die DNA gebunden ist, zu vernachlässigen ist somit Hintergrund von dem ungebundenen Molekül. </li><li> Berg auf einem ausgegrabenen Dia oder einem hausgemachten Kammer mit Montagelösung (75% Glycerin, 0,1 M Tris-HCl pH 8). HINWEIS: Wenn die Kernfärbung ist es, nach Immunmarkierung durchgeführt werden, kann Methylgrün an der Montagelösung in der Arbeitskonzentration eingebracht werden, ohne die Notwendigkeit, es abzuwaschen. </li><li> Einer Lagerung oder starten Bildgebung sofort. Führen Bildgebung mit einem konfokalen Laserraster (oder andere Fluoreszenz) Mikroskop mit einer Anregung bei 633 nm und Emissionsfilter eingestellt, um bei 650 bis 750 nm unter Berücksichtigung, dass grüne Emission sein Maximum bei 677 nm erreicht Methyl registrieren. Anmerkung: Wir stellen die Messdaten des Methylgrün Emissionsprofil, in das Erfassungssoftware geladen werden, als Zusatzmaterial. </li></ol> 3. Fluorescent Nuclear Staining von Whole Hühnerembryonen mit Methylgrün <ol><li> Befruchtete Hühnereier Inkubieren auf die Bühne von Interesse. Befestigen Sie die Embryonen über Nacht in 4% Formaldehyd (von Paraformaldehyd) in PBS bei 4 ° C. Waschen Embryonen 3 mal in PBS-T für 2 Std. </li><li> Bereiten Sie eine 1: 5,000-1: 10.000 Lösung von Methyl-grün (2% Stammlösung) in PBS-T. Die Embryonen in der Färbungslösung beimpft und über Nacht bei 4 ° C. 3 mal in PBS, jeweils 1 Stunde Waschen Sie die Embryonen. Berg in der Kammer mit 75% Glycerin, 0,1 M Tris, pH 8. </li></ol> 4. Imaging fluoreszierend markierten Zellkerne in Whole-montiert Embryos <ol><li> Bereiten Sie eine Imaging-Kammer durch Kleben mehreren Lagen Isolierband über einen Objektträger und vorsichtig ein Loch in sie mit einem Skalpell, um die Embryonen im Rahmen zu platzieren. Dies wird Embryonen aus Brechen während der Bilderzeugung zu verhindern. </li><li> Die Embryonen vorsichtig in die Abbildungskammer und füllt die Kammer bis zum Rand mit 75% Glycerin, 0,1 M Tris-HCl, pH = 8, um eineLeere Blasenbildung. </li><li> Deckel mit einem # 0 Deck Vermeidung oder Beseitigung von überquellenden Medium. Verschließen Sie diese mit Nagellack. </li><li> Erwerben Bilder der Probe auf einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Anregungsfilter 633 bzw. Laserlinie ausgestattet. HINWEIS: Emissionsfilter sollten die 677 Emissionsmaximum von Methylgrün decken. </li></ol>

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<li>Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemistry+on+Xenopus+embryos+using+far-red+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes.</a> Trends in genetics. 11 (1), 9(1995).</li>
<li>Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast%2C+low+cost%2C+and+highly+efficient+fluorescent+DNA+labeling+method+using+methyl+green%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green.</a> Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).</li>
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<li>Nordén, B., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+methyl+green+to+deoxyribonucleic+acid+analyzed+by+linear+dichroism%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism.</a> Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).</li>
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<li>Lenz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+in+thick+tissue+layers+by+linear+or+nonlinear+long-wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Applied%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation.</a> Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die fortschreitende Entwicklung der Mikroskopietechniken in den letzten Jahrzehnten, mit besonderem Schwerpunkt auf Variationen der Fluoreszenzmikroskopie, hat dazu geführt, dass die Dynamik und Struktur intakter Gewebeproben, einschließlich ganzer Embryonen, erforscht werdenkann 10,11. Eine große Einschränkung war jedoch die Verfügbarkeit von Fluorophoren von guter Qualität, die zur direkten und schnellen Färbung subzellulärer Strukturen verwendet werden können. 
Die am häufigsten ...

Die Fluoreszenzfärbung von DNA wird sowohl in der biologischen Forschung als auch in der klinischen Diagnose weit verbreitet und routinemäßig eingesetzt, entweder für die detaillierte Untersuchung der Kern- und Chromosomenstruktur, für die Gegenfärbung von Geweben und Zellen oder für die Untersuchung von Zellzyklusparametern1. Obwohl mehrere DNA-Färbungen verfügbar sind, sind die am weitesten verbreiteten diejenigen, die durch UV-Licht angeregt werden und in Blau emittieren, die in die üblichen Drei-Filter-Systeme passen, die in den meisten herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskopen verwendet werden, wenn sie mit grün und orange-rot emittierenden Fluorophoren kombiniert werden, wie z. B. fluoreszierenden Proteinen oder kleinen Molekülen, die an Antikörper gebunden sind. Unter diesen bläulich emittierenden DNA-Färbungen sind DAPI und Hoechst Minor Groove Binding Agentsdie häufigsten 2,3. Nichtsdestotrotz hat die Einbeziehung einer Vielzahl von Laseremissionslinien und die spektrale Detektion in Laser-Scanning-Mikroskope es den Forschern ermöglicht, sich für die Verwendung von tiefrot emittierenden Kernfärbungen wie Propidiumiodid (PI) oder TO-PRO 34 zu entscheiden. Ein Vorteil dieser Färbungen besteht darin, dass sie das Problem der Autofluoreszenz überwinden, das in vielen Zellen und Geweben zu finden ist, insbesondere bei Embryonen5, aber viele von ihnen haben unterschiedliche Probleme, wie z. B. breite Emissionsprofile oder eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Photobleiche6.
Der Schweizer Forscher Friedrich Miescher entdeckte 1869 die DNA, indem er sie aus den Kernen der weißen Blutkörperchen extrahierte, die im Eiter gefunden wurden. Er nannte es Nuclein und zeigte einige Jahre später, dass es Ausfällungen mit der relativ neuen Färbung Methylgrün bildete. Methylgrün besteht aus drei Anilinringen mit unterschiedlichem Methylierungsgrad und hat zwei positive Ladungen, die es ihm ermöglichen, stark an die Hauptrille der DNAzu binden 7,8. Die DNA-Färbung durch Methylgrün erwies sich sehr früh als spezifisch, was dazu führte, dass Unna und Pappenheim eine kombinierte Färbung mit Pyronin entwickelten, das spezifisch RNA markiert. Methylgrün-Pyronin wird seitdem in großem Umfang in der histologischen Routinetechnikeingesetzt 9.
Bis vor kurzem war sehr wenig über die fluoreszierenden Eigenschaften von Methylgrün bekannt. Unsere früheren Arbeiten haben jedoch einige der spektralen Vorteile von Methylgrün6 aufgedeckt, wie z. B. seine Anregung bei 633 nm, eine günstige Stokes-Verschiebung, seine Emission im nahen Infrarotbereich des elektromagnetischen Spektrums, eine höhere Photostabilität als kommerziell erhältliche DNA-Färbungen mit ähnlichen spektralen Eigenschaften und zu sehr geringen Kosten. Aus diesem Grund haben wir uns entschieden, es für die Verwendung als sehr hochaffine und spezifische Fluoreszenzmarkierung für DNA auf embryonalen Geweben und in ganzen Embryonen zu testen. Darüber hinaus wurde die Methylgrün-Kernfärbung bisher bei niedrigem pH-Wert durchgeführt, was die Kombination mit der Antikörperfärbung erschwerte. Das Ziel des hier beschriebenen Verfahrens ist es, ein Protokoll für die Fluoreszenz-Kern-DNA-Färbung zu haben, das die oben genannten Unannehmlichkeiten überwindet, indem das Färbeverfahren bei physiologischem pH-Wert durchgeführt wird, wodurch es zu einer geeigneten Gegenfärbung für die Immunmarkierung von Schnitten und ganzen Geweben wird.

<table><tbody><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Methylgrün</td><td>Dr. G. Gr&uuml; bler</td><td></td><td>Getestet auch Sigma-Aldrich 323829, das kristallviolettfrei ist</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie Leica TCS-SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin&ndash; Tetramethylrhodamin B-Isothiocyanat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td> P1951&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372978</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810 R</td><td>eppendorf</td><td>5811 000.010&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Deltalab</td><td>D100004</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Esco optics</td><td>R525025</td><td></td></tr></tbody></table>

anwendung der dna-spezifisches färbemittel, methyl green in der fluoreszenzmarkierung von embryos

Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos

Methylgrün ist seit langem als histologischer Farbstoff mit einer spezifischen Affinität zur DNA bekannt, obwohl seine fluoreszierenden Eigenschaften bis vor kurzem unerforscht geblieben sind. In diesem Artikel veranschaulichen wir das Verfahren zur Herstellung einer methylgrünen wässrigen Stammlösung, die nach Verdünnung als sehr praktische fluoreszierende Kernmarkierung für fixierte Zellen und Gewebe verwendet werden kann. Einfache Verfahren zur Beschriftung ganzer Zebrafisch- und Kükenembryonen werden detailliert beschrieben, und Beispiele für erhaltene Bilder werden gezeigt. Methylgrün wird durch rotes Licht bei 633 nm maximal angeregt und emittiert mit einem relativ scharfen Spektrum, das bei 677 nm seinen Höhepunkt erreicht. Es ist sehr preiswert, ungiftig, sehr stabil in Lösung und sehr beständig gegen Photobleichung, wenn es an DNA gebunden ist. Seine rote Emission ermöglicht eine unveränderte, hochauflösende konfokale Rasterbildgebung von Zellkernen in dicken Proben. Schließlich ist dieses Methylgrün-Färbeprotokoll mit anderen Zellfärbeverfahren kompatibel, wie z. B. der Antikörpermarkierung oder der Markierung von Aktinfilamenten mit Fluorophor-konjugiertem Phalloidin.

Kernfärbung von dicken Proben. Das Protokoll beschrieben gestattet das Erreichen einer homogenen Färbung von tiefen Strukturen in ganzen Embryonen. Entwicklungslinsenkerne Form 48 HPF Zebrafischembryonen homogen markiert (Abbildung 1). Methylgrün DNA-Färbung erlaubt die Unterscheidung von Zellzyklus-abhängigen morphologischen Unterschiede, wie beispielsweise die Identifizierung von Mitosen oder apoptotischen Kernen (2A). Subnuklearen Strukturen mit hoher Auf...

Es wird ein Verfahren zur Fluoreszenzfärbung von fixiertem biologischem Material mit der spezifischen DNA-Markierung Methylgrün beschrieben. Methylgrün wird in einer verdünnten wässrigen Lösung verwendet und ist sehr beständig gegen Photobleichung. Seine dunkelrote Emission ermöglicht die Bildgebung tiefer Proben und eignet sich daher besonders gut für ganze Embryonen.

Anwendung der DNA-spezifisches Färbemittel, Methyl Green in der Fluoreszenzmarkierung von Embryos

Methyl green has long been known as a histological stain with a specific affinity for DNA, although its fluorescent properties have remained unexplored ...

In diesem Video zeigen wir, wie die weit verbreitete histologische Färbung mit Methylgrün als äußerst praktikable Kernfärbung in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden kann, insbesondere in der Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie dicker biologischer Proben wie ganzer Embryonen. Nach einer kurzen Einführung in Methylgrün als DNA-spezifische Färbung beschreiben wir die Methode zur Herstellung von Stammlösungen und Arbeitslösungen für die fluoreszierende Färbung. Anschließend zeigen wir das experimentelle Vorgehen zur Erzielung einer Kernfärbung an mehreren Fischembryonen sowie Beispiele gewonnener konfokaler Aufnahmen.Schließlich werden die hervorragenden physikalisch-chemischen Eigenschaften von Methylgrün demonstriert und erörtert. Freddy Misha entdeckte 1869 die DNA und zeigte wenige Jahre später, dass sie mit einem relativ neuen Azofarbstoff und Färbemittel, Methylgrün, Niederschläge bildet. Methylgrün besitzt zwei positive Ladungen, die eine starke Wechselwirkung mit der DNA ermöglichen und bevorzugt an GC-reichen Regionen binden.Die umfangreichste Anwendung von Methylgrün war dessen Kombination in einer nasalen Lösung mit dem RNA-Farbstoff Perine, einem Methylfarbstoff, der zu Beginn des 20. Jahrhunderts von UNA und Poppen Heim entwickelt wurde. Über die fluoreszierenden Eigenschaften von Methylgrün wurde jedoch bisher sehr wenig untersucht, weshalb wir beschlossen, die Möglichkeit zu prüfen, dass es als fluoreszierende Markierung mit sehr hoher Affinität und Spezifität für DNA in Zellen verwendet werden könnte.Methylgrün ist ein Alkoholfarbstoff mit sieben Methylgruppen. Diese siebte Gruppe geht leicht verloren, wodurch es zu Kristallviolett zurückverwandelt wird. Aus diesem Grund wird eine bestimmte Menge Kristallviolett mit Methylgrün gemischt, um Kristallbildung zu verhindern.Die Lösung von Violett-Methylgrün kann mit Chloroform gewaschen werden, um Kristallviolett zu extrahieren. Wie wir gleich zeigen werden, stellen wir hierzu unter dem Abzug eine 4%ige ACU-Lösung her. Wir mischen sie mit mindestens zwei Teilen Chloroform und zentrifugieren, um die Phasentrennung zu beschleunigen.Nach der Zentrifugation erhalten wir eine wässrige Phase mit Methylgrün und eine untere organische Phase mit Chloroform und Kristallviolett. Wir sammelten die obere Phase ein und wiederholten den Vorgang, bis die untere Phase klar erscheint. Am Ende wird die obere Phase gewonnen und verdünnt.Diese Lösung ist monatelang stabil auf der Arbeitsfläche. Nun zeigen wir, wie man die gesamte Keimblattschicht in Embryonen mit Methylengrün einfärbt. Für die konfokale Mikroskopie verwenden wir Fischembryonen mit hoher Transparenz.Als Beispiel: Zebrafischembryonen gewinnen und mit einem Sieb von Ablagerungen befreien. In Fischaquarienwasser oder Embryomedium bis zum gewünschten Entwicklungsstadium inkubieren. Das Korium mit feinen Pinzetten entfernen und die Embryonen in 4 % Formaldehyd für einige Stunden oder über Nacht fixieren.Anschließend die Embryonen mehrmals mit PBST waschen. Eine Methylgrün-Arbeitslösung herstellen, indem die Stammlösung fünf- bis 10.000-fach in PBST verdünnt wird. Die Embryonen mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier °C in der Lösung inkubieren.In diesem Beispiel werden konfokale Bilder an einem weniger leistungsfähigen konfokalen Mikroskop mit spektralen Detektoren erhalten. Die maximale Anregung wird mit einem 633 Nanometer Laser erreicht und der Detektor auf einen breiten Bereich im roten Bereich des sichtbaren Spektrums eingestellt.Die rote Emission von Methylgrün ermöglicht eine hochwertige Kernabbildung auch aus tiefen Proben wie ganzen Embryonen mit minimalem Signalverlust. Diese erste Serie zeigt eine Zebrafischnetzhaut, deren Kerne mit einem etablierten DNA-Farbstoff gegen Drei gefärbt wurden. Nach einer Minute zoomen wir heraus.Ein ABL-Scan-Bereich wird deutlich, wenn wir das gleiche Experiment mit Methylengrün durchführen; hier ist keine offensichtliche Bleiche zu erkennen. In der folgenden Serie zeigen wir repräsentative Ergebnisse, die mit dem hier beschriebenen Protokoll erzielt werden können: eine mitotische Zelle aus dem Zebrafisch-Epidermis, in der Mitosefiguren beobachtet werden können. Ein IIC-Kern aus derselben Probe, in dem die nukleäre Architektur sichtbar ist.3D-Rekonstruktion eines Teils einer epidermalen Zelle eines Zebrafischembryos, markiert mit Methylgrün-Amalin, sowie eine umfassendere Ansicht unterschiedlicher Kernformen innerhalb eines 48 Stunden post Fertilisation alten Silberfischchens, br-Netzhaut. Hier haben wir eine einfache Methode zur Herstellung eines äußerst kostengünstigen fluoreszierenden DNA-Färbeverfahrens gezeigt, das zur Kernmarkierung verwendet werden kann. Obwohl wir lediglich das Halten mehrerer als Beispiel gezeigt haben, kann diese Technik auf Ihre Embryonen oder Gewebe angewandt werden, entweder als Ganzpräparat oder in Schnitten.Es kann auch zum Färben von DNA in Gelelektrophoresegelen sowie zur DNA-Bestimmung in Lösung mittels Photometrie verwendet werden.

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