Anwendung der DNA-spezifisches Färbemittel, Methyl Green in der Fluoreszenzmarkierung von Embryos

In diesem Video zeigen wir, wie der sehr verbreitete histologische Farbstoff Methylgrün als äußerst praktische Kernmarkierung in der Fluoreszenzmikroskopie mit den speziellen Anwendungen in der laserkonfokalen Mikroskopie von dicken biologischen Proben wie ganzen Embryonen verwendet werden kann. Nach einer kurzen Einführung von Methylgrün als DNA-spezifischer Farbstoff werden wir das Verfahren zur Herstellung von Stoff- und Arbeitslösungen für die Fluoreszenzfärbung beschreiben. Anschließend zeigen wir das experimentelle Verfahren zur Kernfärbung und halten mehrere Fischembryonen und Beispiele für konfokale Bilder.

Abschließend werden die hervorragenden physikalisch-chemischen Eigenschaften von Methylgrün demonstriert und diskutiert. Freddy Misha entdeckte 1869 die DNA und zeigte einige Jahre später, dass sie Ausfällungen mit einem relativ neuen Annal- und Methylgrün bildete. Methylgrün hat zwei positive Ladungen, die es ihm ermöglichen, stark mit der DNA in seiner Hauptgruppe zu interagieren und bevorzugt an reichweite Regionen zu binden.

Die am weitesten verbreitete Verwendung von Methylgrün war die Kombination in einer Nasenlösung mit dem RNA-Farbstoff Perin, einem Methyl, das zu Beginn des 20. Jahrhunderts von UNA und Poppen Heim entwickelt wurde. Die Fluoreszenzeigenschaften von Methylgrün wurden jedoch nur sehr wenig analysiert, weshalb wir uns entschlossen haben, die Möglichkeit zu testen, dass es als sehr hochaffine und spezifische Fluoreszenzmarkierung verwendet werden kann. Für DNA auf Zellen.

Methylgrün ist eine Al-Methan-Färbung mit sieben Methylwurzeln. Diese siebte Gruppe geht leicht verloren und fällt in Kristallviolett zurück. Aus diesem Grund gibt es eine Ankunftsmenge von Kristallviolett, gemischt mit Methylgrün, um Kristall zu entfernen.

Violette Methylgrünlösung kann mit Chloroform gewaschen werden, um Kristallviolett zu extrahieren. Wie wir gleich zeigen werden, bereiten wir zu diesem Zweck eine 4%ige ACU-Lösung unter einem Abzug vor. Wir mischen es mit mindestens zwei Teilen Chloroform und zentrifugieren, um die Phasentrennung zu beschleunigen.

Nach der Zentrifizierung erhalten wir eine wässrige Phase mit Methylgrün und eine untere organische Phase mit Chloroform und Kristallviolett. Wir haben die obere Phase wiederhergestellt und wiederholt, bis die untere Phase klar erscheint. Am Ende wird die obere Phase zurückgewonnen und verdünnt.

Diese Lösung steht monatelang stabil auf der Werkbank. Jetzt zeigen wir, wie man vorgeht, um ganze MO in Embryonen Schicht mit Methgrün zu pflegen. Für die konfokale Mikroierung verwenden wir den Fischembryo mit hohen Transplantaten.

Als Beispiel: Entnehmen Sie Zebrafischembryonen und waschen Sie den Schmutz mit einem Sieb ab. Inkubieren Sie sie bis zum gewünschten Stadium in Aquarienwasser oder Embryomedium. Entfernen Sie das Corium mit einer feinen Pinzette, fixieren Sie die Embryonen für einige Stunden oder über Nacht in 4% Formaldehyd.

Waschen Sie dann die Embryonen mehrmals in PBST. Bereiten Sie eine Methylgrün-Arbeitslösung vor, indem Sie die Stammlösung fünf- bis 10.000-mal in PBST verdünnen. Inkubieren Sie die Embryonen in der Lösung für mindestens drei Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad verringerter Celsius.

In diesem Beispiel werden konfokale Bilder in einem weniger konfokalen Mikroskop mit spektralen Detektoren aufgenommen. Die maximale Anregung wird mit einem 633 Nanometer Laser erreicht und der Detektor auf einen weiten Bereich eingestellt. Im roten Bereich des sichtbaren Spektrums.

Die Methyl-Grün-Rot-Emission ermöglicht es, selbst von tiefen Proben wie ganzen Embryonen mit minimalem Signalverlust eine qualitativ hochwertige nukleare Bildgebung zu erhalten. Diese erste Serie zeigt eine Zebrafisch-Netzhaut, deren Zellkerne mit einer gut etablierten DNA-Färbung auf pro drei gefärbt wurden. Nach einer Minute zoomen wir heraus.

Eine ABL-Scanregion wird deutlich, wenn wir das gleiche Experiment mit Methylgrün durchführen, es ist kein offensichtliches Bleichen zu sehen. In der folgenden Serie zeigen wir repräsentative Ergebnisse dessen, was mit dem hier beschriebenen Protokoll erhalten werden kann, mitotische Zellen aus der Epidermis des Zebrafisches, in denen mitotische Figuren beobachtet werden können. IIC-Kern aus derselben Probe, in der die Kernarchitektur zu sehen ist.

3D-Rekonstruktion eines Teils einer Epidermiszelle einer Zebrafischlarve, markiert mit methylgrünem Amalin, eine Panoramaansicht verschiedener Kernformen innerhalb einer 48-Stunden-Portbefruchtung, Silberfischchen, br-Netzhaut. Wir haben hier eine einfache Möglichkeit gezeigt, eine äußerst kostengünstige fluoreszierende DNA-Färbung herzustellen, die in der nuklearen Markierung verwendet werden kann, obwohl wir nur als Beispiel zeigen, dass die von mehreren gehalten werden. Diese Technik kann auf Ihre Embryonen oder Gewebe angewendet werden, entweder auf den gesamten Mount oder als Schnitt.

Es kann auch für die DNA-Färbung in Gelen und für die DNA-Bestimmung in Lösung mittels Photometrie verwendet werden.