Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, lipidbasierte vakzine Nanopartikel zu synthetisieren und zu charakterisieren sowie deren Fähigkeit zu bewerten, in vivo eine antigen-spezifische Expansion zytotoxischer T-Lymphozyten hervorzurufen. Dies wird erreicht, indem pathogenmimetische interbilagige, vernetzte multilamellare Vesikel oder I-CMVs, die gemeinsam mit Antigen und Adjuvans beladen sind, zur Impfung naiver Mäuse eingesetzt werden. Adoptiv übertragene, Luciferase exprimierende, antigenspezifische CD8-positive T-Zellen.

Im zweiten Schritt wird die Expansion der antigenspezifischen CD8-positiven T-Zellen mittels Ganzkörper-In-vivo-Bildgebung evaluiert. Aus peripherem Blut gewonnene mononukleäre Zellen von ICMV-immunisierten Tieren werden anschließend mit fluoreszenzmarkierten Tetrameren gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert, um die Häufigkeit der endogenen, antigenspezifischen CD8-positiven T-Zellen im systemischen Kompartiment zu quantifizieren. Letztendlich kann eine biolumineszente Bildgebung verwendet werden, um die Expansion der antigenspezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten als Reaktion auf die Nanopartikelimpfung zu verfolgen.

Mit diesen Methoden können wichtige vorläufige Fragen in der Impfstoffentwicklung beantwortet werden, beispielsweise wie stark die Expansion zytotoxischer T-Lymphozyten ausfällt und wie diese Zellen auf Nanopartikelimpfungen hin in verschiedene Gewebe wandern. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der In-situ-T-Zell-Analyse nach Gewebenekropsie, liegt darin, dass die in-vivo-Bildgebung der T-Zell-Antwort nicht invasiv ist. Dies ermöglicht die longitudinale Überwachung desselben Tieres. Beginnen Sie damit, ein molares Verhältnis von eins zu eins von DOPC und MPB in Chloroform zu mischen, wobei eine Gesamtlipidmenge von 1,26 Mikromol pro Ansatz in einer 20-Milliliter-Glasflasche beibehalten wird.

Fügen Sie anschließend den lipophilen Wirkstoff in der gewünschten Konzentration zur Lipidlösung hinzu und spülen Sie die Lösung mit zusätzlichem trockenem Stickstoffgas, um das organische Lösungsmittel vollständig zu entfernen. Stellen Sie die Probe über Nacht unter Vakuum. Am nächsten Morgen geben Sie 200 Mikroliter einer 10-Millimolar-BTP-Lösung, die den wasserlöslichen Wirkstoff der Wahl enthält, zu, um den Lipidfilm zu hydratisieren. Wirbeln Sie die resultierende Lösung alle 10 Minuten für jeweils 10 Sekunden eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Überführen Sie danach den Inhalt in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Als Nächstes wird das Röhrchen in ein Eiswasserbad gegeben und unter kontinuierlicher Beschallung mit der Intensitätseinstellung von 40 % an einer 125-Watt-20-kHz-Sondenkuppe soat durchgeführt. Nach fünf Minuten werden vier Mikroliter 150 Millimolar DTT zum Röhrchen gegeben, vortexiert, um es zu mischen, und die Probe in einer Mikrozentrifuge abzentrifugiert. Anschließend werden 40 Mikroliter 200 Millimolar Calciumchlorid in die Probe gegeben, gefolgt von der Vernetzung der MPB-haltigen Lipidschichten mit DTT bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.

Am Ende der Inkubation die Lösung dreimal zentrifugieren, wobei bei der zweiten und dritten Zentrifugation jeweils 200 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser hinzugefügt wird, um verbleibendes Calciumchlorid, nicht umgesetztes DTT und nicht eingeschlossene Frachtmaterialien aus dem Überstand zu entfernen. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt suspendieren wir die I-CMVs in 100 Mikrolitern frisch zubereitetem Pegol für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Anschließend die Vesikel noch zweimal mit doppelt destilliertem Wasser waschen.

Resuspendieren Sie das endgültige Pellet in PBS und lagern Sie die ICMV bei vier Grad Celsius. Zum Charakterisieren der Partikel mischen Sie die kalte ICMV-Suspension, bevor Sie eine kleine Aliquotmenge der Probe in einem Gesamtvolumen von einem Milliliter doppelt destilliertem Wasser verdünnen. Anschließend geben Sie die ICMVs in eine Zeta-Sizer-Zelle und messen mithilfe eines Systems zur dynamischen Lichtstreuung und zur Bestimmung des Zeta-Potentials gemäß den Herstelleranweisungen die Partikelgröße, den Polydispersitätsindex und das Zeta-Potential der Proben.

Um Luciferase-exprimierende CD8-positive T-Zellen aus Eizellen zu isolieren, zunächst die Milzen aus OT-I-Luciferase-transgenen Mäusen gewinnen. Die Gewebe in fünf Milliliter kalte PBS mit 2 % FBS geben und anschließend in eine Gewebekulturhaube stellen.

Verwenden Sie den Kolben einer 3-Milliliter-Spritze, um bis zu drei Milzen gleichzeitig durch einen 70-Mikron-Filter in ein 15-Milliliter-Konischglas zu zerkleinern. Spülen Sie den Kolben und den Filter mit PBS und 2 % FBS aus. Anschließend wird das Gesamtvolumen der Zellsuspension auf 10 Milliliter pro Milz aufgefüllt.

Bestimmen Sie die Gesamtzellzahl und pelletieren Sie anschließend die Zellen. Verwenden Sie danach ein handelsübliches magnetisches Negativselektionskit, um die CD8-positiven Milzzellen gemäß den Herstelleranweisungen zu isolieren. Waschen Sie die T-Zellen anschließend in PBS.

Zählen Sie sie und inkubieren Sie zwei- bis dreimal 10 hoch fünf der Zellen in 20 µL Maus-CD1632-Blockierantikörper. Nach 10 Minuten geben Sie 20 µL Anti-CD8a-APC-Antikörper zu den Zellen hinzu und inkubieren 30 Minuten lang. Überprüfen Sie die Reinheit der magnetisch isolierten, CD8-positiven T-Zell-Population mittels Durchflusszytometrie. Übertragen Sie anschließend ein- bis zehnmal 10 hoch fünf OT-I-Luciferase-CD8-positive T-Zellen adoptiv in naiv rasierter albino C57BL/6-Maus in 200 µL PBS über intravenöse Schwanzveneninjektion. 24 Stunden später verabreichen Sie den Impfstoff zum entsprechenden Zeitpunkt nach Impfung.

Spritzen Sie den Tieren 150 Milligramm pro Kilogramm Lucifer nach 10 Minuten, erfassen Sie das Biolumineszenzsignal für fünf bis 10 Minuten mit einem Ganzkörper-Bildgebungssystem, um die OT-eins-Lucifer-CD-acht-positiven T-Zellen sichtbar zu machen, um die Anzahl der antigenspezifischen CD-acht-positiven T-Zellen zum geeigneten Zeitpunkt zu bestimmen. Sammeln Sie nach der Impfung etwa 100 Mikroliter Blut von den geimpften Mäusen mittels der submandibulären Blutentnahmetechnik in ein mit Kalium-EDTA beschichtetes Röhrchen und drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, um eine Gerinnung zu verhindern. Überführen Sie anschließend 100 Mikroliter Blut in ein Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie ein Milliliter eines CK-Lysepuffers hinzu.

Nach zwei bis drei Minuten die Zellen zentrifugieren und den Überstand entfernen. Die verbleibenden PBMCs in einem Milliliter Fax-Puffer waschen und die unspezifische Bindung mit CD16/32, wie gerade gezeigt, blockieren. Nach 10 Minuten die Zellsuspension auf vier Milliliter-Rundboden-Fax-Röhrchen aufteilen und je nach Herstellerangaben 20 Mikroliter H2-Kb/OVA-Tetramer-PE-Lösung zu jeder Probe hinzufügen.

Nach 30 Minuten auf Eis fügen Sie 20 Mikroliter des entsprechenden Antikörpercocktails zu jeder experimentellen Probe und die einzelnen Fluoro-Vier-Kontrollantikörper für jeden Fluoro-Vier-Tag-Tetramer oder Antikörper zu jeder Kontrollprobe hinzu. Schließlich, nach einer weiteren 20-minütigen Inkubation, waschen Sie alle Proben in Fax-Puffer, resuspendieren die Pellets in Fax-Puffer, der mit DPI ergänzt wurde, und analysieren die Proben per Durchflusszytometrie. I-CMVs, die gemeinsam mit Fluoro-Vier-Takt-Proteinantigenen und fluoreszierenden lipophilen Farbstoffen beladen wurden, ermöglichen die Visualisierung der Antigen- und Nanopartikelabgabe in vivo. Beispielsweise zeigt die konfokale Mikroskopie-Aufnahme, dass lösliches Antigen, das subkutan an der Basis des Schwanzes verabreicht wurde, innerhalb von vier Stunden die drainierenden Lymphknoten erreicht und innerhalb von 24 Stunden abgebaut ist.

Im Gegensatz dazu werden überladene I-CMVs erstmals 24 Stunden nach der Verabreichung am Rand der drainierenden Lymphknoten nachgewiesen, wobei eine anhaltende Akkumulation zu einer starken Ablagerung von Ova-I-CMVs im drainierenden Lymphgewebe führt. Am vierten Tag zeigt in der Tat die Biolumineszenzbildgebung von C57BL/6-Mäusen, denen am Tag der Impfung OT-I-Luciferase-CD8-positive T-Zellen adoptiv übertragen wurden, einen minimalen Grundsignalpegel von OT-I-Luciferase-T-Zellen am vierten Tag nach der Impfung. Mäuse, die jedoch mit den Ova-MPI-CMVs immunisiert wurden, weisen ein starkes Biolumineszenzsignal in den drainierenden inguinalen Lymphknoten auf.

Die mit löslichem Ova geimpften Mäuse hingegen zeigen eine deutlich verminderte Expansion der OT-I-Lucifer-CD8-positiven T-Zellen in den drainierenden Lymphknoten. Darüber hinaus weisen Mäuse, die mit löslichem Ova und MPLA immunisiert wurden, ohne adoptive Übertragung antigenspezifischer T-Zellen, keine nennenswerte Expansion ovaspezifischer CD8-positiver T-Zellen auf, wie die wöchentliche Überwachung der PBMCs zeigte. ICMV-Impfungen hingegen lösen eine signifikant stärkere endogene CD8-positive T-Zell-Antwort aus, die bis zum Tag 41 einen Höhepunkt mit 28 % tetramerpositiver T-Zellen innerhalb des CD8-positiven T-Zell-Kompartiments in den PBMCs erreicht. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man lipidbasierte Nanopartikel synthetisiert, Impfungen durchführt und die Expansion zytotoxischer T-Lymphozyten (CTL) in vivo sichtbar macht und quantifiziert.

Diese Methoden können weiter modifiziert werden, um zusätzliche Informationen über die CTL-Antwort zu erhalten. Beispielsweise kann der Teer-Färbungs-Assay durch zusätzliche Marker wie CD127, BCL-2 und KLRG1 ergänzt werden, um das Gedächtnis-Phänotyp der Zellen zu bewerten.