Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, lipidbasierte Impfstoff-Nanopartikel zu synthetisieren und zu charakterisieren und ihre Fähigkeit zu bewerten, eine antigenspezifische zytotoxische T-Lymphozytenexpansion in vivo auszulösen. Dies wird durch die Entwicklung von Krankheitserregern erreicht, die zwischenschichtige, vernetzte Multilam-Vesikel oder I-CMVs nachahmen, die mit Antigen und Adjuvans beladen sind, für die Impfung naiver Mäuse. Adoptiv übertragen mit Luciferase-exprimierenden antigenspezifischen CD acht positiven T-Zellen.

Im zweiten Schritt wird die Expansion der antigenspezifischen acht positiven T-Zellen der CD durch Ganztier-in-vivo-Bildgebung untersucht. Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes, die von den ICMV-immunisierten Tieren entnommen wurden, werden dann mit fluoreszenzmarkierten Tetrameren gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert, um die Häufigkeit der endogenen antigenspezifischen CD8-positiven T-Zellen innerhalb des systemischen Kompartiments zu quantifizieren. Letztendlich kann die biolumineszierende Bildgebung verwendet werden, um die Expansion der antigenspezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten als Reaktion auf die Nanopartikel-Impfung zu verfolgen.

Diese Methoden können dazu beitragen, wichtige vorläufige Fragen bei der Impfstoffentwicklung zu beantworten, wie z. B. das Ausmaß der zytotoxischen tialen Lymphozytenexpansion und wie diese Zellen als Reaktion auf die Impfung mit Nanopartikeln zu verschiedenen Geweben gelangen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der in-situ T-Zell-Analyse nach Gewebeautopsie, besteht darin, dass die In-vivo-Bildgebung der TT-Zellantwort nicht-invasiv ist. Längsschnittüberwachung desselben Tieres Beginnen Sie mit dem Mischen eines molaren Verhältnisses von DOPC und MPB in Chloroform und halten Sie eine Gesamtlipidmenge von 1,26 Mikromol pro Charge in einem 20-Milliliter-Glasfläschchen aufrecht.

Geben Sie anschließend lipophile Fracht in der gewünschten Konzentration in die Lipidlösung und spülen Sie die Lösung mit extra trockenem Stickstoffgas aus, um das organische Lösungsmittel gründlich zu entfernen. Legen Sie die Probe über Nacht am nächsten Morgen unter Vakuum bei 200 Mikrolitern 10 Millimolar BTP, die die wasserlösliche Fracht von Interesse enthalten, um den Lipidfilm zu hydratisieren, wirbeln Sie die resultierende Lösung für 10 Sekunden alle 10 Minuten für eine Stunde bei Raumtemperatur auf. Füllen Sie dann den Inhalt in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Legen Sie dann die Röhre in ein Eiswasserbad mit kontinuierlicher Beschallung mit der Intensitätseinstellung von 40 % auf einer 125-Watt-Sondenspitze mit 20 Kilohertz. Nach fünf Minuten geben Sie vier Mikroliter 150 millimolares DTT in den Röhrchenwirbel, um die Probe zu mischen und in einer Mikrozentrifuge zu schleudern. Mischen Sie dann 40 Mikroliter 200 millimolares Calciumchlorid in die Probe, gefolgt von einer einstündigen Vernetzung der MPB-haltigen Lipidschichten mit DTT bei 37 Grad Celsius.

Am Ende der Inkubation wird die Lösung während der zweiten und dritten Zentrifugation dreimal bei 200 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser heruntergeschleudert, um das verbleibende Calciumchlorid, das nicht umgesetzte DTT und die unverkapselten Frachtmaterialien aus dem Überstand zu entfernen. Nach dem letzten Schleudern suspendieren wir die I CMVs für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in 100 Mikrolitern frisch zubereitetem Pegol. Waschen Sie dann die Vesikel noch zwei weitere Male in doppelt destilliertem Wasser.

Reanimation des endgültigen Pellets in PBS und Lagerung des ICM VS bei vier Grad Celsius. Um die Partikel zu charakterisieren, mischen Sie die kalte ICMV-Suspension, bevor Sie ein kleines Aliquot der Probe in einem Gesamtvolumen von einem Milliliter doppelt destilliertem Wasser verdünnen. Platzieren Sie dann die I CMVs in einer Zeta-Sizer-Zelle und verwenden Sie ein dynamisches Lichtstreu- und Zetapotenzial-Messsystem, um die Partikelgröße, den Polydispersitätsindex und das Zetapotenzial der Proben gemäß den Anweisungen des Herstellers zu messen.

Zur Isolierung von zellspezifischen Luciferase-exprimierenden Zöliakie-Acht-positiven T-Zellen. Ernten Sie zunächst die Milz von OT one Luciferase-transgenen Mäusen. Legen Sie das Gewebe in fünf Milliliter eiskaltes PBS und 2%FBS und dann in eine Gewebekulturhaube.

Verwenden Sie den Kolben einer Drei-Milliliter-Spritze, um bis zu drei Milz gleichzeitig durch ein 70-Mikron-Sieb in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu mahlen. Waschen Sie den Kolben und das Sieb mit PBS und 2%FBS. Bringen Sie dann das Gesamtvolumen der Cyt-Suspension auf 10 Milliliter pro Milz.

Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen und drehen Sie die Zellen nach unten. Verwenden Sie anschließend ein handelsübliches magnetisches Negativ-Auswahlkit, um die acht positiven Milzzellen der CD gemäß den Anweisungen des Herstellers zu isolieren. Waschen Sie dann die T-Zellen in PBS.

Zählen Sie sie und inkubieren Sie zwei- bis dreimal 10 bis fünf der Zellen in 20 Mikrolitern Maus-CD 1632-blockierenden Antikörpern. Nach 10 Minuten fügen Sie den Zellen 30 Minuten lang 20 Mikroliter Anti-CD 8 A PC-Antikörper hinzu und beurteilen Sie die Reinheit der mit Magnetbeads isolierten CD 8-positiven T-Zellpopulation durch Durchflusszytometrie. Als nächstes übertragen Sie adoptiv eine bis 10 mal 10 auf die fünfte OT, eine Luciferase CD, acht positive T-Zellen in naive rasierte Albino C 57 schwarze, sechs Mäuse in 200 Mikrolitern PBS durch intravenöse Schwanzveneninjektion 24 Stunden später und verabreichen Sie den Impfstoff in der entsprechenden Anzahl von Tagen nach der Impfung.

Injizieren Sie den Tieren nach 10 Minuten 150 Milligramm pro Kilogramm Luzifer, erfassen Sie das Biolumineszenzsignal für fünf bis 10 Minuten mit einem Ganztier-Bildgebungssystem, um die OT zu visualisieren eine Luzifer CD acht positive T-Zellen zur Bestimmung der Anzahl der antigenspezifischen CD acht positive T-Zellen zum geeigneten Zeitpunkt. Nach der Impfung werden ca. 100 Mikroliter Blut von den geimpften Mäusen über die submandibuläre Blutungstechnik in ein mit Kalium-EDTA beschichtetes Röhrchen gefüllt und das Röhrchen mehrmals umgedreht, um eine Gerinnung zu verhindern. Übertragen Sie dann 100 Mikroliter Blut in ein Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie einen Milliliter eines CK-Lysepuffers hinzu.

Nach zwei bis drei Minuten zentrifugieren Sie die Zellen und entfernen den Überstand. Waschen Sie den restlichen PBMC in einem Milliliter Faxpuffer und blockieren Sie die unspezifische Bindung mit CD 1632, wie gerade gezeigt. Nach 10 Minuten wird die Zellsuspension in vier Milliliter Faxröhrchen mit rundem Boden aufgeteilt und jeder Probe gemäß den Herstellerangaben 20 Mikroliter H zwei KB über Tetramer syn fäkale PE-Lösung zugesetzt.

Nach 30 Minuten auf Eis werden 20 Mikroliter des entsprechenden Antikörpercocktails in jede Versuchsprobe und die einzelnen Fluor-Vier-Kontroll-Antikörper für jedes Fluor-Vier-Tag-Tetramer oder Antikörper in jede Kontrollprobe gegeben. Nach einer weiteren 20-minütigen Inkubation waschen Sie schließlich alle Proben in Faxpuffer, resuspendieren die Pellets in Faxpuffer, der mit DPI ergänzt wird, und analysieren Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie I CMVs, die mit Fluor-Vier-Takt-Proteinantigenen und fluoreszierenden lipophilen Farbstoffen beladen sind, ermöglichen die Visualisierung der Antigen- und Nanopartikelabgabe in vivo. Zum Beispiel zeigt die konfokale Mikroskopie, dass lösliches Antigen, das subkutan an der Basis des Schwanzes abgegeben wird, innerhalb von vier Stunden nach der Verabreichung die drainierenden Lymphknoten erreicht und nach 24 Stunden beseitigt ist.

Im Gegensatz dazu werden überladene I-CMVs erst 24 Stunden nach der Verabreichung an der Peripherie der drainierenden Lymphknoten nachgewiesen, wobei es zu einer fortgesetzten Akkumulation kommt, die zu einer großen Ablagerung von Ova I-CMVs im drainierenden Lymphgewebe führt. Am vierten Tag zeigt die Biolumineszenz-Bildgebung von C 57 BL sechs Mäusen, die adoptiv mit OT übertragen wurden, eine Luciferase CD und acht positive T-Zellen am Tag der Impfung einen minimalen Hintergrundspiegel von OT und einer Luciferase-T-Zelle am vierten Tag nach der Impfung. Mäuse, die mit den MPI-CMVs immunisiert wurden, zeigen jedoch ein robustes Biolumineszenzsignal in den drainierenden leistenförmigen Lymphknoten

Die mit löslichen Eizellen geimpften Mäuse zeigen dagegen eine stark reduzierte Expansion der OT one Lucifer CD acht positiven T-Zellen innerhalb der drainierenden Lymphknoten. Darüber hinaus zeigten Mäuse, die mit löslichen Eizellen und MPLA immunisiert wurden, ohne dass ein adoptiver Transfer von Antigen-spezifischen T-Zellen stattgefunden hätte, keine nennenswerte Expansion von ovaspezifischen Zölia-8-positiven T-Zellen, wie die wöchentliche Überwachung der pbmc-ICMV-Impfung zeigte, führte jedoch zu einer signifikant stärkeren und endogenen Zöliakie-8-positiven T-Zellantwort, die einen Spitzenwert von 28 % der synfäkalen Tetramer-positiven T-Zellen innerhalb des acht positiven T-Zellkompartiments von CD 8 erreichte. PBMC bis Tag 41. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man lipidbasierte Nanopartikel synthetisiert, Immunisierungen durchführt und die CTL-Expansion in vivo visualisiert und quantifiziert

Diese Methoden können weiter modifiziert werden, um zusätzliche Informationen über die CTL-Antwort anzuzeigen. Zum Beispiel kann der Teer-Färbeaufsatz mit zusätzlichen Markern wie CD 1 27, BCL zwei und K lrg eins ergänzt werden, um den Gedächtnisphänotyp der Zellen zu beurteilen.