Name: Funktionale Menschliche Leber Erhaltung und Rückgewinnung mittels Subnormothermic Maschine Perfusion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Lernen Sie die subnormotherme Maschinenperfusion menschlicher Lebern bei 21 °C zur Erhaltung, Wiederherstellung und Funktionsbewertung des Organs. Diese Methode ermöglicht die metabolische Analyse außerhalb des Körpers.

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Mittel aus den US National Institutes of Health (gewährt R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962 und F32 DK103500) Cimit Projekt Nr 12-1732 und die Shriners Hospitals for Children wird dankbar anerkannt. Wir möchten danken für die New England Organbank für die Unterstützung dieser Arbeit.

Die Verwendung von menschlichem Gewebe muss von einer Ethikkommission (IRB) oder gleichwertig geprüft. Die hier beschriebene Arbeit wurde genehmigt und vom Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (Nr 2011P001496) befreit erklärt. 1. Herstellung der Lösung <ol><li> Aseptisch Ergänzungsmittel in den roten freien Williams Medium E Phenol wie in Tabelle 1 dargestellt. Die Lösung muss frisch vor Gebrauch hergestellt werden. Insulin sollte unmittelbar vor Gebrauch hinzugefügt werden. </li></ol> 2. Zurück Tabelle Vorbereitung der Leber <ol><li> Ein mit Eis gefüllte Organ Schüssel auf einem sterilen, drapiert Oberfläche. Entfernen Sie die Leber aus der Box, so dass es in der Tasche von Kaltkonservierungslösung. Halten Sie die Leber vor allem unter Wasser. </li><li> Identifizieren Sie die Leberarterie (HA), der mit dem Aorten-Patch distal angesiedelt werden soll. Präparieren Sie kostenlos die Arterie zu verschiedenen abgeschnittenen Zweigen entlang der Länge mit Metzenbaumschere offenbaren. Sorgfältig dissect die gesamte Länge der Arterie Abtrennen eines Schiffes, das die Leber versorgt verhindern. Schneiden Sie nicht oder binden Sie Zweige, die nicht über eine sichtbare Ende. </li><li> Binden Sie alle Arterienäste die Leber mit Seidenfaden von Größe 0 bis 4-0, abhängig von der Größe des Schiffes nicht liefern. Schließen Zweige, die zu kurz sind, zu binden oder Löcher in der Arterie mit einer Masche des 7-0 Prolene. Krawatte und schneiden Sie die Milz und linken Magen-Arterien in der Nähe von ihrem Ursprung auf der Truncus coeliacus. </li><li> Entfernen Sie die Aorten-Patch durch Schneiden des Truncus coeliacus direkt unter dem Pflaster. Kanülieren den Truncus coeliacus mit dem Aortenkanüle. </li><li> Identifizieren Sie die Pfortader (PV) und stumpf sezieren kostenlos. Binden Sie alle Filialen und kanülieren die PV mit dem vorbereiteten Segment der Größe 24 Schläuche. </li><li> Teile der Membran entfernen vom suprahepatischen Hohlvene, ohne Schneiden der Vene selbst. Mittelabfluss aus der Hohlvene Kanalisation direkt in die Organkammer. </li><li> Schneiden Sie 2 Vollumfang tiSSUE Proben (2-3 mm Länge) aus dem Ende des gemeinsamen Gallengang; Schnapp frieren ein in flüssigem Stickstoff (bei -80 ° C) und speichern Sie die anderen in 10% Formalin, für Gewebe und histologische Analyse auf. Kanülieren Choledochus mit der Gefäßkanüle und einem Ablaufrohr der Membranoxygenator Rohr. </li><li> Identifizieren und zu ligieren den Cysticus mit einem 0 Seidenkrawatte. Die Gallenblasengang zwischen dem Gallengang und der Gallenblase gefunden. </li><li> Schließen Sie den Schlauch an bündig eiskalten Taschen von Ringer-Laktat (LR) Lösung und erstklassigen die Schläuche, die Beseitigung aller Luft gesetzt. </li><li> Stellen Sie den Durchflussregler auf der bündig Schlauch auf ein langsames Einblasen. Vor dem Anschließen des bündig Schlauch an der Pfortader Kanüle, verschließen die Pfortader mit den Fingern am Hilus und füllen Sie die Kanüle und Vene mit Flush, um die Luft aus der Pfortader zu entfernen. Während der kalten Spülung erhöhen Sie nicht die Tasche mehr als 20 cm über die Höhe der Leber, übermäßigen Druck auf das zu vermeidenVene. </li><li> Während der bündig kurz verschließen die PV an der tiefsten Stelle. Überprüfen Sie die PV auf Dichtheit prüfen. Vessel Äste ab, wie oben beschrieben geschlossen werden. Spülen Sie die Leber durch die PV mit insgesamt 2 l eiskaltem LR. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.10, 2.11 für den HA mit 1 l LR. </li></ol> 3. Grundierung der SNMP-System <ol><li> Prime das Perfusionsvorrichtung durch Zugabe von 2 l Perfusat (21 ° C), um das Organ Schüssel und der Inbetriebnahme des Gerätes, um prime den Schlauch. Befolgen Sie die Anweisungen des Geräts, um die Perfusion Vorbereitung Einstellen der Temperatur auf 21 ° C. Beginnen mit Drücken von 3 mmHg und 30 mmHg auf der PV und ha. Öffnen Sie den Gastank und einem Durchfluss von 3 l / min eingestellt. </li><li> Nehmen eines Blutgasprobe sowohl von dem HA und PV Einströmen durch Ziehen einer 0,3 ml Probe aus der Probenöffnungen läuft, ist sie in dem Blutgasanalysegerät nach den Anweisungen des Herstellers. Bestätigen angemessene Sauerstoffversorgung (pO 2&gt; 700 mmHg) und pH-Wert (7,35 bis 7,45). </li><li> Bevor die Leber verbunden einen 1,0 ml Probe des Perfusat als bei = 0 Messung in ein Eppendorf-Röhrchen und bei -80 ° C. Schneiden Sie zwei ± 250 mg Keil Biopsien aus der Leber mit Hilfe eines einseitig geschliffene Klinge aus Stahl; Schnapp frieren ein in flüssigem Stickstoff (bei -80 ° C) und speichern Sie die anderen in 10% gepuffertem Formalin. Wiegen Sie die Leber vor Perfusion. </li></ol> 4. Menschliche Leber Perfusion <ol><li> Übertragen Sie die Leber in das Gerät. Schließen Sie den PV Zulauf zur PV-Kanüle nach Entfernen von Luft aus dem PV, wie in Schritt 2.10. Schließen Sie das HA in ähnlicher Weise. Set PV und HA Druck bis 3 und 30 mmHg. Die Leber ist fast von Perfusat getaucht werden. Decken Sie trockenen Oberflächen, einschließlich der Zufluss Gefäße, mit nassen steriler Gaze, um eine Austrocknung zu verhindern </li><li> Lassen Sie die Gallenabflussschlauch in einen Auffangbehälter. Sicherstellen, dass die Öffnung des Gallen Drain ist auf dem Niveau der Leber oder niedriger, damit Gallen ausgeführt out frei. </li><li> Ziel Flußraten 275-325 ml / min.kg und 50-100 ml / min.kg für die PV und HA je einmal die Leber auf 21 ° C erwärmt. Da jeder Leber Perfusion reagiert anders, überwachen den Fluss eng in den ersten Minuten. Erhöhen oder Verringern des Drucks auf eine der beiden Schiffe, wenn die Zielfließgeschwindigkeiten nicht erreicht werden. 50 mmHg auf der HA und 5 mmHg auf der PV nicht überschreiten. </li><li> Die Proben können von der Lebergewebe, Perfusat und Galle an der Ermittler bevorzugt berücksichtigt werden. Wir empfehlen mindestens den folgenden Beispielsammlung Regime während der Perfusion. <ol><li> Gewebebiopsien, n = 2 x 250 mg, jede Stunde. Lagerung: Snap frieren ein in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C langfristig. Darüber hinaus nehmen Sie eine weitere Biopsie vor und nach der Perfusion und fixieren in 10% gepuffertem Formalin (n = 1) </li><li> Perfusatproben, n = 2x 1 ml, 15 min in der ersten Stunde und alle 30 Minuten danach. Zeichnen Proben aus dem PV-infgeringe Probenöffnung. Lagerung: -80 ° C langfristig. </li><li> Blutgasanalyse von PV und HA Zufluss und Hohlvenenabfluss. n = 3 x 0.3 ml, alle 30 min. Zeichnen Proben sowohl von der PV und HA Probe-Anschlüsse. Zeichnen Sie eine 0,3 ml Probe aus der Hohlvene durch Einsetzen einer Spritze in die Vene und direkt in die Blutgasanalysegerät ausgeführt werden. Verwenden Sie die Ausgabe, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung und pH-Wert zu gewährleisten. </li><li> Gallenflüssigkeit, n = 1 x 1 ml jeder hr. Visuell quantifizieren Galle Produktion stündlich eine Probe aus dem Sammelbehälter. Erneuern Sie den Behälter nach der Probenahme. Lagerung: Trockeneis und -80 ° C langfristig. </li></ol></li><li> Weiter Perfusion 3 Stunden. Die Überwachung der Druck, pH und die Sauerstoffversorgung und die Entnahme von Proben im gesamten. Stellen Sie die er pH durch Zugabe von Natriumbicarbonat zu dem Perfusat. </li><li> Am Ende der Perfusion die Abschluss Proben während die Leber ist perfundiert wird. Trennen Sie die Leber und entfernen Sie den Gallengang Kanüle. Nehmen Sie 2 Post-Perfusion Gewebeproben von derGallengang nach wie vor für die Lagerung bei -80 ° C und in 10% gepuffertem Formalin beschrieben. </li><li> Entsorgen Sie die menschliche Leber nach einer ordnungsgemäßen Biohazard Entsorgungsrichtlinien. </li></ol>

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Drs. WERDEN Uygun, K Uygun und Yarmush sind Erfinder auf einen anhängigen Patent, die für diese Studie (WO / 2011 / 002.926), und Drs ist. WERDEN Uygun, K Uygun und Yarmush sind Erfinder auf einen anhängigen Patent, die für diese Studie (WO / 2011/35223) ist. Drs. K Uygun und Bruinsma eine vorläufige Patentanmeldung zu dieser Arbeit. Dr. K Uygun und BE Uygun haben ein finanzielles Interesse an Organsysteme, ein Unternehmen auf die Entwicklung von Organkonservierungstechnik. Dr. K Uygun und BE Interessen Uygun werden von der MGH und Partners Healthcare entsprechend ihrer Interessenkonflikt Politik verwaltet.

In einem Versuch, Leber während der Ischämie verletzten erhalten wir eine SNMP-System, das nach einer Periode der kalten Lagerung verwendet werden können, entwickelt. Subnormothermic Maschine Perfusion bietet eine echte Alternative zu herkömmlichen Kühllager sowie Hypothermie und normothermen Maschine Perfusion Modalitäten. Verschiedene unterschiedliche Systeme existieren; alle bieten unterschiedliche Vor- und Nachteile 3,9,20. SNMP ermöglicht die Perfusion ohne Sauerstoffträger, wie Stoffwechselsauerstoffbedarf bei 21 ° C durch aktive Sauerstoffanreicherung des Perfusat erfüllt. Obwohl unter subnormothermic Bedingungen reduziert, ist Stoffwechsel erheblich und erfordert die Unterstützung eines nährstoffreichen Perfusionslösung. Traditionelle Perfusionslösungen wie die Belzer Maschine Perfusionslösung, sind im allgemeinen in der Zusammensetzung minimal und sind zum Kalt Perfusion gestaltet. Williams &#39;Medium E wurde als Hepatozyten-Kulturmedium für viele Jahre verwendet worden und enthält componenten, die universell für die Unterstützung Zellfunktion, insbesondere unter warmen ex vivo Bedingungen. Messungen während des Maschinen Perfusion hergestellt sind repräsentativ für die Funktion des Organs. Direkt beobachtbaren Parametern wie Gallenproduktion und Sauerstoffaufnahme sind Echtzeitmessungen, die verwendet werden kann, um die Leber vor der Transplantation zu beurteilen. Auf ähnliche Weise können Marker der Zellverletzung und Ischämie (K +, Laktat Mitteilung) direkt in der Perfusionslösung gemessen werden und kann ein Hinweis auf Organfunktion 20 sein. Als Maschine Perfusion Technik weiterentwickelt und erreicht weiter verbreitet klinische Anwendung kann eine genaue Korrelation zwischen Ex-vivo-Funktion und dem klinischen Ergebnis durchgeführt werden und Perfusionsparameter nützlich bei der Unterstützung von Entscheidungen zu verpflanzen oder ablehnen Randqualität Leber sein. Außerdem ist, wie Point-of Pflege Analyse-Tools voraus, anspruchsvollere Analyse wird direkt in der Maschine Perfu verfügbarsion 21. In dieser Arbeit zeigen wir, dass Leber können in der SNMP-System mit minimaler Schädigung der Leber unterstützt werden, durch Histologie und Freigabe ALT wider. Funktionelle Erholung der Leber wird am besten durch ATP, die gezeigt wurde, dass die Leberfähigkeit korreliert und ist deutlich für Transplantation Erfolg im Tiermodell 22 reflektiert. Würde Ex vivo und vor der Transplantation Erholung der Lebertransplantate eine deutliche Ausweitung des Spenders erlauben Leberpool, Korrektur der Diskrepanz zwischen Angebot und Nachfrage von Spenderlebern in der Transplantationsmedizin.

Die Lebertransplantation ist die einzige kurative Behandlung für Zehntausende von Patienten, die im Endstadium einer Lebererkrankung leiden. Zur Erleichterung erfolgreiche Transplantation, optimale Konservierung der Leber von der Zeit ist es aus dem Spender bis zu der Zeit wird in dem Empfänger implantiert ist notwendig, um eine schnelle Verschlechterung des Transplantats zu verhindern, beschafft. Der aktuelle Standard für Leberkonservierung wird &quot;statische Kühllagerung&quot; bezeichnet: die Leber in eine eiskalte Konservierungslösung abgekühlt, wodurch der Stoffwechsel der Leber reduziert und verlangsamt die schädlichen Auswirkungen von Ischämie. Obwohl diese Kühllager Technik wurde für die erfolgreiche Transplantation erlaubt, Organe der Randqualität wie DCD Organe durch warme Ischämie oder Steatose Show unterlegen Patienten beschädigt Ziele 1. Es gibt einen schnell wachsenden Körper des Beweises, dass ex vivo Perfusion Maschine von Lebertransplantationen als Alternative Erhaltung Modalität kann möglicherweise imbeweisen Ergebnisse für diese Grenzorgane 2,3. Lebertransplantation hat sich zu einem Opfer seines eigenen Erfolgs. Weit mehr Patienten für eine Transplantation bezeichnet, als es Leber vorhanden und von tausenden sterben auf der Warteliste in den Vereinigten Staaten jedes Jahr. Angesichts der Realität der Spenderleber Knappheit und die zunehmende Nutzung von Lebertransplantationen suboptimaler Qualität für bedürftige Empfänger ist es weit verbreitet, dass ex vivo Perfusion Maschine von Lebertransplantationen vor der Implantation verspricht einen Paradigmenwechsel in Lebertransplantation. Es hat eine deutliche Steigerung in der Forschung Interesse an diesem Thema in den letzten Jahren 4-8. In verschiedenen europäischen und nordamerikanischen Zentren hypothermen Perfusion Maschine gemacht hat eine klinische Einführung 8 und normothermen Maschine Perfusion bei physiologischen Temperaturen hat kürzlich verworfen menschlichen Leber angewendet worden und wird für die klinische Anwendung und 9 umgerechnet.Intensive Entwicklungen für die Entwicklung der verschiedenen Protokolle geführt, während die kontinuierliche Optimierung identifiziert die optimale Durchblutung Parameter 10-12. Nutzung marginaler Qualität Transplantate wurde um mehr als 10-mal im letzten Jahrzehnt 13. Wenn der aktuelle Standard für Leberkonservierungs (statisch oder einfriert) verglichen wird, bietet ex vivo Maschine Perfusion zahlreiche potentielle Vorteile, von denen alle zu dringend benötigte Ausdehnung des Organs Pool und eine möglicherweise in der Inzidenz des postoperativen Komplikationen zu verringern. Insbesondere die biliäre Komplikationen, die derzeit nach der Transplantation plagen suboptimale Qualität Lebertransplantate bleibt eine wesentliche Frage 14-18. Maschine Perfusion bei subnormothermic Bedingungen bietet ein Zeitfenster, um Transplantatfunktion objektiv hinsichtlich Eignung für die Transplantation 19 zu bewerten. Während die Leber wird in einem ex vivo-Schaltung perfundiert sowohl das Perfusat einend die während der Perfusion produziert Galle für die Messung der Marker der Organfunktion zu beproben. Auf diese Weise &quot;stark beeinträchtigt&quot; Leber, die für die Transplantation unter den derzeitigen Kriterien verworfen werden objektiv auf ihre Eignung für die Transplantation zu bewerten. Lebensfähigkeit Abschätzung erlaubt möglicherweise für viele dieser Organe für die Transplantation verwendet werden. Ein ebenso leistungsfähigen Vorteil der Maschine Perfusion ist die Reparatur und Verbesserung der Leber, die durch warme / kalte Ischämie geschädigt wurden. ATP sehr schnell während der warmen und anschließende Kaltischämiezeit abgereichert und kann während eines Zeitraums von Maschinen Perfusion vor der Implantation der Leber 20 repleted werden. Die Leber, mit seinen Energiespeicher und Stoffwechsellage aufgefüllt wird vorbehandelt und besser für den schädigenden Auswirkungen der Reperfusionsschaden nach der Implantation in den Empfänger bereit. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur ex vivo-Maschine Perfusion von menschlichen Leber grafts im Labor, was nützlich für Forscher, die sowohl die Technik und die wohltuende Wirkung der Ex-vivo-Perfusion Maschine studieren möchten sein wird. Wir nutzen die menschliche Spenderlebern, die für die Transplantation abgelehnt wurden und dann für Forschungszwecke bereitgestellt. Standard Leber Beschaffung Technik beinhaltet in situ arteriellen bündig der Leber nach Aorten Querspann in hirntoten Spendern (DBD) oder nach dem Kreislaufstillstand in Kreis Tod Spender (DCD), an anderer Stelle 20 beschrieben. Zusätzlich wird die Leber während des Vergabe indem Bauchhöhle des Spenders mit Eis gekühlt. Spüllösung Vorlieben variieren zwischen den Regionen, wobei die Mehrzahl der Beschaffungen mit dem University of Wisconsin oder Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat (HTK) Lösung. Ein zusätzlicher Back-Tisch bündig der Pfortader verbessert das Auswaschen der Restblut. Livers oft beschafft Verlassen einer Aortensegment surRundung des Truncus coeliacus. Die Gallenblase wird eingeschnitten, Gallen wird abgesaugt, und der Gallengang gespült. Die Lebern werden in sterilen Beutel mit eiskaltem Konservierungslösung verpackt und in dafür vorgesehenen Boxen oder Kühler transportiert. Für repräsentative Ergebnisse sollten warme und kalte Ischämiezeit bis 60 min und 12 h zuge begrenzt. Trotz Routine serologische für übertragbare Krankheitserreger, müssen Standard Vorkehrungen bei der Abgabe menschlichen Organen werden Proben von menschlichen Organen gewonnen und keine Abfallprodukte. Das Protokoll hier beschrieben subnormothermic Maschine Perfusion mit einem handelsüblichen Leberperfusion Gerät. Die Verwendung einer solchen Vorrichtung ermöglicht eine schnelle Umsetzung zu den klinischen und Kreuzvalidierung von unterschiedlichen Protokollen und Geräteeinstellungen zwischen Forschungsgruppen und Transplantationszentren.

<table><tbody><tr><td>Leber-Assist-Perfusionsgerät</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>Liver Assist</td><td></td></tr><tr><td>Liver Assist Einweg-Set</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>Liver Assist Einweg-Williams</td><td></td></tr><tr><td> Medium E</td><td>Sigma</td><td>W1878&ndash; 6x500ml</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Eli Lilly & Co</td><td>Humulin R U-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-156</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>MGH Apotheke</td><td>7750500</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen Gastank 95% O2/5% CO2</td><td>Airgas</td><td>ZO2OX9522000043</td><td></td></tr><tr><td>Spezialgasregler</td><td>Airgas</td><td>Y11244D580</td><td></td></tr><tr><td>Lactated Ringer' s Lösung</td><td>Baxter</td><td>2B2324X</td><td></td></tr><tr><td>10% neutral gepuffertes Formalin</td><td>Fischer Scientific</td><td>316-155</td><td></td></tr><tr><td>Zahnzange Adson</td><td>Roboz</td><td>RS-5234</td><td></td></tr><tr><td>Debakey Gewebezange, 7.75", 2.25 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-7562</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum Schere 7" Gebogen SureCut Wolfram</td><td>Roboz</td><td>RS-6965SC</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Nadelhalter 5.5&ndash; 7"</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>0 schwarz geflochtene Seidennähte</td><td>Ethicon</td><td>SA66G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Nylonnaht, Nurolon RB1</td><td>Ethicon</td><td>C554D</td><td></td></tr><tr><td>Blutgasana</td> Gerät <td>Siemens</td><td>RapidPoint 500</td><td></td></tr><tr><td>Waage</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-10000-12</td><td></td></tr><tr><td>Druckanzeigebox</td><td>Medtronic</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Druckanzeige-Sets</td><td>Medtronic</td><td>61000</td><td></td></tr><tr><td>Hand-Thermoelement-Thermometer und -Sonde</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-91500-04 und EW-08516-55</td><td></td></tr><tr><td>Eichelkanüle, 4 mm</td><td>Medtronic</td><td>30005</td><td></td></tr><tr><td>Spülset Spülschlauch</td><td>Hospira</td><td>06543-01</td><td></td></tr><tr><td>Rührschüssel, 4 L</td><td>Cole Parmer</td><td>Artikel-Nr.: EW-07300-40</td><td></td></tr></tbody></table>

funktionale menschliche leber erhaltung und rückgewinnung mittels subnormothermic maschine perfusion

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Es besteht derzeit ein gravierender Mangel an Lebertransplantaten, die für eine Transplantation zur Verfügung stehen. Neuartige Techniken zur Organkonservierung sind erforderlich, um den Pool an Spenderlebern zu erweitern. Die maschinelle Perfusion von Spenderlebertransplantaten ist eine Alternative zur traditionellen Kühllagerung von Lebern und vielversprechend als Modalität zur Erweiterung des Spenderorganpools. Wir haben kürzlich den potenziellen Nutzen der subnormothermen maschinellen Perfusion der menschlichen Leber beschrieben. Maschinell durchblutete Lebern zeigten eine Verbesserung der Funktion und Wiederherstellung des ATP-Spiegels im Gewebe. Darüber hinaus ermöglicht die maschinelle Perfusion von Lebertransplantaten bei subnormothermen Temperaturen eine objektive Beurteilung der Funktionalität und Eignung einer Leber für eine Transplantation. Auf diese Weise können sehr viele Lebern, die zuvor aufgrund ihrer suboptimalen Qualität verworfen wurden, über die restaurative Wirkung der maschinellen Perfusion gerettet und für die Transplantation verwendet werden. Hier beschreiben wir diese Technik der subnormothermen Maschinenperfusion im Detail. Humane Lebertransplantate, die für die Forschung zur Verfügung gestellt werden, werden über die Leberarterie und die Pfortader mit einem azellulären sauerstoffhaltigen Perfusat bei 21 °C perfundiert.

Eine Reihe von Beobachtungen und Analysen auf die Leber während der Perfusion durchgeführt werden, einschließlich direkter aktuellen Messwerte, wie zB Durchflussraten und Galle Produktion; Echtzeitmessungen, wie zB Gasanalyse des Perfusat und Post-hoc-Messungen, die nach der Probenahme vorgenommen werden, einschließlich biochemische Analyse des Perfusat und Gewebe und histologische Analyse. Hier genannten Ergebnisse sind von 22 perfundierten menschlichen Leber. Lebern wurden zur Transplantation aus verschiedenen Gründen, einschließlich Alter des Spenders, übermäßige warmen ischämischen Zeit Biopsieergebnisse (Steatose, Entzündung, Fibrose) und logistischen Gründen abgelehnt. 18 Lebern wurden folgende Herztod nach Hirntod beschafft, und 4. In beiden Fällen wurden Spender mit 30.000 Einheiten Heparin vorbehandelt und in situ und auf der Rückseite Tisch mit UW-Lösung gespült. Mittlere kalten Ischämiezeit betrug 531 ± 237 (SD) min und die mittlere warme Ischämiezeit betrug 27 ± 10 (SD) min, vom Rückzug des Lebens gemessenUnterstützung für kalte Flush. Echtzeit-Beobachtungen und Messungen können verwendet werden, um die Leber während der Perfusion zu bewerten, während die Post-hoc-Messungen werden nach der Perfusion offenbart werden. Echtzeit-Beobachtungen Fluss durch die Leber beginnt niedriger als der Solldurchflussraten als ein Ergebnis einer höheren Widerstand im kalten Leber. Mit einem Druck von 3 mmHg für PV und 30 mmHg auf der HA die Sollströme können in der Regel einmal die Leber erreicht hat, bis zu 21 erwärmt &#160; ° C nach 60 min Perfusion (1A). Gallenfluss kann im Allgemeinen innerhalb von 10 min Perfusion festgestellt und während der Perfusion (1B) kontinuierlich hergestellt. Gallen Menge hängt von der Qualität der Leber und im Bereich von 0,3 ml / h / kg Leber bis 18 ml / min / kg. In Lebern mit längeren warmen ischämischen Zeit werden Gallenfluss neigen dazu, auslaufen, während kürzere warme Ischämiezeit führt zu einer stabilen oder sogar steigendenGalleproduktion. Echtzeit-Messungen Direkte und häufige Messung der Perfusat durch Blutgasanalyse im wesentlichen für beide Versuchszwecken sowie die Aufrechterhaltung eines angemessenen Perfusionsbedingungen, wichtiger ist die Sauerstoffversorgung und pH-Wert. Gelöster Sauerstoff-Partialdruck sollte größer als 700 mmHg auf dem Zufluss von sowohl der PV und HA ist. Abfluss Sauerstoffdruck in der Vena cava gemessen, im allgemeinen nimmt mit längeren Perfusion, was einer Erhöhung der Sauerstoffaufnahme. Sauerstoff-Aufnahmeraten kann wie zuvor 13 bis 2,4-9,7 ml O 2 / min / kg bei t = 3 h (1C) beschrieben, und reichten von 0,5 bis 2,2 ml O 2 / min / kg bei Beginn der Perfusion berechnet. Ein pH-Abfall wird in den ersten 30 min (1D) in erster Linie als ein Ergebnis von Lactat Freisetzung im Perfusat beobachtet. Dies kann durch Ergänzung mit 8,4% Natrium bicarbo unterstütztnate und nach ca. 90 min der pH-Wert fällt wieder in den normalen Bereich. Üblicherweise wird 30-50 ml 8,4% Natriumbicarbonat erforderlich. Laktatkonzentration steigt schnell in der ersten 15-30 Minuten, aber beginnt, sich nach der ersten Stunde (1E) versterben. Post-hoc-Messungen Lebertransami wie ALT kann im Perfusat gemessen werden. In den ersten 30 Minuten eine starke Zunahme von ALT wird allgemein beobachtet, die das Auswaschen von ALT, die während der Ischämie (1F) veröffentlicht wurde widerspiegelt. ALT wurde gezeigt, dass auch mit warmer Ischämiezeit 13 korrelieren. Maschine Perfusion erhöhte ATP-Gehalt 2,8-fache, was auf eine Erholung der Energiestatus (1G). H &amp; E histologische Analyse zeigt keine zusätzlichen Verletzungen während des Maschinendurchblutung (Abbildung 1 H, I) aufrechterhalten. Es sei darauf hingewiesen, dass die in diesem Protokoll vorgeschlagen Biopsieschema für RESuche und sind nicht anwendbar für klinische Zwecke sein. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> Abb. 1: Bewertung der menschlichen Leber während des Maschinendurchblutung durch die PV und HA bei SNMP (A), Galle Produktion, quantifiziert pro Stunde Perfusion (B), Sauerstoff uprate Rate (OUR), aus der Differenz der Zufluss berechnet (PV Fluss + HA) und Abfluss (Hohlvene), unterbrochen Linien zeigen Sauerstoffpartialdrücken im Zu- und Ablauf während der Perfusion (C), pH und Laktat während der Perfusion (D, E), die Freisetzung von ALT in das Perfusat (F), ATP Gehalt im Gewebe von Stunden Biopsien (G) und H &amp; E-Flecken der Leber (54 Jahre alt DCD, 19 min warme Ischämie, 559 min kalte Ischämie) vor dem (H) und nach (I) Perfusion gemessen. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Wir beschreiben ein Verfahren zur ex vivo-Maschine Perfusion von menschlichen Lebertransplantate in subnormothermic Temperatur (21 ° C).

Funktionale Menschliche Leber Erhaltung und Rückgewinnung mittels Subnormothermic Maschine Perfusion

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine subnormotherme maschinelle Perfusion der menschlichen Leber zur Erhaltung, Wiederherstellung und Beurteilung des Organs durchzuführen. In einem präklinischen Forschungsumfeld wird dies erreicht, indem zunächst die Leber auf die Verbindung mit dem Gerät vorbereitet wird. Im zweiten Schritt wird das Maschinenperfusionssystem gespült, die Leber angeschlossen und im letzten Schritt die Perfusion gestartet.Die maschinell perfundierte Leber wird bei einem subnormalen thermischen Zustand funktional aktiv und produziert Galle. Letztendlich können Proben, die während der Perfusion aus der Leber gewonnen wurden, analysiert werden, um die metabolische Erholung und Funktion des Organs zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Konservierungsmethoden wie kalter Perfusion und normothermer Perfusion besteht darin, dass die subnormale thermische Maschinenperfusion eine funktionelle Erholung und Beurteilung der Lebervitalität ermöglicht, ohne die hohen metabolischen Anforderungen einer Perfusion bei Körpertemperatur erfüllen zu müssen.Viele Aspekte dieser Technik erfordern Erfahrung oder eine Demonstration, um erfolgreich durchgeführt zu werden. Beispielsweise kann die Demonstration der Durchführung der Rücktischpräparation der Leber, einschließlich der Dissektion der Arterie, Vene und des Gallengangs, für Forscher ohne vorherige chirurgische Ausbildung hilfreich sein. Sobald die Leber eingegangen ist, stellen Sie eine mit Eis gefüllte Organwanne auf eine steril abgedeckte Fläche und entnehmen Sie die Leber aus der Transportbox, wobei sie größtenteils in der Tüte mit kalter Konservierungslösung verbleibt. Verwenden Sie anschließend Metzenbaumscheren, um die verschiedenen Äste der arteriellen Versorgung der Leber von der Aorta bis zur Arteria hepatica propria freizulegen.Danach vorsichtig den Rest der Arterie präparieren, um keine Gefäße zu durchtrennen, die die Leber versorgen, ohne jedoch Zweige zu durchschneiden oder abzubinden, die kein sichtbares Ende aufweisen. Sobald die Arterie isoliert ist, mittels Seidenligaturen der Stärke 0 bis 4-0 alle arteriellen Seitenäste abbinden, die nicht die Leber versorgen. Milz- und Magenarterie nahe ihrem Ursprung am Arteria-coeliaca-Stamm abbinden und durchtrennen.Schneiden Sie ein aortales Pflaster um den Truncus celiacus herum aus. Verwenden Sie dann eine arterielle Perfusionskanüle, um den Truncus celiacus zu kanülieren. Freilegen Sie nun die Vena portae, binden Sie alle Seitenäste ab oder vernähen Sie Löcher in der Vene und kanülieren Sie sie mit einer Perfusionskanüle für die Vena portae.Entfernen Sie Abschnitte des Zwerchfells von der suprahepatischen Vena cava, ohne die Vene selbst zu durchtrennen. Schneiden Sie anschließend zwei bis drei Millimeter lange Gewebeproben mit vollständigem Umfang vom Ende des Ductus choledochus ab. Die Proben sind sorgfältig zu behandeln.Einfrieren Sie eine Probe schnell in fl&uuml;ssigem Stickstoff zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius und lagern Sie die andere Probe in 10&nbsp;% gepuffertem Formalin. Dann katheterisieren Sie den Ductus choledochus mit einer Gef&auml;&szlig;katheter und verbinden ein Abflussrohr aus schmalem Schlauchmaterial. Anschlie&szlig;end ligieren Sie den Ductus cysticus mit einer 0-seidenen Naht.Verbinden Sie den Spülschlaubensatz mit eiskalten Beuteln der Ringer-Laktatlösung und spülen Sie den Schlauch, um die Luft zu entfernen. Stellen Sie den Flussregler am Spülschlauch auf einen langsamen Tropfenfluss ein und verschließen Sie die Vena portae am Hilus, um jegliche Luft aus dem Gefäß zu entfernen. Füllen Sie nun die Kanüle in der Vene mit Spüllösung, um die Luft aus der Vena portae zu entfernen, wobei darauf zu achten ist, den Beutel nicht mehr als 20 Zentimeter über der Höhe der Leber anzuheben, um einen übermäßigen Druck auf die Vene zu vermeiden.Anschließend spülen Sie die Leber mit insgesamt zwei Litern eiskalter Ringer-Laktat-Lösung durch. Während des Spülens verschließen Sie kurzzeitig die Vena portae am tiefsten Punkt, um auf Leckagen zu prüfen, und wiederholen dann die Spülung für die Arteria hepatica mit einem Liter Lösung, wie gerade gezeigt. Während die Leber gespült wird, bereiten Sie das Perfusionsystem vor, indem Sie zwei Liter Raumtemperatur-Perfusionslösung zur Organwanne hinzufügen, und starten das Gerät, um die Schläuche zu entlüften. Stellen Sie die Temperatur auf 21 Grad Celsius ein.Stellen Sie dann einen Druck von drei Millimetern Quecksilber an der Pfortader und 30 Millimetern Quecksilber an der Arteria hepatica ein. Öffnen Sie den Carbogen-Gastank und stellen Sie einen Durchfluss von drei Litern pro Minute ein. Entnehmen Sie anschließend eine Blutgasprobe an den Probenahmestellen des Pfortader- und Leberarterienzuflusses und führen Sie die Proben gemäß den Herstelleranweisungen im Blutgasanalysator durch, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung und den pH-Wert zu bestätigen.Verwenden Sie Natriumbicarbonat oder Chlorwasserstoff, um den pH-Wert gegebenenfalls zu korrigieren. Sammeln Sie anschließend, bevor die Leber angeschlossen wird, eine ein Milliliter große Probe der Perfusats als Zeitpunkt-Null-Messung und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Verwenden Sie zu diesem Zeitpunkt außerdem eine Stahlklinge mit einer Schneide, um zwei keilförmige Biopsien von jeweils etwa 250 Milligramm aus der Leber zu entnehmen.Einfrieren einer Probe in flüssigem Stickstoff zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius und Fixierung der anderen Probe in 10 % gepuffertem Formalin. Vor Beginn der Perfusion die Leber wiegen, dann das Organ in die Organkammer des Geräts überführen und die Luft aus den Kanülen entfernen. Wie eben gezeigt.Wenn die Kanülen gelegt sind, verbinden Sie den Pfortader- und Leberarterien-Zufluss mit den entsprechenden Kanülen. Beginnen Sie die Perfusion und stellen Sie sicher, dass die Leber von der Perfusionsflüssigkeit bedeckt ist; bedecken Sie trockene Oberflächen, einschließlich der Zuflussgefäße, mit feuchter steriler Gaze. Um Austrocknung zu verhindern, lassen Sie das Gallengangröhrchen in einen Sammelbehälter ablaufen.Darauf achten, dass die Öffnung des Gallendrainagekanals auf Höhe der Leber oder darunter liegt, damit die Galle frei abfließen kann. Sobald die Leber auf 21 Grad Celsius erwärmt ist, sollten die Flussraten bei 275 bis 325 und 50 bis 100 Milliliter pro Minute pro Kilogramm für die Pfortader bzw. die Leberarterie liegen. Während der Perfusion Proben des perfundierten Lebergewebes und der Galle entnehmen, wie angezeigt.Führen Sie die Perfusion drei Stunden lang fort, überwachen Sie den Druck, den pH-Wert und die Sauerstoffversorgung und stellen Sie den pH-Wert bei Bedarf mit Natriumbicarbonat ein. Am Ende der Perfusion sammeln Sie die endgültigen Proben, trennen die Leber ab und entfernen die Kanüle aus dem Gallengang. Schließlich entnehmen Sie zwei Gewebeproben des Gallengangs nach der zuvor gezeigten Methode und entsorgen die humane Leber.Befolgen Sie die richtigen Richtlinien für die Entsorgung von Bioabfällen. Der Durchfluss beginnt niedrig aufgrund eines höheren Widerstands in der kalten Leber, wobei ein Druck von drei Millimetern Quecksilber an der Pfortader und 30 Millimetern Quecksilber an der Leberarterie angelegt wird. Die Ziel-Durchflussraten können im Allgemeinen erreicht werden, sobald die Leber nach 60 Minuten Perfusion auf 21 Grad Celsius erwärmt ist. Die häufige Messung des Perfusats mittels Blutgasanalyse ist sowohl für experimentelle Zwecke als auch zur Aufrechterhaltung adäquater Perfusionsbedingungen unerlässlich.Beispielsweise sollte der partielle Sauerstoffdruck im Einfluss sowohl der Vena portae als auch der Arteria hepatica über 700 Millimeter Quecksilber liegen. Dagegen sollte der im Vena-cava-Ausfluss gemessene Sauerstoffdruck im Allgemeinen mit zunehmender Perfusionsdauer abnehmen, was einer steigenden Sauerstoffaufnahme entspricht. Auch hepatische Transaminasen können beispielsweise in der PERFU acht gemessen werden.Ein Anstieg der Alanin-Transaminase oder einer aLT wird gewöhnlich in den ersten 30 Minuten der Perfusion beobachtet, mit einer minimalen weiteren Zunahme während des restlichen Perfusionszeitraums. Eine weitere Bewertung der aTP-Produktion in maschinell perfundierten Lebern zeigt eine 2,8-fache Erhöhung des aTP-Gehalts der Leber, was auf einen sich erholenden Energiestatus hinweist. Darüber hinaus zeigt die histologische H-und-E-Analyse keine zusätzlichen Verletzungen, die während des Verfahrens entstanden sind.Mit dieser Vorgehensweise ist eine umfassende Analyse der isolierten Leber möglich, die einzigartige Einblicke in die hepatische Physiologie und Pathologie ermöglicht. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine menschliche Leber während einer subnormothermen Maschinenperfusion erhält, um die Beurteilung ihrer Funktion außerhalb des Körpers zu erleichtern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Rand Transplantate, wie Fettleber, Transplantate von älteren Spendern oder Lebern nach Herztod (DCD) abgerufen tolerieren herkömmlichen, Kälte statische Speicher nur schlecht. Wir entwickelten ein neuartiges Modell der subnormothermic ex vivo Perfusion der Leber für die Erhaltung, Bewertung und Instandsetzung von Randlebertransplantationen vor der Transplantation.

Technik der Subnormothermic<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Leberperfusion für die Lagerung, Bewertung, Reparatur von Marginal Lebertransplantate

Hier präsentieren wir ein Protokoll beschreibt, sauerstoffreiches ex situ Maschine Perfusion der Spenderleber Transplantate. Dieser Artikel enthält eine Schritt für Schritt-Protokoll zu beschaffen und bereiten den Lebertransplantat für Maschinendurchblutung, bereiten Sie die Perfusionsflüssigkeit, prime die Perfusion Maschine und durchzuführen, mit Sauerstoff angereicherten normothermen Maschine Perfusion des Transplantats.

Ex-situ-normothermen Maschine Perfusion von Spenderlebern

Fehlt ein wichtiger Leber Geber, und Kriterien für die Leber Spender wurden erweitert. Normothermic ex Vivo Leber Perfusion (NEVLP) wurde entwickelt, um zu bewerten und Organfunktion zu ändern. Diese Studie zeigt einem Rattenmodell der NEVLP und testet, ob der pegylierten-Katalase, um Verletzungen der Leber Erhaltung zu mildern.

Ein kleines Tier Modell der Ex Vivo Normothermic Leber Perfusion

Das hier beschriebene Schweinemodell der normothermen maschinellen Perfusion (NMP) der Leber kann erfolgreich zur Untersuchung von NMP als Konservierungsstrategie, als Instrument zur Bewertung der Lebensfähigkeit und als Plattform für die Organreparatur eingesetzt werden. Es hat einen hohen translationalen Wert, ist jedoch technisch anspruchsvoll und arbeitsintensiv.

Normothermische isolierte Leberperfusion bei Schweinen

Für die Leber von Mäusen wurde ein normothermisches ex vivo Leberperfusionssystem (NEVLP) entwickelt. Dieses System erfordert Erfahrung in der Mikrochirurgie, ermöglicht aber reproduzierbare Perfusionsergebnisse. Die Möglichkeit, Mäuselebern zu verwenden, erleichtert die Untersuchung molekularer Signalwege zur Identifizierung neuartiger Perfusat-Additive und ermöglicht die Durchführung von Experimenten, die sich auf die Reparatur von Organen konzentrieren.

Normotherme ex vivo Lebermaschinenperfusion bei Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur Etablierung eines Schweinemodells unter Verwendung einer variablen temperaturgesteuerten maschinellen Perfusion (MP) zur Erhaltung der Spenderleber, gefolgt von einer orthotopen Lebertransplantation (OLTx). Ziel ist es, die Erfolgsrate von OLTx mittels Spenderspende nach Kreislauftod (DCD) Leber zu fördern und ein stabiles Modell zu etablieren.

Erhalt der Schweinespendeleber nach zirkulatorischem Tod (DCD) durch Perfusion und orthotope Lebertransplantation

Hier stellen wir ein Protokoll für ein quelloffenes, modifizierbares normothermisches ex vivo-Perfusionssystem vor, das entwickelt wurde, um die hohen Kosten und die begrenzte Flexibilität bestehender Plattformen zu überwinden und einen zugänglicheren, kosteneffizienteren und iterativen Einsatz in der präklinischen biomedizinischen Forschung zu ermöglichen.

Ein Open-Source-Normotherm-Perfusionssystem, das für Forschungswissenschaftler entwickelt wurde

Der Zweck besteht darin, ein neues Verfahren, Atmung-Steuerung elektrischer Stimulation (BreEStim) zur Behandlung von neuropathischen Schmerzen und Spastik präsentieren.

Breathing-gesteuerte elektrische Stimulation (BreEStim) für die Verwaltung von neuropathischen Schmerzen und Spastik

Die Mechanismen, die zur Entwicklung von Intimahyperplasie (IH) und Vene Transplantatversagen sind immer noch wenig verstanden. Diese Studie beschreibt eine Ex-vivo-System für die menschliche Venen unter kontrollierten Durchfluss und Druck durchströmen. Darüber hinaus die Effizienz der externen Mattenbewehrung zur Begrenzung der Entwicklung der IH bewertet.

Verfahren für Menschen V. saphena Ex-vivo- Perfusion und Außen Verstärkung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, wie eine isolierte Leberperfusion (IHP) mit Melphalan durchgeführt werden kann, und wir diskutieren auch IHP als Behandlungsoption für Lebermetastasen des Aderhautmelanoms.

Isolierte Leberperfusion als Behandlung für Lebermetastasen von Aderhautmelanom

Lernen Sie die subnormotherme Maschinenperfusion menschlicher Lebern bei 21 °C zur Erhaltung, Wiederherstellung und Funktionsbewertung des Organs. Diese Methode ermöglicht die metabolische Analyse außerhalb des Körpers.

Funktionale Menschliche Leber Erhaltung und Rückgewinnung mittels Subnormothermic Maschine Perfusion

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