Name: Eine optimierte Enrichment-Technik für die Isolierung von Arthrobacter Bakteriophagen Arten von Bodenprobe Isolate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Lernen Sie eine optimierte Enrichment-Technik zur Isolierung von Arthrobacter-Bakteriophagen aus Bodenproben. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse für die Phagenamplifizierung und -reinigung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Finanzierung für die Entwicklung dieses Protokoll wurde von der Southeastern Pennsylvania Konsortium für Hochschulbildung und der Cabrini College-Science Department zur Verfügung gestellt. Zusätzliche Finanzierung und Unterstützung kam von Arcadia University und Immaculata University. Besonders danken Dr. Karen Snetselaar im St. Joseph Universität für die freundliche Aufnahme der elektronenmikroskopischen Bilder unserer isolierten Phagen. Zusätzliche Unterstützung wurde von der Howard Hughes Medical Institute Science Education Alliance-Phage Hunters Advancing Genomics und Evolutions Science-Programm (SEA-Phagen) zur Verfügung gestellt.

1. Vorbereitung der Zellen für Arthobacter Phage Isolation <ul><li> Kultur Arthrobacter sp. KY3901 Kolonien ausgestrichen auf Luria Bertaini (LB) Agarplatten bei 30 ° C für 2-3 Tage inkubiert. Wählen Sie eine Kolonie und eine sterile Schleife, um es zu 250 ml LB-Medium in einem Schikanekulturflasche in einem Schüttelinkubator bei 225 Umdrehungen pro Minute bei 30 ° C hinzu und inkubieren. </li><li> Lassen Sie etwa 24 Stunden des Wachstums zur späten exponentiellen / frühen stationären Phase Zellen für Phageninfektionsversuche zu erhalten. Überwachen Sie den Zustand der Bakterienwachstum eng mit Zellen aus Eingabe der mittleren bis späten stationären Wachstumszustand zu verhindern. ANMERKUNG: Das Zellwachstum sollte eines optischen Dichte OD 600 zwischen 0,5-.0.7 für die unten beschriebenen Phagen Isolierungs- und Reinigungsverfahren / Schritten bestehen. </li></ul> 2. Sammlung von Phagen von Bodenproben <ol><li> Sammeln Sie 200 bis 400 g Boden vom gewünschten Ort. Anmerkung: Da Bakterien im Arthrobacter Gattung sind gemeinsame Bodenbakterien sie und die Phagen, die sie infizieren können in gefunden werden und sind allgegenwärtig in den meisten Bodenarten. </li><li> Hinzufügen mindestens 400 ml Phagenpuffer (PB) [68 mM NaCl, 10 mM MgSO 4, 10 mM Tris-CL (pH 7,5)], um den Boden und mischt in einem ausreichend großen Kolben, so dass mindestens 200 ml PB im Überstand und kann entnommen werden. </li><li> Mischen Sie durch leichtes Rühren oder wirbeln, bis der Boden ausgesetzt ist, und lassen Sie die Bodensedimente zu begleichen, in der Regel 30 Minuten. </li><li> Übergeben Sie die &quot;Bodenextrakt&quot; durch Filterpapier durch Schwerkraftfiltration Bodensediment Schmutz zu entfernen. </li><li> Fügen LB Pulver und mischen, um eine 2% ige Lösung (4 g LB-Pulver in 200 ml Bodenextrakt) zu machen. </li><li> Übergeben Sie die Lösung durch ein 0,22 um-Filter durch Vakuumfiltration, um ein steriles Filtrat zu erhalten. Wenn möglich, fahren Sie sofort mit Schritt 2.7. Falls erforderlich, zu speichern filtrierten Proben bei 4 ° C für bis zu einer Woche vor dem Fortfahren, jedoch die Anzahl von lebensfähigen Phagenpartikelnwird reduziert. </li><li> Aliquoten mehrere 50 ml des filtersterilisiert LB / Bodenextrakt Mischung in einzelne 250 ml sterilisierte Schütteln verblüfft Kulturflaschen unter aseptischen Bedingungen. In sterilen 2,0 M CaCl 2 -Lösung, um den gewünschten endgültigen Konzentrationen (0-50 mM), da verschiedene Arthrobacter Phagen optimal wachsen unter verschiedenen CaCl2 Bedingungen. HINWEIS: Wir finden, dass die Mehrzahl der Arthrobacter Phagen von uns erkannt liegen im Bereich von 1 mM bis 2,5 mM CaCl 2. Mehrere der isolierten Phagen wuchs jedoch von uns ausschließlich bei 0 mM CaCl 2 .oder bei sehr hohen CaCl 2 -Konzentrationen. Gehen Sie sofort zu Schritt 3.1. </li></ol> 3. Phage Isolation <ol><li> Hinzufügen von 1 zu 2,5 ml von späten exponentiellen / frühen stationären Phase Bakterienkultur auf jeden der Kolben. Bei einer OD 600 von 0,5 bis 0,7, verwenden Sie 1 ml der Zellen. Für eine OD 600 höher als eine OD von 0,7 In 2,5 mlZellen. Hinweis: Zellen im exponentiellen Phase Wachstum ergeben in der Regel mehr Phagen und höhere Titer als Zellen in der stationären Phase Wachstum. </li><li> Schüttelflaschen mit 250 Upm bei 30 ° C für etwa 24 Stunden in einem Schüttelinkubator. </li><li> Nach einer 24-Stunden Inkubationszeit entfernen Anreicherungskolben aus dem Schüttelinkubator und verdünnt das Anreicherungs Proben Zehnfache im Phagenpuffer. </li><li> Bis Kulturröhrchen mit 0,5 ml späten exponentiellen / frühen stationären Phase Bakterienkultur gesetzt sind und verschiedene Mengen des Anreicherungskultur (5 ul bis 500 ul einer 10 -1 Verdünnung in PB) zu den Kulturröhrchen. HINWEIS: Es ist ratsam, einen weiten Konzentrationsbereich zu testen, da jeder Bodenprobe erzeugt verschiedene Phagentiter nach Anreicherung. </li><li> Fügen CaCl2 zu Kulturröhrchen eine endgültige Konzentration gleich im Original Anreicherungskolben der vorliegenden Konzentration zu machen. Verwenden Sie eine Reihe von verschiedenen CaCl 2 -Konzentrationen für viele Phagen w wählenith unterschiedlichen CaCl2 Abhängigkeiten. HINWEIS: Die meisten Phagen innerhalb des CaCl2 Bereich von 1-2,5 mM isoliert werden, aber es gibt Phagen am optimalsten überall 0-50 mM CaCl 2 -Konzentrationen isoliert. Aus diesem Grund empfiehlt es sich, eine Reihe von CaCl 2 -Konzentrationen zu überprüfen, um die Anzahl der eindeutigen isoliert Arthrobacter Phagen zu maximieren. </li><li> Mischungs 4,5 ml LB-Topagar im Kulturrohr und gießt die Mischung auf einem LB-Agar-Platte. Vorsichtig schwenken, um über die Platte gleichmäßig zu verteilen und ermöglichen eine Top-Agar für etwa 15 Minuten zu festigen. HINWEIS: Top-Agar in größeren Chargen (250 ml) und zusätzliche Top-Agar hergestellt werden können bei RT gespeichert und für nachfolgende Experimente wiederverwendet für mindestens zwei Wochen werden. Zwar gibt es verschiedene Formeln verwendet werden, um Top-Agar, machen wir Top-Agar mit 7 g / l Agar mit LB. gemischt Ort Topagar in einem 60 ° C Wasserbad auf den flüssigen Zustand während des Verlaufs des Experiments beibehalten. </li><li> Invert ter Inkubieren bei gewünschter Temperatur (Temperatur bis 30 ° C) O / N bis 48 hr. Variieren diese Bedingungen für die vorliegenden Phagen zu optimieren. Die meisten isolierten Phagen stammen aus Platten bei 30 ° C bei 1 bis 2,5 mM CaCl2-Konzentration nach 24 h Inkubationszeit inkubiert. </li></ol> 4. Phage Reinigung <ol><li> Nach einer 24-stündigen Inkubation Check für Plaquebildung auf Platten. Weiter Inkubation bis zu 72 h, wenn keine Plaques sind offensichtlich oder um festzustellen, ob zusätzliche Plaques erscheinen. Falls erforderlich, speichern Platten mit vermeintlichen Plaques für bis zu einer Woche bei 4 ° C, bevor Sie fortfahren. HINWEIS: Es ist nicht ungewöhnlich, dass eine Vielzahl von verschiedenen Morphologien Plaque auf einer Platte zu finden. Auffinden Plaques nach 3 Tagen der Inkubation ist möglich, aber selten. </li><li> Reinige gewünschten Phagen aus klar getrennt Plaques mit dem Streifen Plaque-Methode. Berühren Sie eine Plakette mit einer sterilen Holzstab. Streak die Plaque, indem Sie einen Holzstab durch eine Flamme, allowing der Stick kurz abkühlen, und dann reiben Sie den Stick auf der Agar-Platte in der sanften Bewegung, wie in Abbildung 1 dargestellt. mit einem sauberen Stick für jeden Durchgang Wiederholen Sie diesen Vorgang. </li><li> Alternativ können Sie die traditionellen Plaque-Titer-Test für einzelne Phagenplaques zu isolieren. Die Plaque-Titer-Assay erfordert die Verwendung von mehr Reagenzien wie LB-Agar und LB-Topagar und Materialien wie Petrischalen für Phagenplaqueisolierung. Wir waren sehr erfolgreich mit dem Streifen Plaque-Methode, aber es ist technisch einfacher, einzelne Plaques mit Hilfe des Plaque-Titer-Test zu isolieren. </li><li> Sobald der LB-Agarplatte wird mindestens dreimal ausgestrichen, markieren den Bereich mit der niedrigsten Konzentration der putative Phagenpartikel und sanft an 0,5 ml Arthrobacter und 4,5 ml geschmolzener Deckagar LB (die die gleiche Konzentration von Calciumchlorid als Mutterplatte ) und lassen Sie es gleichmäßig über die Platte verteilt. </li><li> Invertieren und Inkubation Platte O / N. Wiederholen Sie den Streifen PlaqueTechnik für mindestens drei Iterationen, um eine reine Phagen-Arten zu gewährleisten ist isoliert. Speicher-Platten bei 4 ° C für bis zu einer Woche zwischen Streifen Bedarf ohne erheblichen Verlust an Phagen Lebensfähigkeit. </li><li> Sobald die gewünschte Plaques worden sind, und auf der letzten Streifen der Platte getrennt, berühren Sie einen gut isolierten Plaque mit einer Mikropipette Spitze und resuspendieren in 100 ul PB. Seriell verdünnt diese Lösung 10 0 aus, um die 10 -8 Verdünnung, indem 20 ul der Probe in 180 ul frischem PB. </li><li> Zugabe von 10 ul jeder Verdünnung auf 0,5 ml gezüchtet Arthrobacter in ein Kulturröhrchen für 5 bis 10 min bei RT und der Platte hergestellt, indem die infizierten Bakterien mit 4,5 ml geschmolzenen LB-Deckagar, enthaltend die gleiche Konzentration an CaCl 2 verwendet, um den Phagen zu isolieren, von der ursprünglichen Bodenprobe. Speichern Sie alle Verdünnungen bei 4 ° C bis zum nächsten Tag gemacht. </li><li> Bestimmen Sie die Phagenverdünnungs benötigt, um eine Web-Muster mit der herkömmlichen Plaque-Titer, wie machensagen sie mal. Der Zweck der Plaque-Titer-Assay ist, um den Phagen-Titer benötigt, um eine Bahn-Musterplatte zu erhalten, zu bestimmen. Identifizieren Sie einen Web-Musterplatte als überwiegend frei von Bakterien, sondern enthält Reste der Bakterien, die noch nicht von Phagen lysiert wurden. 5 ml späten exponentiellen / frühen stationären Arthrobacter Kultur in ein steriles 50 ml Kulturflasche. <ol><li> Füge 100 ul der Verdünnung (das gab ein Netzmuster auf die Arthrobacter-Kultur) in den Kulturbehälter und ermöglichen, dass die Phagen an die Bakterienzellen für 5 bis 10 min bei RT infizieren. Mischen mit geschmolzenem LB-Deckagar, enthaltend die gleiche Konzentration an CaCl 2, wie verwendet, um den Phagen zunächst zu identifizieren und die Platte 5 ml dieser Mischung auf 10 frische LB-Platten. Erstarren lassen und Inkubation umgekehrten Platten bei 30 ° C. </li></ol></li><li> Am nächsten Tag, durchfluten die Web-Modellplatten mit 5 ml PB und speichern O / N bei 4 ° C oder 4 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Filtern des Phagenlysats durch ein 0,22 um-Spritzenfilterund bei 4 ° C. Muss diese letzte Phagenvorrat für weitere Experimente, wie Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Phagenpartikeln, Phagen Isolierung genomischer DNA für DNA-Restriktionsenzym-Analyse und Sequenzierung unter Verwendung von Standardverfahren. Für langfristige Lagerung des Phagen Lager, fügen Sie eine gleiche Menge des Phagen-Lysats auf steriles Glycerin in kleine Fläschchen für Lager Archivierung bei -80 ° C. HINWEIS: Für alle, die nicht mit dieser Phagen-Techniken erfahren, ist eine großartige Ressource die Online zugänglich www.phagesdb.org Website. </li></ol>

<ol><li>Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Catabolic+Pathways%3A+Genomic+Insights+into+Microbial+s-Triazine+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism.</a> J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).</li>
<li>Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Atrazine+Degrading+Arthrobacter+sp.+AD26+and+Use+of+this+Strain+in+Bioremediation+of+Contaminated+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22J+Environ+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil.</a> J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).</li>
<li>Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+an+Arthrobacter+sp.+Strain+HB-5+that+Transforms+Atrazine%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Geochem+Hlth%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine.</a> Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).</li>
<li>Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identities+of+Arthrobacter+spp.+And+Arthrobacter-Like+Bacteria+Encountered+in+Human+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens.</a> J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).</li>
<li>Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Arthrobacter+Bacteriophages+and+Their+Application+to+Phage+Typing+of+Soil+Arthrobacters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters.</a> Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).</li>
<li>Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+Gordonia+and+Nocardia+Stabilized+Foam+Formation+by+Using+Bacteriophage+GTE7%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).</li>
<li>Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Characterization+of+Site-specific+Integration+Functions+of+phi+AAU2+infecting+%E2%80%9CArthrobacter+aureus%E2%80%9D+C70%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70.</a> J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).</li>
<li>Casida, L. E., Liu, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthrobacter+globiformis+and+Its+Bacteriophage+in+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil.</a> J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).</li>
<li>Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+a+Bacteriophage+of+Arthrobacter+globiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis.</a> J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).</li>
<li>Twest, R., Kropinski, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+Enrichment+from+Soil+and+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage Enrichment from Soil and Water.</a> Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).</li>
<li>Fullner, K. J., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteriophage+L5+Infection+of+Mycobacterium+bovis+BCG%3A+Implications+for+Phage+Genetics+in+the+Slow-growing+Mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).</li>
<li>Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+Growth+Characteristics+on+Stationary+Phase+Achromobacter+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells.</a> J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).</li>
<li>Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T4+Bacteriophage+Average+Burst+Size+Varies+with+Escherichia+coli+B23+Cell+Culture+Age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age.</a> Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).</li>
<li>MacWilliams, M. P., Liao, M. K. Luria Broth (LB) and Luria Agar, Media and Their Uses Protocol. ASM MicrobeLibrary. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli">http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli</a> (2013).</li>
</ol>

Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Trotz vieler bisherigen Versuche, Phagen infizieren kann Arthrobacter Hosts zu isolieren, wir hatten wenig Erfolg mit Standard-Anreicherungsverfahren. Das verallgemeinerte Verfahren zur Bakterienanreicherung entwickelt und von van Twest und Kropinskis 10 angepasst, um Phagen aus Umweltproben reichern bleibt die Grundlage für die Mehrheit der Anreicherungsverfahren. Erkenntnisse aus früheren Studien legt nahe, dass Methoden der direkten Beschichtung haben nachweisbaren Plaques auf Stämme von Arthr...

Die Allgegenwärtigkeit von Arthrobacter species in Boden-Umgebungen bietet eine große Anzahl und Vielfalt der Phagen Lage ist, von dieser Art von Wirtsbakterien isoliert. Bakterielle Mitglieder der Familie Acintobacteriaceae Weise bestehen für ihre Abbauwege abbau widerspenstigen Verbindungen wie Atrazin und verschiedenen anderen Pestiziden und Herbiziden 1,2,3. Obwohl die meisten der Forschung wurde mit Umweltbelastungen von Arthrobacter getan wird klinische Isolate dieser Gattung in Blut, Urin, Augen, und viele andere menschliche Quellen alle Anzeigen von phylogenetischen Heterogenität 4 gefunden. Zwar gibt es eine recht umfangreiche Anzahl von Studien auf Arthrobacter Bakterien, nur wenige Studien berichten über die Phagen infizieren kann Mitglieder dieser vielfältigen Gattung. Interessant ist jedoch, zuvor an Arthrobacter getan Phagen berührt mehrere wichtige unterschiedliche Themen wie die Eingabe der Boden &lt;em&gt; Arthrobacter species 5, industrielle Zwecke mit dem Zweck der Reduzierung schädlicher Schaum in Belebtschlammanlagen 6 und Arbeit hervorgehoben ortsspezifische Rekombination und Integrase-Gene 7. Verschiedene Anreicherungsverfahrens Protokolle wurden verwendet, um zu erzeugen reine Phagen-Isolate in Arthrobacter species. Frühe Verfahren umfassen Inkubation des Bodens mit aufgenommen Giftstoffe wie Nikotin Salze für die Dauer von mehr als einem Jahr 8, die zu Phagen in der Lage, nur infizieren A. globiformis. Studien mit Erde getan versickert mit labilen organischen schien nachweisbar Phagen durch Plaque-Assay-Techniken erzeugen, jedoch ohne lange Inkubationszeiten 8. Interessanterweise wurde eine Technik ähnlich direkte Beschichtung in der Vergangenheit, die zu mehreren Phagen, während immer noch eine deutlich geringe Erfolgsquote von den Ermittlern 5 verwendet, unter Berufung auf frühere Studien mit niedrigen Erfolgsraten <sbis&gt; 8. Insgesamt waren die Isolationstechniken in der Vergangenheit bekannt für eine geringe Wirksamkeit in der Praxis trotz der Gattung Arthrobacter, die die häufigsten aeroben Boden in der Natur 4,9 isolieren, Van Twest und Kropinski 10 vorhanden Anreicherungsverfahren zur Isolierung von Phagen aus Wasser und Boden von früheren Techniken zum Umwelt Bakterienisolate aber diese Anreicherungstechniken bereichern angepasst erwiesen ineffizient bei der Isolierung Arthrobacter Phagen. Der Zweck des hier beschriebenen Verfahrens ist es, &quot;proof of concept&quot; zeigen, dass die frühen Anreicherungsverfahren angepasst werden, um konsequent und effektiv isolieren Arthrobacter Phagen, die Überwindung vorherige technische Herausforderungen mit Trenn Phagen aus dieser Bakteriengattung zugeordnet werden.

<table><tbody><tr><td>LB Brühe</td><td>Pulver Fisher</td><td>BP9722-2</td><td>Bestellen Sie diese am besten in großen Mengen.</td></tr><tr><td>Granulierter Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>Bestellen Sie diese am besten in großen Mengen.</td></tr><tr><td>0,22 μm Spritzenvorsatzfilter</td><td>Fisher</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>0,22 μm buchner Filter</td><td>Fisher</td><td>430320</td><td>Mehr als 50 ml Flüssigkeit können durch vorsichtigen Austausch des Aufnahmeröhrchens gewonnen werden.</td></tr><tr><td>Eppendorf Röhrchen</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipetten einzeln</td><td>Fisher</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konische Röhrchen</td><td>Fisher</td><td>76002844</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konische Röhrchen</td><td>Fisher</td><td>76002845</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipetten einzeln</td><td>Fisher</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Pipetten einzeln</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Whatman qualitatives Filterpapier</td><td>Fisher</td><td>1001-824</td><td></td></tr></tbody></table>

eine optimierte enrichment-technik für die isolierung von<em&gt; arthrobacter</em&gt; bakteriophagen arten von bodenprobe isolate

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

Die Isolierung von Bakteriophagen aus Umweltproben wird seit Jahrzehnten nach Prinzipien durchgeführt, die von Pionieren der Mikrobiologie festgelegt wurden. Die Isolierung von Phagen, die Arthrobacter-Wirte infizieren, war begrenzt, möglicherweise aufgrund der geringen Erfolgsrate vieler früherer Isolierungstechniken, was dazu führte, dass eine unterrepräsentierte Gruppe von Arthrobacter-Phagen für Studien zur Verfügung stand. Die hier beschriebene Anreicherungstechnik verwendet im Gegensatz zu vielen anderen einen gefilterten Extrakt, der frei von kontaminierenden Bakterien ist, als Basis für das Wachstum von Indikatorbakterien, Arthrobactersp. KY3901, um genau zu sein. Durch die erste Entfernung von Bodenbakterien werden die Zielphagen nicht durch Konkurrenz mit heimischen Bodenbakterien behindert, die in den ersten Bodenproben vorhanden sind. Diese Anreicherungsmethode hat zu Dutzenden von einzigartigen Phagen aus verschiedenen Bodentypen geführt und sogar verschiedene Arten von Phagen aus demselben angereicherten Bodenprobenisolat hergestellt. Der Einsatz dieses Verfahrens kann auf die meisten nährstoffreichen aeroben Medien zur Isolierung von Phagen in einer Vielzahl interessanter Wirtsbakterien ausgeweitet werden.

Um die Reproduzierbarkeit der verbesserte Anreicherungsverfahrens für Arthrobacter Phagen zu zeigen, wurden 30 verschiedene Bodenproben zu verschiedenen Zeiten und Orten im Frühjahr und Sommer 2014. Von diesen 30 Bodenproben einzigartige Arthrobacter Phagen wurden aus 22 der gesammelten Bodenproben mit dieser Bereicherung erhalten verwendet Verfahren. Die Standardanreicherungsverfahren ergab eindeutige Phagen von 3 der gleichen Bodenproben. Die Anreicherung Proben eine sehr hohe Phagentiter benötigen A...

Wir präsentieren ein Anreicherungsprotokoll für die Isolierung von Bakteriophagen, die Bakterien der Gattung Arthrobacter infizieren. Dieses Anreicherungsprotokoll liefert schnelle und reproduzierbare Ergebnisse für die Isolierung und Amplifikation von Arthrobacter-Phagen aus Bodenisolaten.

Eine optimierte Enrichment-Technik für die Isolierung von<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bakteriophagen Arten von Bodenprobe Isolate

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Arthrobacter-Bakteriophagen aus Bodenproben mithilfe eines Anreicherungsprotokolls zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Bodenproben gesammelt und lebensfähige Phagenteilchen von kontaminierenden Bodenmikroorganismen abgetrennt werden. Der zweite Schritt besteht darin, Wirtszellen der Arthrobacter-Bakterien mit den isolierten Phagenteilchen zu infizieren. Anschließend werden die infizierten Bakterienzellen auf Agarplatten ausgestrichen, um Phagen durch Plaque-Bildung nachzuweisen. Der letzte Schritt besteht darin, gewünschte Phagen aus deutlich isolierten Plaques mithilfe der Strichplatte-Methode zu reinigen. Letztendlich ist diese Anreicherungstechnik für die vergleichsweise einfache Isolierung von Arthrobacter-Phagen aus der Art Arthrobacter species KY 3 9 0 1 optimiert.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Anreicherungsmethoden liegt in der Zugabe einer fein filtrierten Bodenprobe zu einer Reinkultur von Wirtsbakterien, um das Wachstum konkurrierender Bakterien zu vermeiden. Obwohl diese Methode sich als wirksam bei der Isolierung von Arthrobacter-Phagen erwiesen hat, sollte sie auch zur Isolierung von Phagen aus anderen bakteriellen Wirten anwendbar sein. Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir erfuhren, dass andere Forscher Schwierigkeiten hatten, Arthrobacter-Phagen zu finden.Mit traditionellen Anreicherungstechniken. Meine Schüler werden die Techniken demonstrieren, die zur erfolgreichen Isolierung von Arthrobacter-Phagen verwendet werden. Arthrobacter-Zellen werden aus Kolonien kultiviert, die auf einer LB-Agarplatte ausgestrichen wurden, und zwei bis drei Tage bei 30 Grad Celsius inkubiert.Verwenden Sie eine sterile Öse, um eine Kolonie aufzunehmen und zu 50 Milliliter LB-Brühe hinzuzufügen. Inkubieren Sie das Kolbenfläschchen in einem Schüttelinkubator bei 225 U/min und 30 Grad Celsius für etwa 24 Stunden in einem belüfteten Kulturkolben. Um exponentiell wachsende oder frühe stationäre Phasenzellen für Phageninfektionsversuche zu erhalten.Überwachen Sie sorgfältig den Zustand des bakteriellen Wachstums, um zu verhindern, dass die Zellen in die mittlere bis späte stationäre Wachstumsphase eintreten. Der ideale OD 600 für die Phagenisolation liegt zwischen 0,5 und 0,7. Da Bakterien der Gattung Arthrobacter häufige Bodenbakterien sind, finden sich diese und die Phagen, die sie infizieren, in den meisten Bodentypen.Sammeln Sie 200 bis 400 Gramm Boden von der gewünschten Stelle. Geben Sie mindestens 400 Milliliter Phagenpuffer zu dem Boden in einem ausreichend großen Becherglas, sodass mindestens 200 Milliliter Phagenpuffer im Überstand verbleiben und extrahiert werden können; mischen Sie vorsichtig durch Rühren oder Schwenken, bis der Boden suspendiert ist, und lassen Sie das Bodensediment typischerweise 30 Minuten lang absetzen. Entfernen Sie anschließend die Bodensedimentpartikel, indem Sie den Bodenextrakt durch ein Filterpapier mittels Vakuumfiltration leiten.Geben Sie vier Gramm LB-Pulver zu 200 Milliliter des filtrierten Bodenextrakts hinzu und mischen Sie, um eine 2%ige Lösung herzustellen. Führen Sie die Lösung durch ein 0,22-Mikron-Filter mittels Vakuumfiltration, um ein steriles Filtrat zu erhalten. Falls möglich, fahren Sie anschließend unmittelbar mit dem nächsten Schritt fort.Trotzdem können die filtrierten Proben gegebenenfalls bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden, bevor mit dem Verfahren fortgefahren wird. Allerdings wird die Anzahl lebensfähiger Phagenteilchen verringert sein. Unter aseptischen Bedingungen Aliquote mehrerer 50-Milliliter-Portionen der filtrierten LB-Bodenextraktmischung in einzelne 250-Milliliter-Flaschen abfüllen. Sterile, mit Baffles ausgestattete Kulturgefäße für Schüttelinkubation verwenden und sterile 2,0-molare Calciumchloridlösung bis zur gewünschten Endkonzentration hinzufügen.Da verschiedene Arthrobacter-Phagen unter unterschiedlichen Calciumchlorid-Bedingungen optimal wachsen, beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie je ein bis 2,5 Milliliter einer spät exponentiellen oder frühen stationären Bakterienkultur zu jedem der Kolben mit der filtersterilisierten LB-Bodenextraktmischung hinzufügen. Wenn der OD 600 der Kultur zwischen 0,5 und 0,7 liegt, verwenden Sie ein Milliliter. Liegt der OD 600 über 0,7, verwenden Sie 2,5 Milliliter.Schütteln Sie die Kolben 24 Stunden lang bei 250 U/min und 30 Grad Celsius in einem Schüttelinkubator. Entfernen Sie nach der 24-stündigen Inkubationszeit die Anreicherungskolben aus dem Schüttelinkubator. Verdünnen Sie die Anreicherungsproben im Verhältnis 1:10 in Phagepuffer.Richten Sie Kulturröhrchen mit 0,5 Millilitern spätexponentieller oder früher stationärer Bakterienkultur ein. Geben Sie verschiedene Mengen der verdünnten Anreicherungskultur, von fünf Mikrolitern bis 500 Mikrolitern, zu den Kulturröhrchen hinzu.Fügen Sie Calciumchlorid zu den Kulturröhrchen hinzu, um eine Endkonzentration in fünf Millilitern zu erreichen, die der Konzentration im ursprünglichen Anreicherungsfläschchen entspricht. Verwenden Sie eine Bandbreite unterschiedlicher Calciumchlorid-Konzentrationen, um viele Phagen mit variierenden Calciumchlorid-Abhängigkeiten auszuwählen. Geben Sie 4,5 Milliliter LB-Top-Agar zu jedem Kulturröhrchen hinzu und gießen Sie die Mischung auf eine LB-Agarplatte. Vorsichtig schwenken, um die Flüssigkeit gleichmäßig auf der Platte zu verteilen, und die obere Agarschicht etwa 15 Minuten lang erstarren lassen. Die Platten umdrehen und über Nacht bis zu 48 Stunden bei 30 Grad Celsius inkubieren. Inkubationszeiten variieren, um eine Optimierung für die vorhandenen Phagen zu erreichen; nach einer 24-stündigen Inkubation die Platten auf Plaque-Bildung überprüfen.Die meisten isolierten Phagen stammen von Platten, die bei 30 Grad Celsius und einer Konzentration von ein bis 2,5 Millimolar Calciumchlorid nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden inkubiert wurden. Die Reinigung gewünschter Phagen aus deutlich isolierten Plaques mithilfe eines Holzstäbchens stellt den anspruchsvollsten Teil dieses Verfahrens dar. Es ist technisches Fachwissen erforderlich, um die Plaques vorsichtig über die Rieselplatte zu verteilen und eine gleichmäßige Strichverimpfung zu erzeugen. Sterilisieren Sie ein Holzstäbchen, indem Sie es durch eine Flamme führen und abkühlen lassen.Berühren Sie kurz eine Plakette mit dem sterilen Holzstäbchen und reiben Sie das Stäbchen in sanfter Bewegung wie gezeigt auf der LB-Agarplatte. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einem sauberen Stäbchen für jeden Strich. Sobald die LB-Agarplatte mindestens dreimal bestrichen wurde, markieren Sie den Bereich mit der geringsten Konzentration an vermuteten Phagenpartikeln.Tragen Sie vorsichtig 0,5 Milliliter Arthrobacter und 4,5 Milliliter geschmolzenen LB-Top-Agar auf den markierten Bereich auf und lassen Sie ihn gleichmäßig über die Platte verteilen. Lassen Sie den Top-Agar mindestens eine Stunde lang erstarren; sobald die Platte erstarrt ist, drehen Sie sie um und inkubieren sie über Nacht. Wiederholen Sie die Strich-Plaque-Technik für mindestens drei Durchgänge, um sicherzustellen, dass eine reine Phagenart isoliert wird.Die Platten können bei Bedarf zwischen den Strichen bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius gelagert werden, ohne dass eine signifikante Verminderung der Phagenvitalität auftritt. Sobald die gewünschten Plaques auf der letzten Strichplatte gewachsen und isoliert wurden, berühren Sie einen gut isolierten Plaque mit einer Mikropipettenspitze und resuspendieren ihn in 100 Mikrolitern Phagepuffer. Verdünnen Sie diese Lösung seriell bis zur 10⁻⁸-Verdünnung, indem Sie 20 Mikroliter der Probe in 180 Mikroliter frischen Phagepuffer überführen. Geben Sie 10 Mikroliter jeder Verdünnung zu 0,5 Milliliter kultiviertem Arthrobacter in einem Kulturröhrchen und inkubieren Sie fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur.Anschießend die infizierten Bakterien mit 4,5 Milliliter geschmolzenem LB-Top-Agar, der die gleiche Konzentration an Calciumchlorid enthält wie zur Isolierung des Phagen aus der ursprünglichen Bodenprobe verwendet, vermischen und ausplattieren. Die Platten über Nacht inkubieren. Alle hergestellten Verdünnungen bis zum nächsten Tag bei vier Grad Celsius aufbewahren.Bestimmen Sie die Phagen-Zerealverdünnung, die erforderlich ist, um ein Netzwerk-Muster mithilfe des traditionellen Plaque-Titer-Assays herzustellen. Identifizieren Sie eine Netzwerk-Muster-Platte als weitgehend frei von Bakterien, jedoch mit Resten von Bakterien, die noch nicht von Phagen durchsetzt wurden. Geben Sie fünf Milliliter einer späten exponentiellen oder frühen stationären Arthrobacter-Kultur zu einem sterilen 50-Milliliter-Kulturkolben hinzu.Fügen Sie 100 Mikroliter der Verdünnung, die ein Netzwerk-Muster ergab, zur Arthrobacter-Kultur hinzu und lassen Sie die Phagen fünf bis zehn Minuten lang die Bakterienzellen infizieren. Geben Sie bei Raumtemperatur dem Kolben flüssigen LB-Top-Agar zu, der die gleiche Konzentration an Calciumchlorid enthält wie beim ursprünglichen Nachweis des Phagen auf der Platte. Verteilen Sie fünf Milliliter dieser Mischung auf jeweils zehn frische LB-Platten.Nachdem man dem oberen Agar erlaubt hat, zu erstarren, die Platten umdrehen und am folgenden Tag über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubieren. Die Platten mit Webmuster mit jeweils fünf Milliliter Phagenpuffer überfluten und über Nacht bei vier Grad Celsius lagern. Den Phagenlysat durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter filtrieren. Diesen endgültigen Phagenbestand zur Langzeitlagerung bei vier Grad Celsius aufbewahren.Geben Sie eine gleiche Menge des Phagenlysats in kleine sterile Gefäße mit Glycerin zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius. Im hier gezeigten Anreicherungsverfahren werden repräsentative Ergebnisse der Plaque-Isolierung für Phage DI bei Raumtemperatur, 30 Grad Celsius und 37 Grad Celsius mittels der Plaque-Ausstrich-Methode zur Gewinnung reiner Phagenpopulationen nach der initialen Anreicherung und Ausplattierung auf LB-Agar dargestellt. Die roten Kreise auf zwei der Platten markieren deutlich isolierte Plaques. Phage Dylan bildet bei drei unterschiedlichen Temperaturen ähnliche Plaques aus.Alternativ kann ein herkömmlicher standardmäßiger Plaque-Titer-Assay verwendet werden, um einen reinen Phagenstamm zu isolieren. Dieser Assay wurde hier eingesetzt, um phagenbedingte Titerzahlen und die Anzahl der Plaque-bildenden Einheiten zur Ausbildung eines Netzwerk-Musters auf einer Platte empirisch zu bestimmen. Eine Reihe von seriellen Verdünnungen für Phage Banana ist zusammen mit einem Beispiel dafür dargestellt, wie ein gutes Netzwerk-Muster aussehen sollte.Dies sind elektronenmikroskopische Aufnahmen von 20 Arthrobacter-Phagen, die mithilfe der Anreicherungstechnik isoliert wurden. Von den derzeit 25 isolierten Phagen sind 23 Cifo-Viren mit ziemlich langen Schwänzen. Zwei der isolierten Phagen sind Myo-Viren, die Kopfdurchmesser aufweisen, die in ihrer Länge der Länge ihrer Schwänze ähneln.Wenn die Anreicherungsplattierung einmal beherrscht ist, sollte dies die erfolgreiche Isolierung von Arthrobacter-Phagen aus einer Vielzahl von Bodenproben ermöglichen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Phagen mit der Strichstrich-Methode aus einer Umweltbodenprobe reinigt.

an-optimized-enrichment-technique-for-isolation-arthrobacter

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Quelle: Watson, D. C., et.al. Skalierbare Isolierung und Reinigung von extrazellulären Vesikeln aus Escherichia coli und anderen Bakterien. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Isolierung und Konzentration von extrazellulären Vesikeln (EVs), die aus der äußeren Membran von gentechnisch veränderten Bakterien gewonnen werden. Der Prozess umfasst die Kultivierung der Bakterien, um EVs freizusetzen, gefolgt von sequenziellen Zentrifugations- und Filtrationsschritten, um Zellen und Ablagerungen...

Isolierung und Anreicherung von extrazellulären Vesikeln aus der äußeren Membran aus Bakterien

Quelle: Cross, T. et al., Eine optimierte Anreicherungstechnik zur Isolierung von Arthrobacter-Bakteriophagearten aus Bodenprobenisolaten. J. Vis. Exp.(2015)Dieses Video demonstriert die Herstellung einer Bakterienkultur zur Herstellung von Bakteriophagen. Es behandelt die Schritte des Impfens eines Bodenbakteriums in eine belüftete Flasche, fördert ein gleichmäßiges Wachstum durch Belüftung und Schütteln sowie überwacht die Zelldichte mittels optischer Dichtemessungen. Sobald die Kultur die...

Herstellung einer Bakterienkultur im Boden für eine Bakteriophageinfektion

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp.(2015)This video demonstrates the isolation of bacteriophages from a soil sample. A soil sample is collected and suspended in a phage buffer and allowed to settle the sediment. The extract is filtered, and nutrients are added. A vacuum filtration is done to remove microbial contaminants. The filtrate with phages is aliquoted into flasks, and...

Isolation of Bacteriophages from a Soil Sample

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the isolation of Arthrobacter bacteriophages from a soil sample using enrichment and plaque assay techniques. It highlights the infection, amplification, and visualization of phages as clear lysis zones formed on a bacterial lawn.

Isolation of Arthrobacter Bacteriophages from a Soil Sample

Eine neuartige halbautomatische Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für den Einsatz mit umweltbedingten Geflügelproduktionsproben wurde entwickelt und zeigte Verbesserungen gegenüber einer herkömmlichen mechanischen und enzymatischen Extraktionsmethode in Bezug auf die quantitativen und qualitativen Schätzungen der gesamten Bakteriengemeinschaften.

Ein Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für die qualitative und quantitative Bewertung der bakteriellen Gemeinschaften aus Zucht Proben

Bakterien sezernieren nanometergroße extrazelluläre Vesikel (EVs), die bioaktive biologische Moleküle tragen. Die EV-Forschung konzentriert sich auf das Verständnis ihrer Biogenese, ihrer Rolle bei Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen und Krankheiten sowie ihrer potenziellen therapeutischen Anwendungen. Ein Workflow für die skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterien wird vorgestellt, um die Standardisierung der EV-Forschung zu erleichtern.

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Entomopathogene Pilzkolonien werden aus tropischen Bodenproben mit Tenebrio-Ködern, Galleria-Ködern sowie selektivem künstlichem Medium, d. H. Kartoffeldextrose-Agar, das mit Hefeextrakt angereichert ist, das mit Chloramphenicol, Thiabendazol und Cycloheximid (CTC-Medium) angereichert ist, isoliert.

Vergleich von Methoden zur Isolierung entomopathogener Pilze aus Bodenproben

Die Isolierung von schwermetallbeständigen Mikroben aus geothermischen Quellen ist ein heißes Thema für die Entwicklung von Bioremediations- und Umweltüberwachungsbiosystemen. Diese Studie bietet einen methodischen Ansatz zur Isolierung und Identifizierung von schwermetalltoleranten Bakterien aus heißen Quellen.

Bioprospektion extremophiler Mikroorganismen zur Bekämpfung der Umweltverschmutzung

Hier stellen wir eine einfache Technik zur Bewertung der antimikrobiellen Resistenz in der Umwelt (AMR) vor, indem der Anteil an niedermolekularer extrazellulärer DNA erhöht wird. Eine vorherige Behandlung mit 20%-30% PEG und 1,2 M NaCl ermöglicht den Nachweis sowohl genomischer als auch horizontal übertragener AMR-Gene. Das Protokoll eignet sich für einen kitfreien Prozess mit zusätzlicher Optimierung.

Verbesserte Extraktion von niedermolekularer DNA aus Abwasser zur umfassenden Bewertung von Antibiotikaresistenzen 

Hier beschreiben wir Methoden der Probenahme aus den euphotischen Zonen von Meeres- und Süßwasserökosystemen zur Isolierung von Cyanophagen (und ihren Wirten) und Post-Sampling-Prozesse, die einzelne Genotypen anreichern und die Dynamik der Virus-Wirt-Interaktion charakterisieren.

Umweltproben von photosynthetischen Mikroben und ihren Viren: Vom Feld ins Labor

Lernen Sie eine optimierte Enrichment-Technik zur Isolierung von Arthrobacter-Bakteriophagen aus Bodenproben. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse für die Phagenamplifizierung und -reinigung.

Eine optimierte Enrichment-Technik für die Isolierung von

Weitere Videos entdecken