Eine optimierte Enrichment-Technik für die Isolierung von Arthrobacter Bakteriophagen Arten von Bodenprobe Isolate

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Arthrobacter-Bakterienphasen aus Bodenproben mit Hilfe eines Anreicherungsprotokolls zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Bodenproben entnommen und lebensfähige Phagenpartikel von kontaminierten Bodenmikroorganismen isoliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, Arthrobacter-Bakterienzellen des Wirts mit den isolierten Phagenpartikeln zu infizieren.

Als nächstes werden infizierte Bakterienzellen auf Schneckenplatten plattiert, um Phagen zu identifizieren, was sich in der Plaquebildung zeigt. Der letzte Schritt besteht darin, die gewünschten Phagen aus eindeutig isolierten Plaques mit der Streak-Plate-Methode aufzureinigen. Letztendlich ist diese Anreicherungstechnik für die relativ einfache Isolierung von Arthrobacter-Phagen aus der Arthrobacter-Spezies KY 3 9 0 1 optimiert.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Anreicherungsmethoden besteht darin, dass eine fein gefilterte Bodenprobe zu einer Reinkultur von Wirtsbakterien hinzugefügt wird, um das Wachstum konkurrierender Bakterien zu vermeiden. Obwohl sich diese Methode für die Isolierung von Arthrobacter-Phagen als wirksam erwiesen hat, sollte sie für die Isolierung von Phagen aus anderen Bakterienwirten anwendbar sein. Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als wir erfuhren, dass andere Forscher Schwierigkeiten hatten, Arthrobacter-Phagen zu finden.

Mit traditionellen Anreicherungstechniken. Meine Studierenden demonstrieren die Techniken, mit denen Arthrobacter-Phagen erfolgreich isoliert werden können. Arthrobacter-Zellen werden aus Kolonien kultiviert, die auf einer LB-Schneckenplatte gestreift sind, und zwei bis drei Tage lang bei 30 Grad Celsius inkubiert.

Verwende eine sterile Schlaufe, um eine Kolonie zu entnehmen, und füge sie zu 50 Millilitern Pfund Brühe hinzu. In einer verwirrten Kultur inkubiert der Kolben den Kolben in einem Schüttelbrutator bei 225 U/min bei 30 Grad Celsius für etwa 24 Stunden. Zur Gewinnung exponentieller oder früher stationärer Phasenzellen für Phageninfektionsexperimente.

Überwachen Sie den Zustand des Bakterienwachstums genau, um zu verhindern, dass Zellen in das mittlere bis späte stationäre Wachstum eintreten. Zustand. Der ideale OD 600 für die Phagenisolierung liegt zwischen 0,5 und 0,7. Da es sich bei den Bakterien der Gattung Arthrobacter um häufige Bodenbakterien handelt, sind sie und die Phagen, die sie infizieren, in den meisten Bodenarten zu finden.

Sammeln Sie 200 bis 400 Gramm Erde an der gewünschten Stelle. Geben Sie mindestens 400 Milliliter Phagenpuffer in einem ausreichend großen Becherglas in den Boden, so dass sich mindestens 200 Milliliter Phagenpuffer im Überstand befinden und durch leichtes Rühren oder Schwenken extrahiert werden können, bis der Boden suspendiert ist, und lassen Sie das Bodensediment typischerweise 30 Minuten lang absetzen. Entfernen Sie anschließend Bodensedimente, indem Sie den Bodenextrakt durch Vakuumfiltration durch ein Filterpapier leiten.

Fügen Sie vier Gramm LB-Pulver zu 200 Millilitern des gefilterten Bodenextrakts hinzu und mischen Sie, um eine 2%ige Lösung herzustellen. Die Lösung wird durch Vakuumfiltration durch einen 0,22-Mikron-Filter geleitet, um ein steriles Filtrat zu erhalten. Wenn möglich, fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.

Trotzdem können die gefilterten Proben bei Bedarf bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius gelagert werden, bevor sie weitergehen. Die Anzahl der lebensfähigen Phagenpartikel wird jedoch reduziert, indem als septische Techniken mehrere 50-Milliliter-Portionen der filtersterilisierten LB-Bodenextraktmischung in einzelne 250 Milliliter aliquotiert werden. Sterilisierte, schüttelnde Kulturflaschen mit Blendschutz fügen sterile 2,0 molare Calciumchloridlösung zu den gewünschten Endkonzentrationen hinzu.

Da verschiedene Arthrobacter-Phagen unter unterschiedlichen Calciumchlorid-Bedingungen optimal wachsen, beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie jedem der Kolben, die eine filtersterilisierte LB-Bodenextraktmischung enthalten, ein bis 2,5 Milliliter Bakterienkultur aus der spätexponentiellen oder frühen stationären Phase hinzufügen. Wenn der OD 600 der Kultur 0,5 bis 0,7 beträgt, verwenden Sie einen Milliliter. Wenn der OD 600 höher als 0,7 ist, verwenden Sie 2,5 Milliliter.

Schütteln Sie die Kolben bei 250 U/min bei 30 Grad Celsius für etwa 24 Stunden in einem Schüttelinkubator. Nach Ablauf der 24-stündigen Inkubationszeit sind die Anreicherungskolben aus dem Schüttelbrutkasten zu nehmen. Verdünnen Sie die Anreicherungsproben in Phagenpuffer um das Zehnfache.

Richten Sie Kulturröhrchen mit 0,5 Millilitern spätexponentiell oder frühstationär ein. Phasen-Bakterienkultur. Geben Sie verschiedene Mengen von fünf Mikrolitern bis 500 Mikrolitern der verdünnten Anreicherungskultur in die Kulturröhrchen.

Calciumchlorid wird in die Kulturröhrchen gegeben, um eine Endkonzentration von fünf Millilitern zu erreichen, die der Konzentration im ursprünglichen Anreicherungskolben entspricht. Verwenden Sie eine Reihe unterschiedlicher Calciumchlorid-Konzentrationen, um für viele Phagen mit unterschiedlichen Calciumchlorid-Abhängigkeiten zu selektieren. Geben Sie 4,5 Milliliter LB Top Schnecke in jedes Kulturröhrchen und gießen Sie die Mischung auf eine LB Schneckenplatte.

Vorsichtig schwenken, um es gleichmäßig auf der Platte zu verteilen, und die obere Schnecke etwa 15 Minuten lang fest werden lassen. Die Platten umdrehen und über Nacht bis 48 Stunden bei 30 Grad Celsius inkubieren. Variieren Sie die Inkubationszeiten, um die vorhandenen Phagen nach einer 24-stündigen Inkubationskontrolle auf Plaquebildung auf den Platten zu optimieren.

Die meisten isolierten Phagen stammen aus Platten, die nach einer 24-stündigen Inkubationszeit bei 30 Grad Celsius bei einer Konzentration von einem bis 2,5 Millimolar Calciumchlorid inkubiert wurden. Der schwierigste Teil dieses Verfahrens war die Reinigung der gewünschten Phagen von klar isolierten Plaques mit einem Holzstab. Technisches Know-how ist erforderlich, um die Platten schonend über die Schneckenplatte zu verteilen und eine gleichmäßige Streifenplatte zu erzeugen. Sterilisiere ein Holzstäbchen, indem du es durch eine Flamme führst und abkühlen lässt.

Berühren Sie mit dem sterilen Holzstab kurz eine Platte und reiben Sie den Stab in der sanften Bewegung wie abgebildet auf die Schneckenplatte. Wiederholen Sie dies bei jedem Durchgang mit einem sauberen Stock. Sobald die LB-Schneckenplatte mindestens dreimal gestreift ist, markieren Sie den Bereich mit der geringsten Konzentration an mutmaßlichen Phagenpartikeln.

Tragen Sie vorsichtig 0,5 Milliliter Arthrobacter und 4,5 Milliliter geschmolzene LB-Top-Schnecke auf die markierte Stelle auf und lassen Sie es gleichmäßig auf der Platte verteilen. Lassen Sie die obere Schnecke mindestens eine Stunde lang erstarren, wenn die Platte erstarrt ist, drehen Sie sie um und brüten Sie sie über Nacht. Wiederholen Sie die Streak-Plaque-Technik für mindestens drei Iterationen, um sicherzustellen, dass eine reine Phagenspezies isoliert wird.

Die Platten können je nach Bedarf zwischen den Streifen bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius gelagert werden, ohne dass die Lebensfähigkeit der Phagen signifikant beeinträchtigt wird. Sobald die gewünschten Plaques gezüchtet und auf der endgültigen Streifenplatte isoliert wurden, berühren Sie eine gut isolierte Plaque mit einer Mikropipettenspitze und resuspendieren Sie sie in 100 Mikrolitern Phagenpuffer seriell. Verdünnen Sie diese Lösung bis zur Verdünnung von 10 bis minus Achtel, indem Sie 20 Mikroliter der Probe in 180 Mikroliter frischen Phagenpuffer geben. Geben Sie 10 Mikroliter jeder Verdünnung zu 0,5 Millilitern gezüchtetem Arthrobacter in einem Kulturröhrchen für fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur.

Mischen Sie dann die infizierten Bakterien mit 4,5 Millilitern geschmolzener LB-Top-Schnecke, die die gleiche Konzentration an Calciumchlorid enthält, die zur Isolierung des Phagen aus der ursprünglichen Bodenprobe verwendet wurde. Inkubieren Sie die Platten über Nacht. Bewahren Sie alle Verdünnungen bei vier Grad Celsius bis zum nächsten Tag auf.

Bestimmen Sie die Phagengetreideverdünnung, die zur Erstellung eines Netzmusters erforderlich ist, mit dem herkömmlichen Plaque-Titer-Assay. Identifizieren Sie eine Bahnmusterplatte, die größtenteils frei von Bakterien ist, aber Reste von Bakterien enthält, die noch nicht von Phagen geschnürt wurden. Fünf Milliliter spätexponentielle oder frühe stationäre Arthrobacterkultur werden in einen sterilen 50-Milliliter-Kulturkolben gegeben.

Fügen Sie 100 Mikroliter der Verdünnung hinzu, die der Arthrobacter-Kultur ein Netzmuster verleiht, und lassen Sie die Phagen die Bakterienzellen fünf bis 10 Minuten lang infizieren. Bei Raumtemperatur wird in den Kolben eine geschmolzene lb Top-Schnecke gegeben, die die gleiche Konzentration an Calciumchlorid enthält, die ursprünglich zur Identifizierung der Phagenplatte verwendet wurde. Fünf Milliliter dieser Mischung auf je 10 frische LB-Platten.

Nachdem Sie die obere Schnecke die Platten über Nacht bei 30 Grad Celsius verfestigen, invertieren und inkubieren lassen, fluten Sie die Bahnmusterplatten mit fünf Millilitern Phagenpuffer pro Platte und lagern Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Filtrieren Sie das Phagenlysat durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter. Lagern Sie diesen endgültigen Phagenfond bei vier Grad Celsius für die Langzeitlagerung.

Geben Sie eine gleiche Menge des Phagenlysats zu sterilem Glycerin in kleinen Fläschchen für die Bestandsarchivierung bei minus 80 Grad Celsius in dem in diesem Video gezeigten Anreicherungsverfahren, die Plaque-Streak-Methode zur Isolierung reiner Phagenpopulationen nach der anfänglichen Anreicherung und Plattierung auf der LB-Schnecke sind repräsentative Ergebnisse der Isolierung von Plaques für Phagen-DI bei Raumtemperatur, 30 Grad Celsius und 37 Grad Celsius. Die roten Kreise auf zwei der Platten umgeben deutlich isolierte Tafeln. Phage Dylan produziert ähnliche Plaques bei drei verschiedenen Temperaturen.

Alternativ kann ein traditioneller Standard-Plaquetiter-Assay verwendet werden, um ein reines Phagenisolat zu isolieren. Dieser Assay wurde hier verwendet, um die Phagentiterzahlen und die Anzahl der plaquebildenden Einheiten empirisch zu bestimmen, um ein Gurtmuster auf einer Platte zu bilden. Ein Satz serieller Verdünnung für Phagenbanane wird mit einem Beispiel gezeigt, wie ein gutes Bahnmuster aussehen sollte.

Dabei handelt es sich um elektronenmikroskopische Bilder von 20 Arthrobacter-Phagen, die mit der Anreicherungstechnik isoliert wurden. Von den 25 Phagen, die derzeit isoliert werden, sind 23 Cifo-Viren mit ziemlich langen Schwänzen. Bei zwei der isolierten Phagen handelt es sich um Myoviren, deren Kopfdurchmesser ähnlich lang sind wie der ihres Schwanzes.

Nach der Beherrschung sollte die Anreicherungsplattierung die erfolgreiche Isolierung von Arthrobacter-Phagen aus einer Vielzahl von Bodenproben ermöglichen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Phagen reinigt und in der Streifenfarbenmethode aus einer Umweltbodenprobe verwendet wird.