Die Messung der extrazellulären Ionenflüsse Verwendung der ionenselektiven selbst verweisMikroElektroden-Technik

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, extrazelluläre Ionenflüsse in vivo mithilfe der ionenselektiven, selbstreferenzierenden Mikroelektrodentechnik zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst die ionenselektiven und die Referenz-Mikroelektroden zusammengestellt werden. Der zweite Schritt besteht in der Kalibrierung und Validierung der ionenselektiven, selbstreferenzierenden Mikroelektroden.

Danach werden die ionspezifischen Flussmessungen am biologischen Probenmaterial in Form von Spannungsaufnahmen durchgeführt. Schließlich wird die Spannungsaufnahme in einen Ionenfluss umgerechnet. Letztendlich ermöglicht diese Technik die genaue, nicht-invasive Messung spezifischer extrazellulärer Ionenflüsse in lebenden Zellen oder Geweben.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Physiologie sowie bei Alterung, Regeneration oder Pathologie zu beantworten. Beispielsweise ermöglicht diese Methode die Identifizierung spezifischer Ionenströme, die biologische Prozesse wie die Gewebemorphogenese, das Wachstum oder die Differenzierung steuern. Diese Prozedur wird Dr. Gim Ardi, ein Postdoktorand aus dem Labor von Dr. Benjas, demonstrieren. Vor der Kalibrierung der Elektrode montieren Sie eine vorgefüllte ionenselektive Elektrode in einen Mikroelektrodenhalter mit einem ein Millimeter messenden goldfarbenen Stecker und einem mit Silberchlorid beschichteten Silberdraht.

Danach befestigen Sie den Mikroelektrodenhalter an einem dreidimensionalen, computer­gesteuerten elektronischen Mikroversteller. Die ionenselektive Elektrode selbst sollte bereits das Elektrolyt und die Ionenselektivitätsmischung für die betreffenden Ionen enthalten. Nach dem Montieren ist die Elektrode in eine Lösung mit einer Konzentration von einem Millimolar Kaliumchlorid einzutauchen.

Befestigen Sie außerdem die Referenzelektrode in einem geraden Mikroelektrodenhalter, der eine dreimolare Salzlösung in Agar, ein mit Silberchlorid beschichtetes Silberpellet und einen zweimillimetergroßen goldenen männlichen Verbinder für die Referenzelektrode enthält. Die Wahl der Salzlösung hängt von der zu messenden Ionenart ab. Nach der Herstellung der Referenzelektrode befestigen Sie den Elektrodenhalter an einem manuellen Mikropositionierer, der vorab an einem magnetischen Stativ montiert ist.

Nach dem Montieren sollte die Elektrode in eine Lösung mit einem Millimolar Kaliumchlorid eingetaucht werden. Vor Beginn muss die ionenselektive Elektrodenanordnung eine Verdünnungsreihe von Elektrolytkalibrierstandards vorbereiten, die die betreffenden Ionen enthalten. Wenn beispielsweise Kaliumkationen in einer physiologischen Konzentration von etwa einem Millimolar nachgewiesen werden sollen, stellen Sie eine dreistufige Log-Reihe von Kaliumchloridlösungen bei 10, 1 und 0,1 Millimolar her.

Dadurch wird der dynamische Erfassungsbereich maximiert, den der Assay erfordert. Um die ionenselektive Elektrode zu kalibrieren, tauchen Sie zunächst sowohl die ionenselektive als auch die Referenzelektrode in die am wenigsten konzentrierte Kalibrierlösung ein, in diesem Fall 0,1 Millimolar. Nach einer kurzen Stabilisierungsphase von ein bis drei Minuten bei Raumtemperatur messen und notieren Sie die stationäre Spannung.

Wiederholen Sie die Spannungsmessungen für die übrigen Kalibrierstandards und tragen Sie die gemessenen Spannungen gegen den Logarithmus der molaren Ionenkonzentrationen auf. Wenden Sie für jede Standardlösung eine lineare Regression an, um die N-Steigung, den Achsenabschnitt und den R²-Wert der Kalibrierkurve zu ermitteln. Um die Nernst-Steigung zu berechnen, dividieren Sie die gemessenen Spannungen durch die Gesamtverstärkung des Spannungsverstärkers.

Um das Messprotokoll zu demonstrieren, wird der Fluss von Kaliumionen aus einer perforierten Frosch-Oozyte mittels einer kaliumempfindlichen Mikroelektrode charakterisiert. Bevor die ionenselektive Elektrodenanordnung aufgebaut wird, schneiden Sie ein ein Zentimeter großes Stück aus einem 800-Mikrometer-Nylonnetz aus und kleben es auf eine Kunststoff-Petrischale. Bereiten Sie außerdem vorab Marks modifizierte Ringer-Lösung mit folgender Zusammensetzung vor: 100 Millimolar Natriumchlorid, zwei Molares Kaliumchlorid, zwei Millimolar Calciumchlorid, ein Millimolar Magnesiumchlorid und fünf Millimolar HEPES. Stellen Sie den pH-Wert des Puffers mit Natriumhydroxid auf 7,5 ein und geben Sie eine Portion des fertigen Puffers in die Petrischale.

Platzieren Sie vorsichtig die Froschzelle, die ionenselektive Elektrode und die Referenzelektrode in die Petrischale. Durchstechen Sie dann die Zelle und betätigen Sie den Mikropositionierer, sodass sich die ionenselektive Elektrode etwa 10 Mikrometer von der Probe entfernt befindet. Bezüglich der Nomenklatur wird der aktuelle Abstand zwischen Probe und Elektrode als „nahe Position“ bezeichnet.

Als Nächstes betätigen Sie den Mikropositionierer, sodass die ionenselektive Elektrode periodisch von der Nahposition von 10 Mikrometern zu einer weiter entfernten Position von 100 Mikrometern wechselt und dann mit einer Frequenz von 0,3 Hertz – das heißt drei vollständige Hin-und-her-Bewegungen pro 10 Sekunden – zur Nahposition zurückkehrt. Während der Aktivierung des Mikropositionierers überprüfen Sie, dass sich die Elektrode tatsächlich senkrecht zur verletzten tangentialen Oberfläche des Zells aktivieren Sie die Software zur Spannungsmessung und -aufzeichnung. Der Mikropositionierer ist so programmiert, dass er kurz an der Nah- und der Fernposition verweilt, während die Spannungsdaten erfasst werden.

Die Datenaufzeichnung erfolgt kontinuierlich während der Oozyten-Wundheilung, was etwa 15 Minuten dauert; bei längeren Experimenten, wie beispielsweise der Beobachtung mehrtägiger Prozesse während der Regeneration des Schwanzes von Krallenfrosch-Larven, werden die Messungen zu verschiedenen Zeitpunkten jeweils zwei Minuten lang aufgezeichnet. Zum Beispiel nach 1, 3, 6, 12 und 24 Stunden. Nach Abschluss des Experiments extrahieren Sie die Spannungsdaten als Textdatei und übertragen Sie die Werte in eine Tabellenkalkulation.

Verwenden Sie die zuvor bestimmte Kalibrierungskurve, um die gemessenen Spannungswerte in die entsprechenden Ionenkonzentrationen umzuwandeln. Tragen Sie die extrapolierten Ionenkonzentrationen als Funktion der Entfernung von der biologischen Probe auf. Berechnen Sie abschließend den Ionenfluss unter Anwendung des Diffusionsgesetzes.

Wobei C die Ionenkonzentration in der Lösung, MU die Ionenbeweglichkeit und DC DX die Konzentrationsdifferenz über die Distanz dx ist. Vor biologischen Experimenten kann der Wert des Achsenabschnitts der NER-Steigung sowie die gesamte Kalibrierungskurve für die ionenselektive Elektrode anhand eines künstlichen Iongradienten überprüft werden, der aus einer einmolaren Ionenquelle stammt und in einer Petrischale platziert ist. Wenn Änderungen der Kaliumionenkonzentrationen in einem Abstand nahe oder fern der Wunde am Annu-Site aufgetragen werden.

Die Daten deuten darauf hin, dass zu Beginn einer zellulären Verletzung ein massiver Kaliumfluss auftritt; während die Wundheilung fortschreitet, nimmt der Kaliumfluss allmählich nach 15 Minuten wieder auf ruhende Niveaus ab, wenn die Wunde vollständig verheilt ist. Darüber hinaus erscheint die plötzliche Zunahme und die anschließende allmähliche Abnahme des Kaliumflusses nach der Verletzung statistisch signifikant, wenn sie mit einer intakten Kontroll-Oozyte verglichen wird, sobald die gemessenen Kaliumionenkonzentrationen in Ionenfluss umgerechnet werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die fluoreszenzbasierende Markierung bioelektrischer Vorgänge durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Eigenschaften interzellulärer und subzellulärer Ionenflüsse zu beantworten.