Name: Gebote und Verbote in der Herstellung von Muscle Kryoschnitte für die histologische Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Muskel-Kryoschnitten für histologische Analysen. Diese Methode vermeidet Gefrierartefakte durch schnelles Einfrieren in Isopentan und optimales Einbetten. Sie ermöglicht präzise Untersuchungen von Muskelbiopsien.

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Wir möchten Alex Miller für die Überarbeitung des Manuskripts danken. Diese Arbeit wurde durch die Forschungsstipendien unterstützt, die M.G. von Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) und Muscular Dystrophy Association (218938) gewährt wurden.

1. Tissue Ernte und Einfrieren von Muskelgewebe <ol><li> Euthanize die Maus mit einer Überdosis Isofluran (2-Chlor-2- (difluormethoxy) -1,1,1-trifluor-ethan). Führen Sie diesen Schritt in einem Abzug und verwenden Sie eine Auffangverfahren, wie einem Exsikkator oder einer Glasglocke, die ein Wattestäbchen in Isofluran getränkt. </li><li> Tod Bestätigen fest drückte Fußballen. Verwenden Sie eine sekundäre Methode der Euthanasie wie Genickbruch. </li><li> Befeuchten Sie das Fell mit 70% Alkohol, um das Anhaften von losen Haarsträhnen auf die Muskeln zu reduzieren. Schälen Sie die Haut von dem Schenkel mit einer feinen Pinzette, wie # 5. </li><li> Trennen Sie vorsichtig die Muskeln von Interesse (tibialis anterior (TA) in diesem Fall) von den Knochen unter, ausgehend von der Sehne und zu entfernen. </li><li> Auszuschneiden den Muskel, bedecken Sie es in OCT (optimale Schnitt Temperatur-Verbindung), und legen Sie ihn flach auf einem markierten Einweggefrierform. Stellen Sie sicher, dass der Muskel an seinem normalen physiologischen Orientierung (Kopf bis tail) ohne Dehnung. Alternativ einfrieren den Muskel auf kleinen Styropor-Plätze und stecken Sie es mit Insektenstifte auf die richtige Länge der Muskeln zu gewährleisten. </li><li> Chill-2-Methylbutan (Isopentan) in einem Stahlbecher mit Hilfe von flüssigem Stickstoff. Dies dauert im Durchschnitt 3-5 min. Halten Sie das Rühren mit Unterbrechungen bis weiße Niederschläge beginnen, sich auf den Boden und die Wände des Bechers zu bilden. HINWEIS: Wenn dies geschieht, Isopentan optimale Gefriertemperatur erreicht hat (150 ° C) </li><li> Tauchen Die Formen, die Muskeln in der gekühlten 2-Methylbutan. Einfrieren kleinen Muskeln, wie der Membran und extensor digitorum longus (EDL) für 6-12 sec und größere Muskeln wie gastrocnemius soleus (GS) und Trizeps für 15-20 sec. Die Muskeln Nicht einfrieren zu lange, da dies zu Rissen führen. </li><li> Übertragen Sie die gefrorenen Gewebe auf Trockeneis und lassen Sie die Isopentan verdampft (beachten Sie, dass dieser Prozess dauert im Durchschnitt etwa 15 bis 20 min). Wickeln Sie das Gewebe in Aluminiumfolie und im Kühlschrank bei ultra niedriger Temperatur (-70 ° C bis -80 ° C) bis zum Schneiden. </li></ol> 2. Einbindung der Gewebe in OCT zu Tissue-Block vorbereiten <ol><li> Transport Gewebe auf Trockeneis zu cyrostat zu Auftauen zu verhindern. Transfer Gewebe Kryostatkammer (bei -20 bis -24 ° C eingestellt, um volle Auftauen der Gewebe zu vermeiden) und lassen Sie sie für 30 Minuten ins Gleichgewicht kommen. </li><li> Drehen Sie das Peltier-Kühlschacht auf. Wenn der Kryostat nicht diese Kühlung haben, verwenden Aerosolkühlspray, schnell einfrieren Oktober Lassen Sie sich nicht den Muskel Tauwetter zu irgendeinem Zeitpunkt während der Einbettung, da dies zu Frostschäden führen. </li><li> Fügen Sie eine gleichmäßige dünne Schicht von Oktober auf der Probenscheibe und abkühlen lassen. Wenn die meisten der Oktober ist auf dem Boden, während immer noch Flüssigkeit auf der Oberseite eingefroren, legen Sie die Gewebe an der richtigen Ausrichtung (senkrecht zur OCT zur Querabschnitte und parallel Oktober für Längsschnitte). Benutzen Sie Aerosol-Kühlspray, schnell einfrieren Oktober Tippen Sie auf die unembeded Teil des Gewebes mit Wärme extRactor und warten Sie 45 Sekunden. </li><li> Fügen Sie eine weitere dünne Schicht Oktober rund um die Muskeln, Aerosolspray mit Kühlspray und extrahieren Sie die Hitze wie im vorherigen Schritt. </li><li> Halten Sie das Hinzufügen Oktober in kleinen Schritten und schnell einfrieren des OAT mit einer Kombination von Aerosol-Kühlspray und Wärmeableitblock bis der ganze Muskel wird abgedeckt. </li><li> Legen Sie die Wärmeableitblock auf der Oberseite der Gewebeblock, und warten Sie 5 Minuten. </li></ol> 3. Vorbereitung Profile und Identifizieren der Teile von Mid-Bauch Region der Muskeln <ol><li> Montieren Sie die Probe auf die Probe Kopf. Ziehen Sie den Knopf, um die Disc zu sichern. Stellen Sie sicher, dass die Objektplatte ist in einem guten Kontakt mit dem Objektkopf. </li><li> Passen Sie die Raumtemperatur zwischen -21 und -24 ° C, und warten Sie, bis die eingestellte Temperatur erreicht ist. </li><li> Passen Sie die Einstellungen Dicke (7 &amp; mgr; m); schneiden Sie den Block durch Vorschieben oder Zurückziehen des Blocks mit Grob- und Feineinstellungen. </li><li> Sammeln Sie die AbschnitteAuf vorgewärmten positiv geladenen Objektträgern durch Drücken der Oberseite des Schiebers auf die Abschnitte mit der Anziehung zwischen entgegengesetzten Ladungen, um die Haftung der ausgeschnittenen Abschnitte zu der Folie zu erleichtern. </li><li> Identifizieren Sie die Mitte der Bauchabschnitte durch Messung Querschnittsfläche (CSA) der Abschnitte. Tun Sie dies mit Imaging-Software auf dem Computer, an das Mikroskop angeschlossen ist. HINWEIS: Phasenkontrastbilder aufgenommen und Umfang des gesamten Muskel wird über eine Rückverfolgung-Funktion auf dem Software-Programm gemessen. Dies wird sowohl CSA sowie minimale Frettchen Messer (Maß für die Faserquerschnittsgröße, die als der kleinste Abstand zwischen zwei parallelen Tangenten an gegenüberliegenden Seiten eines Teilchens ausgedrückt wird) Messungen zu erhalten. Hinweis: Bei der CSA und Frettchen Mindestdurchmessermessungen beginnen, Plateau, hat Mitte Bauch erreicht ist. </li><li> Inventur und Archivierung der Objektträger bei -80 ° C für die künftige Färbung. HINWEIS: Oktober muss nicht vor der entfernt werden, um staining Verfahren. Sobald Folien eingedeckt werden, sind sie bereit, sofort gefärbt werden. </li></ol> 4. Die Färbung HINWEIS: Während ausführliche Schritt-für-Schritt-Verfahren finden Sie auf der Produkt-Datenblatt entnommen werden und sollte für Färbeverfahren befolgt werden, können persönliche Optimierung erforderlich, um eine optimale Färbung zu erhalten. <ol><li> Da die Montage Medien (siehe Tabelle) ist nicht mit Wasser mischbar ist, dehydrieren gleitet durch zunehmende Grade von Alkohol (2 min jeweils in 70%, 95% und 100% Ethanol), und deaktivieren Sie sie mit Xylol (100% für 5 Minuten), um sicherzustellen, Dias nicht undurchsichtig über die Zeit. </li><li> Deckglas Sektionen und trocknen lassen. Bild mit Mikroskop mit Bildbearbeitungssoftware ausgestattet. </li></ol>

<ol><li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+disorders+%3A+NMD%22%5BJournal%5D)">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Histologie und Immunhistochemie wurden als wichtige Instrumente für das Verständnis der Manifestation und Progression der Pathologie in verschiedenen neuromuskulären Erkrankungen eingesetzt. Klassischerweise wurden Muskelbiopsien ersten in Formaldehyd fixiert und dann mit Paraffinwachs eingebettet. Während Formaldehydfixierung bewahrt Gewebearchitektur und ermöglicht Gewebe Lagerung und Transport bei RT, inaktiviert es auch Enzyme und Proteine ​​Vernetzungen erfordern weitere Schritte, um genaue Immunfärbung zu erzielen...

Prüfung der Muskel Histologie spielt eine entscheidende Rolle für das Verständnis der verschiedenen Arten von neuromuskulären Störungen 1-4. Wenn sie mit anderen Techniken kombiniert, erlaubt es Forschern, eine bessere Vorstellung von der Manifestation und Progression der Pathologie zu bekommen und kann auch wichtig sein, um die Wirksamkeit eines therapeutischen Interventions 5-10 bewerten. Jedoch genau zu sein, müssen die Gewebe in der richtigen Art und Weise gespeichert, die den physiologischen Zustand unmittelbar vor dem Herausschneiden erhalten. Dies erfordert große Sorgfalt bei der Entnahme, Konservierung, Schnitte, und Färbung. Gewebe können auf zwei verschiedenen Wegen für lichtmikroskopische Untersuchung vorbereitet werden. Das erste Verfahren, Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Abschnitten erfordert Gewebe in 10% gepuffertem Formaldehyd natürlichen bevor sie mit Paraffin eingebettet 11,12 fixiert werden. Der Fixierungsschritt hilft, Morphologie besser zu bewahren, sondern auch Querverbindungen endogenen proteins macht es erforderlich komplizierte Antigen-Retrieval-Verfahren für die Immunfärbung und die Beseitigung der Möglichkeit der enzymatischen Flecken auf solche Abschnitte 12. Gefrierschnitte andererseits brauchen nicht vor, eine feste oder verarbeitet werden sollen; daher sind Proteine ​​in der Lage, native biologische Konformationen 13,14 beibehalten. Ferner gefrorene Schnitte auch schnelle Durchlaufzeit, die manchmal notwendig ist, beispielsweise in der intraoperativen Diagnose von Sarkomen und anderen chirurgischen Biopsien 15 ermöglichen. , Wenn nicht richtig gemacht, Diese Methode ist jedoch anfällig für Schäden, die Änderungen an Muskel-Architektur macht die Abschnitte ungeeignet für die histologische Untersuchung stellt einfrieren. Dieses Papier wird die effektivste Methode, um Muskelbiopsien, um eine optimale Färbung für die ordnungsgemäße Prüfung zu erreichen vorbereiten zu skizzieren.

<table><tbody><tr><td>Kryostat</td><td>Leica CM 1850</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., Bürotelefon 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Telefon: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus</td></tr><tr><td>Bildanalysesoftware</td><td>Nikon Imaging Software Grundlagenforschung</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Telefon: 1-631-547-8500 Alternativen: Image J, Metamorph</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>14043-220-05</td><td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td><td>1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A.</td></tr><tr><td>OKT</td><td>4583</td><td>Sakura Inc.</td><td>Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative Quelle: Leica Microsystem</td></tr><tr><td>Freeze It</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Einweg-Taschentuchform</td><td>22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Colorfrost plus Folien</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Ethylalkohol</td><td>HC-1300-1GL</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific</td></tr><tr><td>2-Methylbutan</td><td>M 32631-SL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Xylole</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxylin Gill #3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>6766007</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative Quelle: VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

gebote und verbote in der herstellung von muscle kryoschnitte für die histologische analyse

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Histologische Bewertung von Muskelbiopsien wurde als unverzichtbares Instrument für das Verständnis der Entwicklung und Progression von Pathologie der neuromuskulären Erkrankungen serviert. Um dies zu tun, muss jedoch die richtige Pflege, wenn das Ausschneiden und die Erhaltung Gewebe, um eine optimale Färbung erreichen ergriffen werden. Eine Methode der Gewebekonservierung beinhaltet Befestigungs Gewebe in Formaldehyd und dann Einbettung mit Paraffinwachs. Dieses Verfahren bewahrt Morphologie gut und ermöglicht langfristige Lagerung bei Raumtemperatur, ist aber umständlich und erfordert Umgang mit giftigen Chemikalien. Ferner Formaldehydfixierung ergibt Antigen Vernetzung, die Antigen-Retrieval-Protokolle für eine wirksame Immunfärbung erfordert. Im Gegenteil, ist gefrorene Schnitte nicht Fixierung erfordern und somit behält biologischen Antigen-Konformation. Dieses Verfahren stellt auch einen entscheidenden Vorteil in der schnellen Durchlaufzeit, so dass es besonders hilfreich in Situationen, brauchen schnelle histologische Auswertung wie intraoperative chirurgischen Biopsien. Hier beschreiben wir die effektivste Methode zur Herstellung von Muskelbiopsien zur Visualisierung mit unterschiedlichen histologischen und immunologischen Flecken.

Das Set-up für die Ernte und das Einfrieren von Gewebe kann in 1 gesehen werden kann. Entfernte Gewebe sollte auf eine Gaze in PBS eingeweicht, um das Trocknen (1A) zu vermeiden, gespeichert werden. Werden die Gewebe so ausgewählt sind, für die histologische Analyse verwendet werden, sollten in OCT eingetaucht werden und auf Kryo Form gelegt in der richtigen Orientierung und so nahe physiologischen Länge möglichst genaue Morphologie (1B) zu gewährleisten. Aufschlämmung ...

Hier demonstrieren wir die effizientesten Methoden zum Einfrieren, Einbetten, Kryoschneiden und Färben von Muskelbiopsien, um das Einfrieren von Artefakten zu vermeiden.

Gebote und Verbote in der Herstellung von Muscle Kryoschnitte für die histologische Analyse

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Fallstricke bei der Herstellung von Gefrierschnitten aus Muskelbiopsien zu vermeiden, beispielsweise die Entstehung von Gefrierartefakten. Dies wird erreicht, indem der Muskel zuerst rasch in zwei Methylbutan eingefroren wird, das mit flüssigem Stickstoff gekühlt wurde. Nachdem die Muskelbiopsien im Kryostat äquilibriert wurden, werden sie bei Raumtemperatur schrittweise in optimalem Schneidetemperatur-Medium eingebettet, wobei eine schnelle Einfrierung unter Verwendung von Aerosolkühlung und Wärmeentzug erfolgt.Anschließend werden sieben Mikrometer dünne Schnitte angefertigt und auf warme, positiv geladene Objektträger übertragen. Der letzte Schritt besteht darin, die Gewebeschnitte nach Bedarf zu färben, um die Histologie des Gewebes zu beurteilen. Letztendlich führen korrekt präparierte Muskelbiopsien zu gut erhaltener Gewebehistologie ohne Gefrierartefakte.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen etablierten Methoden, wie der Schnittführung an paraffin-eingebettetem Gewebe, liegt daher in ihrer hohen Geschwindigkeit und darin, dass sie die Struktur und Funktion endogener Antigene nicht verändert. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Gesundheit und Krankheit in der Muskelbiologie zu beantworten, beispielsweise bezüglich Wachstum, Regeneration, Entzündung, Fibrose und Nekrose. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie oder Diagnose von Muskelerkrankungen, da sie die Beurteilung des Zustands von gesundem und krankem Muskelgewebe ermöglicht.Obwohl diese Methode Einblicke in verschiedene Formen der Muskeldystrophie ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, wie beispielsweise die Cachexie im Endstadium von Krebs und AIDS sowie den Muskelschwund bei älteren Bevölkerungsgruppen. Beginnen Sie damit, eine Maus unter einem Abzug und in einer sekundären Sicherheitsstufe, beispielsweise einem Glockenkolben, durch eine Überdosis Isofluran zu euthanasieren. Bestätigen Sie den Tod des Tieres, indem Sie fest auf dessen Fußsohle drücken.Nun befeuchten Sie das Fell mit 70 % Alkohol. Dies verhindert, dass lose Haare an den Muskeln haften. Fahren Sie fort, indem Sie die Haut mit einer feinen Pinzette der Größe fünf vom Gliedmaßenabschnitt ablösen.Trennen Sie vorsichtig den Muskel von Interesse vom Knochen ausgehend vom Sehnenansatz. In diesem Fall wird der Musculus tibialis anterior isoliert. Nach der Entfernung des Muskels bedecken Sie ihn mit OCT und legen ihn flach auf eine beschriftete, wegwerfbare Gefriermatrix. Weitere OCT-Medien werden später vor dem Schneiden hinzugefügt. Stellen Sie sicher, dass der Muskel in seiner normalen physiologischen Ausrichtung entlang der Kopf-Schwanz-Achse liegt und dass der Muskel nicht gedehnt ist. Kühlen Sie nun ab.Einige Isopentan in einem Stahlbecher mit fl&uuml;ssigem Stickstoff. R&uuml;hren Sie gelegentlich drei bis f&uuml;nf Minuten lang mit einem Plastikspatel um. Sobald sich ein wei&szlig;er Niederschlag bildet, hat das Isopentan seine optimale Temperatur erreicht; zu diesem Zeitpunkt tauchen Sie die beladenen Formen in die L&ouml;sung ein.Kleine Muskeln wie das Zwerchfell und der lange Fingerstrecker benötigen sechs bis zwölf Sekunden. Größere Muskeln benötigen 15 bis 20 Sekunden, wobei ein zu langes Einfrieren zu Rissen führen kann. Der nächste Schritt besteht darin, das gefrorene Gewebe auf Trockeneis zu legen, damit das restliche Isopentan verdunsten kann, was etwa 15 bis 20 Minuten dauert.Sobald das Gewebe trocken ist, es schnell in Folie einwickeln und im Minus-80-Grad-Celsius-Gefrierschrank aufbewahren, bis es geschnitten werden kann. Vor dem Schneiden: die gefrorenen Gewebeproben unter Trockeneis zum Kryostaten transportieren.Überführen Sie das Gewebe in eine Kryostatkammer, die auf minus 24 bis minus 20 Grad Celsius eingestellt ist, und lassen Sie es 30 Minuten lang akklimatisieren. Das Gewebe wird bei dieser Temperatur nicht vollständig auftauen. Als Nächstes wird das Gewebe zunächst eingebettet.Falls verfügbar, aktivieren Sie die Peltier-Bay-Kühlung. Zweitens tragen Sie eine gleichmäßige dünne Schicht OCT auf die Probenscheibe auf und lassen Sie sie abkühlen. Drittens, sobald das OCT unten gefroren, aber oben noch flüssig ist, setzen Sie das Gewebe ein, richten es senkrecht zum OCT für Querschnitte und parallel zum OCT für Längsschnitte aus.Verwenden Sie nun ein Aerosol-Kühlspray, um das OCT schnell einzufrieren. Berühren Sie anschließend den unversehrten Teil des Gewebes mit einem Wärmeabzug und halten Sie ihn 45 Sekunden lang am Gewebe fest. Lassen Sie den Muskel während dieses gesamten Vorgangs in keinem Schritt auftauen.Falls der Kryostat nicht über eine Peltier-Bay-Kühlung verfügt, verwenden Sie Aerosolkühlung, um das OCT um das Gewebe herum schnell einzufrieren. Tragen Sie nun eine weitere dünne Schicht OCT um den Muskel auf, sprühen Sie erneut Aerosolkühlungsspray auf und leiten Sie die Wärme wie im vorherigen Schritt ab. Fügen Sie das OCT schrittweise in kleinen Mengen hinzu und frieren Sie es jeweils schnell mit einer Kombination aus Aerosolkühlungsspray und Wärmeableiter ein, bis der gesamte Muskel bedeckt ist.Dann setzen Sie den Wärmeabzug auf die Oberseite des Gewebeprobenblocks und warten Sie fünf Minuten, bevor Sie mit dem Schneiden fortfahren. Die Probe ist nun bereit, am Probenträger befestigt zu werden. Zunächst drehen Sie den Knopf fest, um die Scheibe zu sichern.Stellen Sie sicher, dass die Probenscheibe gut mit dem Probenträger in Kontakt steht, während die Kammer auf eine Temperatur zwischen minus 24 und minus 20 Grad Celsius abkühlt. Stellen Sie die Schnittdicke auf sieben Mikrometer ein, sobald die Kammer die Betriebstemperatur erreicht hat, und beginnen Sie, den Block zu beschneiden. Verwenden Sie die Grob- und Feineinstellung, um den Block zu bewegen.Wenn die Schnitte zum Aufsammeln bereit sind, drücken Sie deren obere Seiten auf mit der Lampe erwärmte, positiv geladene Objektträger. Bei korrekter Einfrierung sollte die Gewebeseite mattweiß erscheinen. Ein Gewebe dagegen, das falsch eingefroren wurde oder während des Aufbringens aufgetaut ist, erscheint rot bis rosa.Die Objektträger können zur späteren Analyse im Tiefkühler aufbewahrt werden. Der mittlere Bauchabschnitt des Gewebes kann identifiziert werden, indem die Querschnittsfläche anhand von Phasenkontrastbildern mithilfe der Konturverfolgungsfunktion einer Bildverarbeitungssoftware gemessen wird. Diese Analyse liefert sowohl die Flächen- als auch die Messung des minimalen Feret-Durchmessers.Wenn diese Messungen beginnen, ein Plateau zu erreichen, ist der mittlere Bauchbereich erreicht. Obwohl Hersteller Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die meisten Färbeprotokolle bereitstellen, kann eine individuelle Optimierung erforderlich sein, um optimale Färbungsintensitäten zu erzielen. Das OCT muss nicht entfernt werden.Verwenden Sie für die Färbung zur optimalen Immunfärbung eine befeuchtete Kammer. Diese sollte mit Perfil abgedeckt sein, auf einem nassen Papiertuch liegen und in einer kleinen Box versiegelt werden, um das Austrocknen der Schnitte zu vermeiden. Bei der Färbung von permanenten Präparaten ohne Immunfärbung dehydrieren Sie die Objektträger gemäß dem Färbeprotokoll durch aufsteigende Alkoholkonzentrationen.Da Eindeckmedien mit Wasser nicht kompatibel ist, klären Sie die Objektträger mit einem fünfminütigen Bad in 100 % Xylol. Dadurch wird sichergestellt, dass die Objektträger im Laufe der Zeit nicht trüb werden. Fahren Sie anschließend mit dem Eindecken fort und nehmen Sie Bilder von Schnitten des mittleren Bauchbereichs des Musculus tibialis anterior auf, die gefärbt wurden.Unter Verwendung von Hämatin und Eosin. Schnitte, die ordnungsgemäß verarbeitet wurden, weisen eine gleichmäßige Morphologie und eine homogene Färbung auf. Unzureichend verarbeitete Muskeln, die durch Einfrieren beschädigt oder vorzeitig aufgetaut wurden, zeigen dagegen multiple Brüche in der Morphologie und sehen zerkleinert aus.Die Immunhistochemie wurde ebenfalls an diesen Schnitten durchgeführt. Diese Färbungen waren zufriedenstellend. Fibronectin ist grün gefärbt und DAPI erscheint in Blau.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie genau wissen, wie man einen guten Gefrierschnitt aus Muskelbiopsien zur Beurteilung der Muskelarchitektur herstellt. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in etwa vier bis fünf Stunden durchgeführt werden, sofern alle Schritte ordnungsgemäß ausgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, das Auftauen der Muskeln nach diesem Verfahren zu verhindern.Andere Methoden wie Immundefärbung und Einblicke in die Hybridisierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich Wachstum und Regeneration zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Nachgewiesene in diesem Video sind die Techniken für Flash Einfrieren und Schneiden embryonalen Hirngewebe von Mäusen. Nützliche Tipps für die Verwendung des Kryostaten gegeben sind, einschließlich Methoden zur Problembehandlung, mit denen während des Schneidens, um sicherzustellen, dass das resultierende Gewebe Abschnitte frei von Rissen und anderen Verzerrungen können.

Flash-Freezing und Kryoschneiden E12.5 Gehirn der Maus

Dieses Video beschreibt das Verfahren zum Einfrieren von Muskelgewebe und zum Gewinnen seiner Dünnschnitte. Die Technik kann helfen, krebsbedingte Kachexie in Darmkrebs-Mausmodellen zu untersuchen.

Snap Freezing von Muskelgewebe für das Schneiden: Ein Protokoll zur Gewinnung ultradünner Schnitte von schnell eingefrorenem Mausmuskelgewebe

Die Analyse von Skelettmuskelgewebe zur Bestimmung struktureller, funktioneller und biochemischer Eigenschaften wird durch geeignete Vorbereitung erheblich erleichtert.  Dieses Protokoll beschreibt geeignete Methoden zur Vorbereitung des Skelettmuskelgewebes für ein breites Spektrum von Phänotypisierungsstudien.

Tissue Triage und Einfrieren der Modelle von Skelettmuskelerkrankungen

In diesem Manuskript stellen wir eine halbautomatische Kryohistologie-Plattform mit hohem Durchsatz vor, um ausgerichtete Kompositbilder von Mehrfachreaktionsmessungen aus mehreren Runden der Fluoreszenzbildgebung an gefrorenen Schnitten mineralisierter Gewebe zu erstellen.

Hochdurchsatz, Multi-Bild Cryohistology von mineralisiertem Gewebe

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll akuten Skelettmuskelregeneration in erwachsenen Mäusen und nachfolgende Manipulationen der Muskeln zu induzieren, wie Dissektion, Einfrieren, Schneiden, Routine-Färbung und myofiber Querschnittsfläche Analyse.

Die Induktion von Akute Skelettmuskelregeneration durch Cardio Injection

Aufeinanderfolgende Kryo-Abschnitte werden gesammelt, um histologische Anwendungen und Anreicherung von RNA für Genexpressionsmessungen mit benachbarten Regionen aus einer einzigen Maus Skelettmuskel ermöglichen. 30 mg gepoolt Kryoabschnitte und Messungen werden direkt im Vergleich über mehrere Anwendungen hinweg - Qualitativ hochwertige RNA wird aus 20 erhalten.

Kryoschneiden von benachbarten Regionen eines einzelnen Maus Skelettmuskel für die Genexpression und histologische Analysen

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren Muskelgewebe einzufrieren, indem sie direkt in flüssigen Stickstoff tauchen. Dieses Protokoll zeigt auch eine neue Cryovial, die den „Decke-Effekt“ von Stickstoffgas, wenn flüssiger Stickstoff in Kontakt mit der Gewebeoberfläche einer Probe zu vermeiden.

Ein Multi-Loch Cryovial Eliminiert Einfrieren Artefakte, wenn Muskelgewebe wird in flüssigem Stickstoff direkt tauchend

Aktive Autophagie ist mit produktiven Muskelregeneration verbunden, die für die Muskelstammzell-Aktivierung (MuSC) essentiell ist. Hier stellen wir ein Protokoll für die in situ- Detektion von LC3, einen Autophagie-Marker in MyoD-positiven MuSCs von Muskelgewebeabschnitten von Kontroll- und verletzten Mäusen zur Verfügung.

In situ Immunfluoreszenz Färbung der Autophagie in Muskelstammzellen

Beschrieben hier ist ein Protokoll zur direkten Immunkennzeichnung von nekrotischen Myofikern in Muskelkryosektionen. Nekrotische Zellen sind durchlässig für Serumproteine, einschließlich Immunglobulin G (IgG). Die Enthüllung der Aufnahme von IgG durch Myofiber ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von Myofiberen, die einer Nekrose unabhängig von Muskelproblemen unterzogen werden.

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muskelbiopsien

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Vorbereitung von Rattengespinkeln für histochemische neuromuskuläre Studien.

Vorbereitung der Stimmlippe der Ratte für neuromuskuläre Analysen

Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass eine übermäßige Infiltration von Lipiden in der Skelettmuskulatur zu Lipotoxizität und Diabetes führt. Hier präsentieren wir ein vollständiges Protokoll, einschließlich Gewebeverarbeitung, Färbung mit Bodipy, Bildaufnahme und Analyse, um die Größe, Dichte und subzelluläre Verteilung von Lipidtröpfchen auf fasertypspezifische Weise zu quantifizieren.

Fasertyp- und subzellspezifische Analyse des Lipidtröpfchengehalts in der Skelettmuskulatur

Erfahren Sie die Herstellung von Muskel-Kryoschnitten für histologische Analysen. Diese Methode vermeidet Gefrierartefakte durch schnelles Einfrieren in Isopentan und optimales Einbetten. Sie ermöglicht präzise Untersuchungen von Muskelbiopsien.

Gebote und Verbote in der Herstellung von Muscle Kryoschnitte für die histologische Analyse

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