Gebote und Verbote in der Herstellung von Muscle Kryoschnitte für die histologische Analyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Fallstricke bei der Herstellung von Gefrierschnitten aus Muskelbiopsien zu vermeiden, beispielsweise die Entstehung von Gefrierartefakten. Dies wird erreicht, indem der Muskel zuerst rasch in zwei Methylbutan eingefroren wird, das mit flüssigem Stickstoff gekühlt wurde. Nachdem die Muskelbiopsien im Kryostat äquilibriert wurden, werden sie bei Raumtemperatur schrittweise in optimalem Schneidetemperatur-Medium eingebettet, wobei eine schnelle Einfrierung unter Verwendung von Aerosolkühlung und Wärmeentzug erfolgt.

Anschließend werden sieben Mikrometer dünne Schnitte angefertigt und auf warme, positiv geladene Objektträger übertragen. Der letzte Schritt besteht darin, die Gewebeschnitte nach Bedarf zu färben, um die Histologie des Gewebes zu beurteilen. Letztendlich führen korrekt präparierte Muskelbiopsien zu gut erhaltener Gewebehistologie ohne Gefrierartefakte.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen etablierten Methoden, wie der Schnittführung an paraffin-eingebettetem Gewebe, liegt daher in ihrer hohen Geschwindigkeit und darin, dass sie die Struktur und Funktion endogener Antigene nicht verändert. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Gesundheit und Krankheit in der Muskelbiologie zu beantworten, beispielsweise bezüglich Wachstum, Regeneration, Entzündung, Fibrose und Nekrose. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie oder Diagnose von Muskelerkrankungen, da sie die Beurteilung des Zustands von gesundem und krankem Muskelgewebe ermöglicht.

Obwohl diese Methode Einblicke in verschiedene Formen der Muskeldystrophie ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, wie beispielsweise die Cachexie im Endstadium von Krebs und AIDS sowie den Muskelschwund bei älteren Bevölkerungsgruppen. Beginnen Sie damit, eine Maus unter einem Abzug und in einer sekundären Sicherheitsstufe, beispielsweise einem Glockenkolben, durch eine Überdosis Isofluran zu euthanasieren. Bestätigen Sie den Tod des Tieres, indem Sie fest auf dessen Fußsohle drücken.

Nun befeuchten Sie das Fell mit 70 % Alkohol. Dies verhindert, dass lose Haare an den Muskeln haften. Fahren Sie fort, indem Sie die Haut mit einer feinen Pinzette der Größe fünf vom Gliedmaßenabschnitt ablösen.

Trennen Sie vorsichtig den Muskel von Interesse vom Knochen ausgehend vom Sehnenansatz. In diesem Fall wird der Musculus tibialis anterior isoliert. Nach der Entfernung des Muskels bedecken Sie ihn mit OCT und legen ihn flach auf eine beschriftete, wegwerfbare Gefriermatrix.

Weitere OCT-Medien werden später vor dem Schneiden hinzugefügt. Stellen Sie sicher, dass der Muskel in seiner normalen physiologischen Ausrichtung entlang der Kopf-Schwanz-Achse liegt und dass der Muskel nicht gedehnt ist. Kühlen Sie nun ab.

Einige Isopentan in einem Stahlbecher mit flüssigem Stickstoff. Rühren Sie gelegentlich drei bis fünf Minuten lang mit einem Plastikspatel um. Sobald sich ein weißer Niederschlag bildet, hat das Isopentan seine optimale Temperatur erreicht; zu diesem Zeitpunkt tauchen Sie die beladenen Formen in die Lösung ein.

Kleine Muskeln wie das Zwerchfell und der lange Fingerstrecker benötigen sechs bis zwölf Sekunden. Größere Muskeln benötigen 15 bis 20 Sekunden, wobei ein zu langes Einfrieren zu Rissen führen kann. Der nächste Schritt besteht darin, das gefrorene Gewebe auf Trockeneis zu legen, damit das restliche Isopentan verdunsten kann, was etwa 15 bis 20 Minuten dauert.

Sobald das Gewebe trocken ist, es schnell in Folie einwickeln und im Minus-80-Grad-Celsius-Gefrierschrank aufbewahren, bis es geschnitten werden kann. Vor dem Schneiden: die gefrorenen Gewebeproben unter Trockeneis zum Kryostaten transportieren.

Überführen Sie das Gewebe in eine Kryostatkammer, die auf minus 24 bis minus 20 Grad Celsius eingestellt ist, und lassen Sie es 30 Minuten lang akklimatisieren. Das Gewebe wird bei dieser Temperatur nicht vollständig auftauen. Als Nächstes wird das Gewebe zunächst eingebettet.

Falls verfügbar, aktivieren Sie die Peltier-Bay-Kühlung. Zweitens tragen Sie eine gleichmäßige dünne Schicht OCT auf die Probenscheibe auf und lassen Sie sie abkühlen. Drittens, sobald das OCT unten gefroren, aber oben noch flüssig ist, setzen Sie das Gewebe ein, richten es senkrecht zum OCT für Querschnitte und parallel zum OCT für Längsschnitte aus.

Verwenden Sie nun ein Aerosol-Kühlspray, um das OCT schnell einzufrieren. Berühren Sie anschließend den unversehrten Teil des Gewebes mit einem Wärmeabzug und halten Sie ihn 45 Sekunden lang am Gewebe fest. Lassen Sie den Muskel während dieses gesamten Vorgangs in keinem Schritt auftauen.

Falls der Kryostat nicht über eine Peltier-Bay-Kühlung verfügt, verwenden Sie Aerosolkühlung, um das OCT um das Gewebe herum schnell einzufrieren. Tragen Sie nun eine weitere dünne Schicht OCT um den Muskel auf, sprühen Sie erneut Aerosolkühlungsspray auf und leiten Sie die Wärme wie im vorherigen Schritt ab. Fügen Sie das OCT schrittweise in kleinen Mengen hinzu und frieren Sie es jeweils schnell mit einer Kombination aus Aerosolkühlungsspray und Wärmeableiter ein, bis der gesamte Muskel bedeckt ist.

Dann setzen Sie den Wärmeabzug auf die Oberseite des Gewebeprobenblocks und warten Sie fünf Minuten, bevor Sie mit dem Schneiden fortfahren. Die Probe ist nun bereit, am Probenträger befestigt zu werden. Zunächst drehen Sie den Knopf fest, um die Scheibe zu sichern.

Stellen Sie sicher, dass die Probenscheibe gut mit dem Probenträger in Kontakt steht, während die Kammer auf eine Temperatur zwischen minus 24 und minus 20 Grad Celsius abkühlt. Stellen Sie die Schnittdicke auf sieben Mikrometer ein, sobald die Kammer die Betriebstemperatur erreicht hat, und beginnen Sie, den Block zu beschneiden. Verwenden Sie die Grob- und Feineinstellung, um den Block zu bewegen.

Wenn die Schnitte zum Aufsammeln bereit sind, drücken Sie deren obere Seiten auf mit der Lampe erwärmte, positiv geladene Objektträger. Bei korrekter Einfrierung sollte die Gewebeseite mattweiß erscheinen. Ein Gewebe dagegen, das falsch eingefroren wurde oder während des Aufbringens aufgetaut ist, erscheint rot bis rosa.

Die Objektträger können zur späteren Analyse im Tiefkühler aufbewahrt werden. Der mittlere Bauchabschnitt des Gewebes kann identifiziert werden, indem die Querschnittsfläche anhand von Phasenkontrastbildern mithilfe der Konturverfolgungsfunktion einer Bildverarbeitungssoftware gemessen wird. Diese Analyse liefert sowohl die Flächen- als auch die Messung des minimalen Feret-Durchmessers.

Wenn diese Messungen beginnen, ein Plateau zu erreichen, ist der mittlere Bauchbereich erreicht. Obwohl Hersteller Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die meisten Färbeprotokolle bereitstellen, kann eine individuelle Optimierung erforderlich sein, um optimale Färbungsintensitäten zu erzielen. Das OCT muss nicht entfernt werden.

Verwenden Sie für die Färbung zur optimalen Immunfärbung eine befeuchtete Kammer. Diese sollte mit Perfil abgedeckt sein, auf einem nassen Papiertuch liegen und in einer kleinen Box versiegelt werden, um das Austrocknen der Schnitte zu vermeiden. Bei der Färbung von permanenten Präparaten ohne Immunfärbung dehydrieren Sie die Objektträger gemäß dem Färbeprotokoll durch aufsteigende Alkoholkonzentrationen.

Da Eindeckmedien mit Wasser nicht kompatibel ist, klären Sie die Objektträger mit einem fünfminütigen Bad in 100 % Xylol. Dadurch wird sichergestellt, dass die Objektträger im Laufe der Zeit nicht trüb werden. Fahren Sie anschließend mit dem Eindecken fort und nehmen Sie Bilder von Schnitten des mittleren Bauchbereichs des Musculus tibialis anterior auf, die gefärbt wurden.

Unter Verwendung von Hämatin und Eosin. Schnitte, die ordnungsgemäß verarbeitet wurden, weisen eine gleichmäßige Morphologie und eine homogene Färbung auf. Unzureichend verarbeitete Muskeln, die durch Einfrieren beschädigt oder vorzeitig aufgetaut wurden, zeigen dagegen multiple Brüche in der Morphologie und sehen zerkleinert aus.

Die Immunhistochemie wurde ebenfalls an diesen Schnitten durchgeführt. Diese Färbungen waren zufriedenstellend. Fibronectin ist grün gefärbt und DAPI erscheint in Blau.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie genau wissen, wie man einen guten Gefrierschnitt aus Muskelbiopsien zur Beurteilung der Muskelarchitektur herstellt. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in etwa vier bis fünf Stunden durchgeführt werden, sofern alle Schritte ordnungsgemäß ausgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, das Auftauen der Muskeln nach diesem Verfahren zu verhindern.

Andere Methoden wie Immundefärbung und Einblicke in die Hybridisierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich Wachstum und Regeneration zu beantworten.