Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender In-situ- Hybridization

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, versehentlich lokalisierte mRNAs in adulten Gehirnproben nachzuweisen. Dies wird durch Vorbehandlung erreicht. Die Proben werden durch Kochen und Proteaseverdau verdaut, um die mRNA-Moleküle zu demaskieren, in einem zweiten Schritt wird eine Hybridisierung durchgeführt, gefolgt von Amplifikations- und Detektionsschritten, die die Visualisierung der interessierenden mRNA ermöglichen.

Als nächstes werden Axone mit Antikörpern oder Farbstoffen gefärbt, um zu überprüfen, ob die interessierende mRNA an Axone lokalisiert ist. Die Ergebnisse zeigen das Vorhandensein einer TF vier mRNA in Gehirnproben unter Verwendung verschiedener Demaskierungsverfahren und Zähler, Färbemethoden, die auf mikroskopischen Analysen basieren. Diese Methode kann helfen, Fragen in den Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. welche mRNAs ohne Exons lokalisiert und translatiert werden.

Obwohl diese Methode Einblicke in die intrakonische Proteinsynthese geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Dendriten und nicht-neuronale Zellen und Gewebe angewendet werden, in denen die mRNA-Lokalisierung stattfindet. Nach dem Fixieren der Hirnschnitte gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll wird ein Copin-Glas mit 60 Millilitern Antigen-Retrieval-Lösung vorbereitet und die Objektträger in die Lösung getaucht. Füllen Sie anschließend einen Ein-Liter-Becher mit destilliertem Wasser und stellen Sie ihn in die Mikrowelle, um die Hitze zu puffern.

Stellen Sie beim Demaskieren das Coplan-Glas mit den Objektträgern und der Entnahmelösung in die Mikrowelle. Kochen Sie die Objektträger fünf Minuten lang bei hoher Leistung. Unmittelbar nachdem die Lösung aufgehört hat zu kochen, erhitzen Sie die Objektträger erneut fünf Minuten lang auf hoher Leistung.

Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur abkühlen Tauchen Sie die Objektträger nach dem Abkühlen in eine Schüssel mit PBS, um sie zu waschen, und wiederholen Sie dann den Waschgang zwei weitere Male. Legen Sie die Objektträger nach dem Waschen auf eine ebene Fläche und geben Sie zwei bis drei Tropfen oder 100 Mikroliter DAP B.Probe zu zwei oder drei Gehirnabschnitten als Kontrolle. Um die Hintergrundfärbung zu beurteilen, fügen Sie zwei bis drei Tropfen der Targeting-Sonde zu den experimentellen Abschnitten hinzu. Um die interessierende RNA zu detektieren, wird hier eine Sonde verwendet, die auf die Reste 20 bis 1381 einer TF-Vier-RNA der Maus abzielt. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Parameter über die Objektträger zu legen, um eine Verdunstung der Sonde zu vermeiden.

Legen Sie dann die Objektträger in die befeuchtete Objektträgerbox in den Hybridisierungsofen und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 40 Grad Celsius. Nach Ablauf der Inkubationszeit waschen Sie die Objektträger in einer Schüssel mit einem x Waschpuffer für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie als Nächstes zwei bis drei Tropfen Amplifikationsreagenz einen MP einen fl zu jedem Gehirnschnitt hinzu.

Dann mit frischer Para-Folie abdecken, in die Objektträgerbox legen und bei 40 Grad Celsius 15 Minuten im Hybridisierungsofen inkubieren. Nachdem Sie die Objektträger wie zuvor gewaschen haben, geben Sie zwei bis drei Tropfen Amplifikationsreagenz A MP vier fl auf jede Gehirnscheibe und bedecken Sie sie mit Perfil. Inkubieren Sie die Objektträger in der Objektträgerbox bei 40 Grad Celsius für 15 Minuten im Hybridisierungsofen.

Waschen Sie die Objektträger zweimal mit einem x Waschpuffer für jeweils zwei Minuten bei Raumtemperatur. Wie vor dem letzten Waschen jede Scheibe mit 100 bis 200 Mikrolitern Blockierungslösung bedecken, die drei Milligramm pro Milliliter BSA, 100 Millimolar Glycin und 0,25 % Triton X 100 in PBS enthält, jeden Objektträger mit Paraform bedecken und 30 Minuten lang inkubieren. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur 100 bis 200 Mikroliter Antikörper, verdünnt in Blockierungslösung, zu den Objektträgern hinzufügen. Hier kommt ein Anti-Cholin-Acetyltransferase-Antikörper zum Einsatz, nachdem die Objektträger zwei Tage lang bei vier Grad Celsius mit Perfil inkubiert wurden.

Stellen Sie sicher, dass die Gehirnschnitte bei Bedarf nicht austrocknen, tragen Sie 24 Stunden nach der Inkubation erneut Anti-CHATT-Antikörperlösung auf die Gehirnschnitte auf. Nach dem dreimaligen Waschen der Objektträger in einem XPBS für fünf Minuten. Geben Sie bei Raumtemperatur 100 bis 200 Mikroliter des entsprechenden Alexa-konjugierten Sekundärantikörpers zu den Objektträgern.

Mit Param abdecken und nach Ablauf der Stunde eine Stunde bei Raumtemperatur vor Licht geschützt inkubieren. Waschen Sie die Objektträger wie zuvor dreimal jeweils fünf Minuten lang in einem XPBS und waschen Sie sie dann einmal mit destilliertem Wasser. Montieren Sie die Objektträger mit Eindeckmedium mit DPI und visualisieren Sie dann die Hirnschnitte unter dem Fluoreszenzmikroskop.

Nach der Vorbereitung formaler und fixierter in Paraffin eingebetteter menschlicher Gehirnproben gemäß den Anweisungen im schriftlichen Teil des Protokolls führen Sie eine hitzeinduzierte Antigen-Demaskierung durch, indem die Objektträger in eine heiße Vorbehandlungslösung getaucht und 15 Minuten lang gekocht werden. Lassen Sie die Objektträger nach drei- bis fünfmaligem Waschen in destilliertem Wasser und drei- bis fünfmaligem Waschen in frischem 100%igem Ethanol fünf Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen, um eine Protease-induzierte Antigen-Demaskierung durchzuführen. Geben Sie vier Tropfen Vorbehandlung, drei mit Perfil bedeckt und inkubieren Sie 30 Minuten bei 40 Grad Celsius im Hybridisierungsofen, nachdem Sie drei- bis fünfmal in destilliertem Wasser gewaschen haben.

Fügen Sie wie zuvor vier Tropfen des DAP B-Sondensets hinzu, um Gehirnschnitte zur Beurteilung der Hintergrundfärbung zu kontrollieren, und vier Tropfen des Targeting-Sondensets zu den experimentellen Abschnitten. Legen Sie das Paar filmüberzogener Objektträger in die Objektträgerbox und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 40 Grad Celsius im Hybridisierungsofen. Nachdem Sie die Schritte im schriftlichen Protokoll zur Entwicklung des DAB-Signals für die interessierende mRNA befolgt haben, überprüfen Sie, ob unter einem Hellfeldmikroskop ein Signal vorhanden ist.

Definieren Sie Referenzbereiche in den Gehirnproben, in denen das Vorhandensein von Puncta während des gesamten Gegenfärbeverfahrens überwacht werden soll. Um Flecken entgegenzuwirken. Legen Sie die Objektträger zuerst in luxuriöses, auf 60 Grad Celsius vorgeheiztes Blau und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 60 Grad Celsius.

Spülen Sie die Objektträger nach der Inkubation mehrmals in destilliertem Wasser ab und tauchen Sie die Objektträger dann mehrmals in 0,05%ige Lithiumcarbonatlösung, um die Differenzierung zu starten. Tauchen Sie die Objektträger anschließend zweimal in frisches 75%iges Ethanol und spülen Sie sie in destilliertem Wasser ab. Überprüfen Sie die Gehirnschnitte unter einem Hellfeldmikroskop.

Beachten Sie, dass graue und weiße Substanz allmählich unterscheidbar sein sollten und RNA-Körnchen immer noch als dunkelblaue, schwarze Puncta sichtbar sind. Vergewissern Sie sich, dass Axone als hellblaue Fasern erscheinen, wiederholen Sie das Verfahren zur Färbung von Luxalblau, inkubieren Sie in Schritten von 10 bis 20 Minuten mit Luxalblau und überwachen Sie sorgfältig die Gegenfärbung und das Vorhandensein von RNA-Granulaten, wenn eine optimale Färbung erreicht wurde. Legen Sie die Spülobjektträger in krestale violette Lösung und inkubieren Sie sie nach der Inkubation 10 Minuten lang.

Spülen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser ab. Tauchen Sie die Objektträger fünf- bis zehnmal in 70 % Ethanol und trocknen Sie dann durch drei schnelle Wechsel von 100 % Ethanol in einem Abzug. Klare Gehirnschnitte, indem zweimal in Xylol inkubiert wird.

Alternativer Clearingagent für zwei Minuten und ein drittes Mal für fünf Minuten. Bei Raumtemperatur werden die Gehirnscheiben in ein permanentes Einbettmedium auf Xylolbasis eingelagert und unter einem Hellfeldmikroskop analysiert. Die Fischbehandlung wurde mittels Protease-induzierter Demaskierung durchgeführt, gefolgt von einem Antikörpernachweis der rot dargestellten Cholinacetyltransferase.

Der Antikörper erkannte Chat nicht, wenn eine Proteasebehandlung durchgeführt wurde. Beispiele für Ergebnisse, die mit einer Nicht-Zielsonde und einer TF-Sonde mit vier Zielen unter Verwendung der gleichen Mikroskopeinstellungen und Bildeinstellungen erzielt wurden, werden gezeigt. Grünes ATF vier positive Granulate mit unklarer axonaler Lokalisation sind mit Fragezeichen gekennzeichnet.

Blaue Bereiche sind feucht gefärbte Zellkerne, wenn Fisch mit hitzeinduziertem Antigen durchgeführt wurde. Die Demaskierung des Chat-Immunfluoreszenz-Färbemittels war erneut in Rot dargestellt. Ein TF vier positive Granulate, die an Axonen lokalisiert sind, erscheinen orange und sind als in Ordnung markiert, gefolgt von ish Axonen wurden mit Luxal gegengefärbt.

Fast Blue und neuronales SOTA wurden mit krestalem Violett suboptimal luxal gegengefärbt. Eine schnelle Blaufärbung kann die Folge sein, wenn die Temperatur gesenkt wird. Hier wurden die Proben vier Stunden lang bei 40 Grad Celsius mit luxuriösem Fast Blue gefärbt.

Ein TF vier positive Granulate mit unklarer zufälliger Lokalisation sind mit Fragezeichen gekennzeichnet. Eine suboptimale Färbung tritt auch auf, wenn die Intensität der Gegenfärbung nach kurzen Inkubationszeiten nicht überprüft wird, wie hier zu sehen. Beispiele für eine optimale LFB-Färbung in Kombination mit ish unter Verwendung einer Nicht-Target-Sonde oder einer TF-Vier-Targeting-Sonde sind hier dargestellt.

Die Bildaufnahme wurde automatisch angepasst, um das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen. Axon lokalisiert ein TF vier Granulate sind als okay markiert. Einmal gemeistert.

Diese Technik kann in ein bis drei Tagen durchgeführt werden, abhängig von der gewählten Gegenfärbemethode Nach der Entwicklung. Diese Technik ebnet Neurowissenschaftlern die Möglichkeit, die mRNA-Translation und -Lokalisierung nuanciert zu erforschen.