Name: Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender In-situ- Hybridization (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Erfahren Sie, wie In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie zur Visualisierung axonaler mRNAs in Maus- und menschlichem Gehirngewebe eingesetzt werden. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in die Genexpression in der Neuroforschung.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der Alzheimer's Association (NIRG-10-171721; an U.H.), dem National Institute of Mental Health (MH096702; an U.H.), dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; an C.M.T.) und Pilotstudienpreisen des vom National Institute on Aging finanzierten Alzheimer's Disease Research Center an der Columbia University (AG008702; an J.B. und Y.Y.J.), das auch die New York Brain Bank unterstützt. Wir danken den Mitgliedern des Labors Hengst für die Kommentare und Diskussionen

Alle tierischen Verfahren wurden durch die IACUC der Columbia University und der geltenden Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt wurden befolgt. Hinweis: Bereiten Sie alle für die ISH Verfahren in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser verwendeten Puffer. Diese Empfehlung ist nicht unbedingt notwendig, nachdem ISH abgeschlossen ist, aber es wird vorgeschlagen, dass Puffer noch in autoklaviertem bidestilliertem Wasser hergestellt und / oder durch Filtern sterilisiert. 1. Nachweis der ATF4 mRNA lokalisiert Cholinerge Axone im Gehirn erwachsener Mäuse mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) durch Immunhistochemie Gefolgt <ol><li> Probenvorbereitung für die Para fixierten gefrorenen Hirnschnitten <ol><li> Für das folgende Beispiel, bereiten Scheiben von festen gefrorenen Gehirn der Maus. <ol><li> Kurz gesagt, zu opfern, 9 Monate alten Mäusen durch Anästhesie mit Ketamin (100 mg kg -1 Körpergewicht) und Xylazin (10 mg kg -1 Körper weigHT) von transkardialer Infusion von 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7,4) folgte. </li><li> Gehirne und post-fix in 4% Paraformaldehyd zu entfernen für 24 Stunden bei 4 o C </li><li> Nach der Fixierung, Waschen Proben dreimal in PBS und in 30% cryoprotect Saccharose in PBS (pH 7,4) für 24 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Betten Sie Gehirne in OCT Einfrieren Verbindung, seriell Schnitt bei 20 &amp; mgr; m auf einem Kryostaten und montieren auf Poly-D-Lysin behandelten Objektträgern. Halten Hirnschnitten bei -20 o C bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Entfernen Parafesthirnschnitten aus dem Gefrierschrank und der Luft trocknen für 30 min bei RT. </li><li> Dreimal mit 1x PBS waschen. </li><li> In einer Abzugshaube, Re-fix Hirnschnitten 20 min mit 4% Paraformaldehyd bei RT. HINWEIS: ACHTUNG: 4% Paraformaldehyd ist giftig und muss behandelt und entsorgt werden entsprechend folgenden Sicherheitsprotokolle. </li><li> Dreimal mit 1x PBS waschen. </li><li> Entwässern Hirnschnitten. <ol><li> Vorbereitung 50%, 75% und 100%Ethanollösungen. </li><li> Einzutauchen Folien in 50% Ethanol für 5 Minuten bei RT. </li><li> Einzutauchen Folien in 75% Ethanol für 5 Minuten bei RT. </li><li> Einzutauchen gleitet in 100% Ethanol für 5 Minuten bei RT. </li><li> Einzutauchen Folien in frischem 100% Ethanol für 5 Minuten bei RT. Hinweis: Alternativ können Folien in 100% Ethanol bei -20 ° C bis zu 1 Monat gelagert werden. </li></ol></li></ol></li><li> FISH-Test, gefolgt von Immunhistochemie unter Verwendung von Hitze-induzierte Antigen / RNA Demaskierung <ol><li> Vor dem Start bereiten alle erforderlichen Material: <ol><li> Erhitzen Sie das Hybridisierungsofen bis 40 o C und legen Sie eine Schale mit destilliertem Wasser in den Ofen, um eine feuchte Umgebung schaffen. </li><li> Nehmen Sie eine Dia-Box und stellen Sie Papierhandtücher in destilliertem Wasser eingeweicht den Schiebekasten innen zu befeuchten. Legen Sie das Dia-Box in der Hybridisierungsofen. </li><li> Sonden (sowohl negative als auch Zielsonden) Entfernen von Kühlschrank und erwärmen diese im Hybridisierungsofen für 10 min. Lassen Sie die Proben abkühlen down bei RT. </li><li> Äquilibrieren Amplifikationsreagenzien AMP 1-4 (in der Leuchtstoff Multiplex-Reagenz-Kit enthalten) bei RT. </li><li> Bereiten Antigen-Retrieval-Lösung: 10 mM Natriumcitrat (pH 6), 0,05% Tween 20 Hinweis: Lösung kann bei RT auf unbestimmte Zeit gespeichert und für zukünftige Färbung verwendet werden. </li><li> Bereiten 1x Waschpuffer Verdünnen der 50x-Stammlösung (in der Leuchtstoff Multiplex-Reagenz-Kit enthalten) in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser. HINWEIS: 1x Waschpuffer kann bei RT für 1 Monat gelagert werden und für zukünftige Färbung verwendet werden. 50x Waschpuffer könnte auszufällen. Wenn ja, Wärme 50x Waschpuffer bei 40 ° C für 10 Minuten vor der Herstellung der Lösung, 1x. </li></ol></li><li> Folien aus 100% Ethanol und Luft trocknen entfernen 5 min bei RT. </li><li> Bereiten Sie eine Coplin-Gefäß mit 50 ml Antigen-Retrieval-Lösung. Tauchen Sie Folien in Antigen-Retrieval-Lösung und kochen Sie sie für 10 Minuten in einem Mikrowellenofen. HINWEIS: Alternativ Ort horizontal gleitet in einer 100 mmDurchmesser runde Glasschale, die 100 ml Retrieval-Lösung. <ol><li> Füllen Sie ein 1 L Becherglas mit destilliertem Wasser und legen Sie sie in der Mikrowelle. HINWEIS: Das Wasser wird &quot;Puffer&quot; die Hitze bei der Durchführung Entlarvung. </li><li> Objektträger in Antigen-Retrieval-Lösung in der Mikrowelle. Boil gleitet bei hoher Leistung für 5 Minuten. Unmittelbar nach Proben gestoppt Kochen, gleitet Wärme wieder bei hoher Leistung für zusätzliche 5 min. </li><li> Cool down Folien bei RT. HINWEIS: kritischer Schritt: siedendem Dauer und Verfahren ist vom Anwender festgelegt werden, abhängig von den Mikrowelleneigenschaften. Je schneller das Kochen beginnt desto höher die Chancen der Lösung Verdunstung. In diesem Fall empfiehlt es sich, dass die Proben für kürzere Zeiträume mehr als zweimal, um eine Gesamt Demaskierung von 10 min abgeschlossen gekocht. Im Gegenteil, wenn der Heizbetrieb mit mittlerer oder niedriger Leistung durchgeführt wird, Demaskierung kann einmal für 10 min durchgeführt werden. Allerdings, wenn Proben nicht kochen continuously für eine Gesamtmenge von etwa 10 min wird diese in Teil Demaskierung sowohl der Ziel-RNA und Protein führen zu detektieren. </li></ol></li><li> Wash gleitet dreimal mit 1x PBS. </li><li> In 2 - 3 Tropfen (~ 100 &amp; mgr; l) des dapB-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet werden, um Hintergrundfärbung zu bewerten gesetzt. Hinweis: Das dapB Sondensatz richtet sich an ein bakterielles Gen und sollte keine Säugetier-RNA zu erkennen. </li><li> Fügen Sie 2-3 Tropfen der Targeting-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet, um die RNA von Interesse erkennen gesetzt. Hinweis: ein Sondensatz Targeting-Reste 20 - 1381 der Maus ATF4 mRNA wird in diesem Beispiel verwendet. </li><li> Deckgläser mit Parafilm zu Sonde Verdunstung zu vermeiden, legen Sie sie in der befeuchteten Objektträger Box in der Hybridisierungsofen inkubieren sie bei 40 ° C für 2 Stunden. HINWEIS: Optional: zusätzliche Hirnschnitten mit einem Sondensatz Targeting Maus Polr2A hybridisiert und als positive Kontrollen verwendet werden. </li><li> Wash slides zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 1-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 2-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 3-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 4-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in dieDia-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT und zweimal mit 1 × PBS. </li><li> Hinzuzufügen 100-200 ul (oder genügend Volumen, um vollständig zu bedecken Slices) einer Blockierlösung, die 3 mg / ml BSA, 100 mM Glycin und 0,25% Triton X-100 in PBS (pH 7,4) auf die Objektträger, bedecken sie mit Parafilm und Inkubation für 30 min bei RT. </li><li> In 100 bis 200 &amp; mgr; l Anti-ChAT-Antikörper in Blockierungslösung (1/100) auf die Objektträger verdünnt, decken Sie sie mit Parafilm und Inkubation für 2 Tage bei 4 o C Stellen Sie sicher, dass Hirnschnitten nicht austrocknen. Falls erforderlich, erneut bewerben anti-ChAT-Antikörperlösung zu Hirnschnitten von 24 Stunden nach der Inkubation. </li><li> Wasch gleitet dreimal in 1x PBS für 5 min bei RT. </li><li> In 100 bis 200 &amp; mgr; l der geeigneten Alexa-konjugierten Sekundärantikörper (. ZB Alexa-594 Esel anti-Ziege für dieses spezielle Beispiel) auf die Objektträger, Deckel mit Parafilm und Incubaß für 1 h bei RT. </li><li> Wasch gleitet dreimal in 1x PBS für 5 min bei RT. </li><li> Wash gleitet einmal mit destilliertem Wasser. </li><li> Berg Träger mit DAPI haltigen Eindeckmedium. </li><li> Visualisieren Hirnschnitten unter dem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol></li></ol> 2. Nachweis von ATF4 mRNA lokalisiert, um Axone in Human Brain Proben unter Verwendung chromogener in situ Hybridisierung (CISH) von Luxol Fast Blue und Kresylviolett Gegenfärbung Gefolgt <ol><li> Probenvorbereitung für die Formalin-fixierten, in Paraffin eingebettete menschliche Gehirnproben <ol><li> Bake Scheiben in einem Trockenofen bei 60 ° C für 1 Stunde. </li><li> Entparaffinieren Hirnschnitten in einem Abzug. HINWEIS: ACHTUNG: Reagenzien sind giftig und müssen behandelt werden und verworfen folgenden die entsprechenden Sicherheitsrichtlinien <ol><li> Tauchen Sie Folien in Xylol alternativen Clearingstelle, zweimal für 10 min. </li><li> Einzutauchen gleitet in 100% Ethanol zweimal für 1 min. </li><li> EINir-trockenen Scheiben 5 min bei RT. Hinweis: Alternativ können Proben bei Raumtemperatur getrocknet werden, O / N, sondern muss innerhalb von 24 Stunden verwendet werden. </li></ol></li></ol></li><li> Diaminobenzidin (DAB) -basierte chromogenen ISH Assay gefolgt von Luxol schnell blau und Kresylviolett Fleck mit wärmeinduzierten und Protease-induzierte RNA Demaskierung <ol><li> Vor Beginn der Vorbereitung benötigte Materialien: <ol><li> Erhitzen Sie das Hybridisierungsofen bis 40 o C und setzen Sie ein Fach destilliertes Wasser, das um eine feuchte Umgebung schaffen. </li><li> Nehmen Sie eine Dia-Box und stellen Sie Papierhandtücher in destilliertem Wasser eingeweicht den Schiebekasten innen zu befeuchten. Legen Sie das Dia-Box in der Hybridisierungsofen. </li><li> Bereiten 1x vorbehandeln 2 durch Verdünnen der 10x-Stammlösung (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser. Wenn Vorbehandlung auf einer heißen Platte durchgeführt wird, werden 100 ml Vorbehandlung Lösung zu einem Durchmesser von 100 mm Glasschale, um die Kontaktfläche zwischen der Schüssel und der heißen Platte zu erhöhen (falls Vorbehandlungin der Mikrowelle durchgeführt wird, kann ein Coplin-Gefäß statt dessen verwendet werden, wie in 1.2.3 angegeben). Wärme Lösung auf 100 o C und halten Sie sie koch nicht länger als 30 Minuten vor dem Untertauchen Proben. </li><li> Wärme negativen und positiven Proben 10 min bei 40 ° C und Abkühlen auf RT. </li><li> Äquilibrieren Amplifikationsreagenzien AMP 1-6 (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) bei RT. </li><li> Bereiten 1x Waschpuffer Verdünnen der 50x-Stammlösung (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) in destilliertem Wasser. Hinweis: 1x Waschpuffer kann bei RT für 1 Monat gelagert werden und für zukünftige Färbung verwendet werden. </li></ol></li><li> In ~ 4 Tropfen (~ 120 &amp; mgr; l) von 1 vorbehandeln zu jeder Hirnschnitt, Deckel mit Parafilm und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> 3 bis 5 mal in frischem destilliertem Wasser waschen. </li><li> Führen wärmeinduzierten Demaskierung: <ol><li> Objektträger, um heiße vorbehandeln 2 (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) Lösung und kochen für 15 Minuten. Hinweis: Boiling können auf einer heißen Platte Gewährleistung durchgeführt werdenkontinuierliche Kochen oder in der Mikrowelle folgenden kritischen Schritte in 1.2.3 angegeben). </li></ol></li><li> Dias zu destilliertem Wasser sofort übertragen und waschen 3 bis 5 mal. </li><li> Wasch gleitet 3 bis 5 mal mit frischem 100% Ethanol. </li><li> Luft trocknen Scheiben 5 min bei RT. Hinweis: Alternativ Scheiben getrocknet werden O / N. </li><li> Führen Sie Protease-induzierte Demaskierung: <ol><li> 4 Tropfen vorbehandeln 3 (in der CISH-Reagenz-Kit im Lieferumfang enthalten), Deckel mit Parafilm und Inkubation 30 min bei 40 o C im Hybridisierungsofen. </li></ol></li><li> Wash gleitet 3 bis 5 mal in frischem destilliertem Wasser. </li><li> 4 Tropfen des dapB-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet werden, um Hintergrundfärbung zu bewerten gesetzt. </li><li> 4 Tropfen des Targeting-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet, um die RNA von Interesse erkennen gesetzt. Hinweis: eine Sondensatz Targeting-Reste 15 - 1256 des menschlichen ATF4 mRNA wird in diesem Beispiel verwendet. OPTIONAL: zusätzliche Hirnschnitten können hyb seinmit einer Sonde, Satz gegen Menschen PPIB ridized und als positive Kontrollen verwendet. </li><li> Die Objektträger in der Folie Box und Inkubation für 2 Stunden. bei 40 o C im Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 1 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 2 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 3 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x warH-Puffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 4 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 5 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm und Inkubation 30 min bei RT. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 6-Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm und Inkubation 15 min bei RT. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> Mix gleichen Volumen BROWN BROWN-1 und-2-Reagenzien (in der CISH-Reagenz-Kit im Lieferumfang enthalten), fügen ~ 120 &amp; mgr; l-Lösung in jede Hirnschnitt, Deckel mit Parafilm und Inkubation 10 min bei RT. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT und einmal in destilliertem Wasser spülen. HINWEIS: kritische Schritte: die folgenden Schritte sind entscheidend für dieeine optimale axonalen Gegenfärbung zu erhalten, ohne Maskierung der Anwesenheit von RNA-Granulat. </li><li> Vor der Durchführung Gegenfärbung das Vorhandensein von mRNA von Interesse unter einem Hellfeldmikroskop überprüfen. Bestimmung von Referenzflächen in den Gehirnproben, in denen das Vorhandensein von puncta gesamten Kontrastfärbungsverfahren zu überwachen. </li><li> Vorheizen Luxol schnelle Blau-Lösung bei 60 o C. </li><li> Die Objektträger in Luxol schnell blau und Inkubation 30 min bei 60 o C. </li><li> Spülen Sie mehrmals in destilliertem Wasser. </li><li> Dip Slides mehrfach in 0,05% Lithiumcarbonat-Lösung, um die Differenzierung zu starten. </li><li> Dip Slides zweimal in frischem 75% Ethanol. </li><li> Spülen in destilliertem Wasser. </li><li> Überprüfen Hirnschnitten unter einem Hellfeldmikroskop. Beachten Sie, dass grauer und weißer Substanz beginnen sollte, zu unterscheiden und RNA-Granulat noch als dunkelblau / schwarz puncta sichtbar sein. Überprüfen Sie, dass Axone beginnen, wie hellblau Fasern erscheinen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.28 bis 2.2.32. Perform Inkubationen mit Luxol Fast Blue-Lösung in 10 bis 20 min Schritten sorgfältige Überwachung der Gegenfärbung und die Anwesenheit von RNA Granulate. Hinweis: In der Regel wird eine optimale Gegenfärbung in 60 erworben - 90 min (Gesamt Inkubationszeit), aber die Zeit kann verkürzt werden, wenn der Verdacht besteht, dass RNA-Granulat kann durch die Luxol schnell Bläue (siehe Abbildung 2 für Beispiele) maskiert werden kann. </li><li> Folien Kresylviolett Lösung inkubieren für 10 min bei RT. </li><li> Spülen Sie gleitet in destilliertem Wasser. </li><li> Dip Schlitten 5 bis 10 mal in 70% Ethanol. </li><li> Entwässern Hirnschnitten bis 3 schnelle Änderungen von 100% Ethanol. </li><li> In einer Abzugshaube, klar Hirnschnitten durch Inkubation zweimal in Xylol alternative Clearingstelle für 2 min und ein drittes Mal für 5 Minuten bei RT. </li><li> Berg Hirnschnitten in Xylol-basierte permanentes Fixiermittel. </li><li> Analysieren Sie die Proben unter einem Hellfeldmikroskop. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In diesem Bericht beschreiben wir die Verwendung eines hochauflösenden ISH Technologie bei der Erkennung von axonally lokalisiert ATF4 mRNA. Diese und frühere veröffentlichte Studien zeigen, dass diese Technik mit Antikörper-basierte Proteinnachweis in Geweben oder sogar ganzen Embryonen 33 kompatibel. Wichtiger ist, es wurde kürzlich zur Detektion von mRNA im Arc Dendriten der hippocampalen Neuronen 34 eingesetzt. Es kann auch mit histologischen Farbstoffe zur Gewebefärbung kombi...

Axonalen mRNA Rekrutierung und lokale Übersetzung ermöglichen Axone auf extrazelluläre Reize in einem zeitlich und räumlich akuten Weise 1 reagieren. Intra-axonale Proteinsynthese wird am besten im Zusammenhang mit der Entwicklung des Nervensystems, wo sie eine entscheidende Rolle bei Wachstumskegel Verhalten 2-8 spielt verstanden Axon Pathfinding 9-11 und retrograde Signalisierungs 12,13. Aber weit weniger ist über die funktionelle Bedeutung der axonalen Proteinsynthese in post-Entwicklungs Neuronen bekannt sind, wenn axonalen mRNA und Ribosom Niveaus stark verringert 14,15. Mature Wirbel Axone haben lange geglaubt, translational inaktiv 16 zu sein. Die jüngsten Studien zeigen, dass lokale Übersetzung wird in reifen Axone unter pathologischen Bedingungen reaktiviert. Zum Beispiel wird eine Untergruppe von mRNAs zu regenerierenden Axonen nach einer Nervenverletzung und intra axonalen Proteinsynthese ist für die korrekte Regeneration dieser Axone 17 erforderlich rekrutiert. Darüber hinaus unsere Gruppe has gezeigt, dass bestimmte mRNAs sind Axone rekrutiert, nachdem lokale Engagement in der Alzheimer-Krankheit Aß-Peptid 1-42, und lokale Übersetzung des Transkriptionsfaktors ATF4 ist verpflichtet, die neurodegenerative Effekte von Aß 1-42 von Axonen zu der neuronalen Soma 18 propagieren. Schließlich Hochdurchsatz-Analysen haben ergeben, dass reife Axone haben ein komplexer und dynamischer als erwartet Transkriptom 18-21, vor allem unter pathologischen Bedingungen. Im Lichte dieser Untersuchungen wurde ein hochempfindliche und spezifische Methode zum Nachweis axonally lokalisierte mRNAs im adulten Nervensystem erforderlich ist. Ein Großteil der Arbeit an mRNA Rekrutierung und lokale Übersetzung in reifen Axone wurde an kultivierten Neuronen durchgeführt. Dies gilt vor allem für die Transkriptom-Analysen, da spezialisierte Kultivierungsverfahren bestehen, dass die Isolierung der Axone von der somato-dendritischen Raum 18-20 ermöglichen. Obwohl solche Studien haben wertvolle Ins gegebenight in die Rolle des lokalen Übersetzung in reifen Axone, die Frage, ob kultivierten Neuronen glaubwürdig die Situation in vivo oder mRNA Rekrutierung ist eine adaptive Reaktion von Axonen zu Kultivierungsbedingungen ist noch offen. Nur wenige Studien haben Hinweise auf mRNA Anwerbung für den Axonen in vivo fällig gestellt. Zum Beispiel hat das Transkript der olfaktorischen Markerprotein in Axonen bei erwachsenen sensorischen Neuronen 22 erfasst wurde. Ein Transgen, das die 3&#39;-UTR von β-Actin mRNA Axonen in den peripheren und zentralen Nervensystems Neuronen in Mäusen transportiert und vor Ort nach dem Entwicklungsperioden 23 übersetzt. Lamin B2 mRNA an retinalen Axonen lokalisiert in Xenopues laevis Kaulquappen und seine Erschöpfung wirkt Axon Wartung nach axonalen Entwicklung 21. Störung des axonalen Transport der mRNA-Codierung für Cytochrom C Oxidase IV verändert Mausverhalten 24. Schließlich wird ATF4 mRNA in ein erwachsener gefundenXON-Fluß von Mäusen und menschlichen Gehirnen im Rahmen von Aß 1-42 induzierte Neurodegeneration 18. Hochdurchsatz-Transkriptom Analysen haben sich als nützlich zu sein, um mRNA-Profilen in isolierten Axone in vitro zu identifizieren, sondern haben ihre Grenzen für die in-vivo-Studien, da im ganzen Gewebe Axone sind nie isoliert gefunden, aber mit neuronalen Zellkörpern, Gliazellen und anderen Zelltypen vermischt. Folglich müssen derartige Analysen mit bildgebenden Verfahren, die die subzelluläre Lokalisation von mRNAs bestätigen kombiniert werden. RNA in situ-Hybridisierung (RNA-ISH) erlaubt die Detektion und Darstellung von spezifischen RNA-Sequenzen, die in Zellen und Geweben. Jedoch waren ursprünglichen RNA ISH Assays nur für die Identifizierung von zahlreicheren RNAs 25, was selten der Fall axonally lokalisierten mRNAs geeignet. In den letzten Jahrzehnten zunehmenden Bemühungen in die Entwicklung neuer Technologien, die den Nachweis der mRNAs ermöglichen an der Einzelmolekülebene gesetzt <sup&gt; 25,26. Zum Beispiel haben Singer und Kollegen ISH Sonden entwickelt, um mRNAs in Einzelzellen zu erfassen, die aus in 5 nicht überlappenden Fluoreszenz-markierten 50-mers (Details siehe 27). Der Hauptunterschied zwischen den oben genannten Techniken und das hier beschrieben wird, ist, daß die später verwendet 20 Doppel Z-Struktur (nicht linear) Sonden, die typischerweise Ziel ~ 1 kb Region der RNA von Interesse sicherzustellen Spezifität und geringem Hintergrundniveaus. Sonden werden dann mit Vorverstärker und Verstärker-Sequenzen, die schließlich fluoreszenzmarkierte oder mit Enzymen, die chromogene Reaktionen ermöglichen konjugiert hybridisiert. Diese Amplifikationsschritte Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu anderen Technologien ISH 28. Hier beschreiben wir zwei Protokolle mit RNAscope kombiniert entweder mit Fluoreszenz Immunzytochemie oder histologische Farbstoffe ermöglicht axonalen Gegenfärbung. Beide Protokolle sind geeignet zur axonalen Lokalisierung ATF4 mRNA in der Erwachsenen mo visualisierenverwenden und das menschliche Gehirn.

<table><tbody><tr><td>benutzerdefinierte Sonde für die Reste 20-1.381 der Maus-mRNA Atf4 (NM_009716)</td><td>Advanced Cell</td> <td>Diagnostics-Sonde</td><td></td></tr> <tr><td>für die Reste 15-1.256 der menschlichen ATF4 mRNA (NM_001675.2)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Negativkontrollsonde - DapB</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310043</td><td>Sonde</td></tr><tr><td>Positivkontrollsonde und Maus Polr2A (optional)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>312471</td><td>Sonde</td></tr><tr><td>Positivkontrollsonde für humanes PPIB (optional)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>313901</td><td>Sonde</td></tr><tr><td>RNAscope Fluoreszierendes Multiplex-Reagenzkit (für Fluoreszenzdetektion)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320850</td><td>in situHybridisierungskit</td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 HD Reagenzien-Kit - BRAUN (für den chromogenen Nachweis)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310035</td><td>in situ Hybridisierungskit</td></tr><tr><td>Ziegen-Polyklonaler Anti-ChAT-Antikörper</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit</td><td>American MasterTech</td><td>KTLFB</td><td></td></tr><tr><td>Clearify-Clearingmittel (Xylol-Ersatz)</td><td>American MasterTech</td><td>CACLEGAL</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>DPX Eindeckmedium</td><td>Sigma</td><td>6522</td><td></td></tr></tbody></table>

nachweis von axonally lokalisierten mrnas in gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; in-situ-</em&gt; hybridization

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs werden häufig Wirbel Axonen lokalisiert und ihre lokalen Übersetzung für Axon Wegfindung oder Verzweigung während der Entwicklung und für die Wartung, Reparatur oder Neurodegeneration in postdevelopmental Zeiten erforderlich. Hochdurchsatz-Analysen haben kürzlich ergeben, dass Axone haben ein dynamischer und komplexer Transkriptom als bisher erwartet. Diese Analyse jedoch wurde meist in kultivierten Neuronen, wo Axone aus den somato-dendritischen Fächern isoliert werden getan. Es ist praktisch unmöglich, eine solche Isolation in ganze Gewebe in vivo zu erreichen. So um die Rekrutierung von mRNAs und ihre funktionelle Relevanz in einem ganzen Tier überprüfen, Transkriptom Analysen sollten im Idealfall mit Techniken, die die Visualisierung von mRNAs in situ ermöglichen kombiniert werden. In jüngster Zeit neuartige ISH Technologien, die RNAs in einer Einzelmolekülebene zu erfassen, wurden entwickelt. Dies ist besonders wichtig bei der Analyse der subzellulären Lokalisierung von mRNADa lokalisierten RNAs werden in der Regel in geringen Mengen gefunden. Hier beschreiben wir zwei Protokolle zur Detektion axonally lokalisierte mRNAs unter Verwendung eines neuen hochempfindlichen RNA ISH Technologie. Wir haben RNAscope ISH mit axonalen Gegenfärbung in Kombination mit Fluoreszenz Immunhistochemie oder histologische Farbstoffe, um die Rekrutierung von ATF4 mRNA um Axone in vivo in der reifen Maus und menschliche Gehirne zu überprüfen.

Eine kurze Zusammenfassung der oben beschriebenen Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt. Optimale Erkennung von ATF4 mRNA Granulat in cholinergischen Axonen mit wärmeinduzierten Demaskierung Bei der Beurteilung axonale Lokalisation mRNAs ist es kritisch, in der Lage, die Axone zu identifizieren und um niedrige reichlich RNAs zu visualisieren. Die hier beschriebene RNA ISH Technologie ermöglicht die Erkennung von RNAs in einer Einzelmo...

RNA in situ Hybridisierung (ISH) ermöglicht die Visualisierung von RNAs in Zellen und Geweben. Hier zeigen wir, wie die Kombination von RNAscope ISH mit immunhistochemischer oder histologischer Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden kann, um mRNAs, die an Axonen lokalisiert sind, in Schnitten des Gehirns von Mäusen und Menschen zu detektieren.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, zufällig lokalisierte mRNAs in adulten Gehirnproben nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem die Proben in einem ersten Schritt durch Kochen und Proteaseverdau vorbehandelt werden, um die mRNA-Moleküle freizulegen. Im zweiten Schritt erfolgt die Hybridisierung, gefolgt von Amplifikations- und Detektionsschritten, die die Visualisierung der gewünschten mRNA ermöglichen.Anschließend werden Axone mit Antikörpern oder Farbstoffen gefärbt, um zu überprüfen, ob die mRNA des Interesses in Axonen lokalisiert ist. Die Ergebnisse zeigen das Vorhandensein einer TF-vier-mRNA in Gehirnproben unter Verwendung verschiedener Enthüllungsverfahren und Gegenfärbungen sowie mikroskopiebasierten Färbemethoden. Diese Methode kann helfen, Fragen in der Neurowissenschaft zu beantworten, beispielsweise welche mRNAs lokalisiert und in Abwesenheit von Exons translatiert werden.Obwohl diese Methode Einblicke in die intrakonale Proteinsynthese ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, wie beispielsweise Dendriten und nicht-neuronale Zellen sowie Gewebe, in denen eine mRNA-Lokalisierung stattfindet. Nachdem die Gehirnschnitte gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll fixiert wurden, bereiten Sie ein Copin-Gefäß mit 60 Milliliter Antigen-Retrieval-Lösung vor und tauchen Sie die Objektträger in die Lösung ein. Füllen Sie anschließend einen ein-Liter-Becher mit destilliertem Wasser und stellen Sie ihn in die Mikrowelle, um die Wärme zu puffern.Beim Entriegeln den Coplan-Becher mit den Objektträgern und der Rückgewinnungslösung in die Mikrowelle stellen. Die Objektträger fünf Minuten lang bei hoher Leistung zum Kochen bringen. Unmittelbar nachdem die Lösung aufgehört hat zu kochen, die Objektträger erneut fünf Minuten lang bei hoher Leistung erhitzen.Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur abkühlen. Nach dem Abkühlen tauchen Sie die Objektträger in eine Schale mit PBS ein, um sie zu waschen, und wiederholen Sie den Waschschritt noch zweimal. Nach dem Waschen legen Sie die Objektträger auf eine ebene Fläche und geben zwei bis drei Tropfen oder 100 Mikroliter DAP B. Probe auf zwei oder drei Gehirnschnitte als Kontrolle. Um die Hintergrundfärbung zu beurteilen, geben Sie zwei bis drei Tropfen der Targeting-Probe auf die experimentellen Schnitte. Um die gewünschte RNA nachzuweisen, wird hier eine Probe verwendet, die gegen die Reste 20 bis 1381 der Maus a TF four RNA gerichtet ist. Benutzen Sie eine Pinzette, um Parafilm über die Objektträger zu legen, um eine Verdunstung der Probe zu verhindern.Danach die Objektträger in die befeuchtete Objektträgerbox im Hybridisierungsbrutschrank stellen und zwei Stunden bei 40 Grad Celsius inkubieren. Nach Ablauf der Inkubationszeit die Objektträger in einer Schale zwei Minuten bei Raumtemperatur mit einem x Waschpuffer waschen. Anschließend zwei bis drei Tropfen Verstärkungsreagenz a MP one fl auf jeden Gehirnschnitt geben.Dann mit frischer Parafilmfolie abdecken, in die Objektkästen legen und 15 Minuten bei 40 Grad Celsius im Hybridisierofen inkubieren. Nach dem Waschen der Objektträger wie zuvor, zwei bis drei Tropfen Verstärkungsreagenz A MP vier fl zu jedem Gehirnschnitt geben und mit Perfil abdecken. Die Objektträger im Objektkasten 15 Minuten bei 40 Grad Celsius im Hybridisierofen inkubieren.Die Objektträger zweimal mit einem x Waschpuffer je zwei Minuten bei Raumtemperatur waschen. Wie zuvor nach dem letzten Waschgang jede Probe mit 100 bis 200 Mikrolitern Blockierungslösung bedecken, die 3 Milligramm pro Milliliter BSA, 100 Millimolar Glycin und 0,25 % Triton X-100 in PBS enthält, jeden Objektträger mit Parafilm abdecken und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation 100 bis 200 Mikroliter Antikörper, verdünnt in Blockierungslösung, auf die Objektträger geben. Hier wird ein Anti-Cholinacetyltransferase-Antikörper verwendet; nachdem die Objektträger mit Parafilm abgedeckt wurden, zwei Tage bei vier Grad Celsius inkubieren.Stellen Sie sicher, dass die Gehirnschnitte nicht austrocknen; falls nötig, tragen Sie 24 Stunden nach der Inkubation erneut die Anti-CHATT-Antikörperlösung auf die Gehirnschnitte auf. Nach dreimaligem Waschen der Objektträger in 1× PBS jeweils fünf Minuten lang geben Sie bei Raumtemperatur 100 bis 200 µL des geeigneten mit Alexa markierten sekundären Antikörpers auf die Objektträger. Abdecken mit Param und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, dabei vor Licht schützen. Nach Ablauf der Stunde die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in 1× PBS waschen, wie zuvor, und anschließend einmal mit destilliertem Wasser. Die Objektträger mit Eindeckmedium, das DPI enthält, eindecken und dann die Gehirnschnitte unter dem Fluoreszenzmikroskop visualisieren.Nach der Herstellung formaler und fixierter, in Paraffin eingebetteter menschlicher Hirnproben gemäß den Anweisungen im schriftlichen Teil des Protokolls, führen Sie eine hitzeinduzierte Antigenfreisetzung durch, indem Sie die Objektträger in heiße Vorbehandlungslösung zwei eintauchen und 15 Minuten lang kochen. Nach dem Waschen drei bis fünfmal mit destilliertem Wasser und drei bis fünfmal mit frischem 100 %igen Ethanol lassen Sie die Objektträger fünf Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen, um eine proteaseinduzierte Antigenfreisetzung durchzuführen. Geben Sie vier Tropfen Vorbehandlungslösung drei hinzu, bedecken Sie mit Perfil und inkubieren Sie 30 Minuten bei 40 Grad Celsius im Hybridisierungsofen, nachdem Sie drei bis fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen haben.Wie zuvor vier Tropfen des DAP-B-Sondensets zu den Kontrollhirnschnitten und vier Tropfen des gezielten Sondensets zu den experimentellen Schnitten hinzufügen, um die Hintergrundanfärbung zu beurteilen. Das Paar mit Folie bedeckter Objektträger in die Objektträgerbox legen und zwei Stunden bei 40 Grad Celsius im Hybridisierofen inkubieren. Nach Durchführung der Schritte des schriftlichen Protokolls zur Entwicklung des DAB-Signals für die mRNA des Interesses, das Vorhandensein eines Signals unter einem Hellfeldmikroskop überprüfen.Definieren Sie Referenzbereiche in den Gehirnproben, in denen das Vorhandensein von Puncta während des Gegenfärbeprozesses überwacht werden soll. Zum Gegenfärben zunächst die Objektträger in Luxal-Fast-Blue geben, das auf 60 Grad Celsius vorgewärmt wurde, und 30 Minuten bei 60 Grad Celsius inkubieren.Nach der Inkubation die Objektträger mehrmals mit destilliertem Wasser spülen und anschließend mehrfach in eine 0,05 %ige Lithiumcarbonatlösung eintauchen, um die Differenzierung einzuleiten. Danach die Objektträger zweimal in frischem 75 %igen Ethanol eintauchen und mit destilliertem Wasser abspülen. Die Gehirnschnitte unter einem Hellfeldmikroskop überprüfen.Beachten Sie, dass graue und weiße Substanz beginnen sollten, unterscheidbar zu sein, und RNA-Granula weiterhin als dunkelblaue bis schwarze Punkte sichtbar bleiben. Überprüfen Sie, ob Axone als hellblaue Fasern erscheinen, und wiederholen Sie den Luxol-Blau-Färbeprozess, indem Sie mit Luxol-Blau in Schritten von 10 bis 20 Minuten inkubieren und die Gegengefärbung sowie das Vorhandensein von RNA-Granula sorgfältig überwachen, bis die optimale Färbung erreicht ist. Legen Sie die gespülten Objektträger in kristallvioletten Lösung und inkubieren Sie 10 Minuten nach der Inkubation.Spülen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser. Tauchen Sie die Objektträger fünf bis zehn Mal in 70 %igen Ethanol ein und dehydrieren Sie sie anschließend durch drei schnelle Wechsel mit 100 %igem Ethanol in einer Abzugshaube. Entfärben Sie die Gehirnschnitte, indem Sie sie zweimal in Xylol inkubieren.Alternatives Klärungsmittel zwei Minuten und ein drittes Mal fünf Minuten lang. Die Gehirnschnitte bei Raumtemperatur in einem auf Xylol basierenden permanenten Einbettungsmedium auffrischen und unter einem Hellfeldmikroskop analysieren. FISH wurde durch proteaseinduziertes Entmaskieren gefolgt von der Antikörperdetektion von Cholinacetyltransferase, dargestellt in Rot, durchgeführt.Der Antikörper erkannte Chat nicht, wenn eine Proteasebehandlung durchgeführt wurde. Beispiele für Ergebnisse, die mit einer Nicht-Ziel-Sonde und einer auf TF4 abzielenden Sonde unter Verwendung derselben Mikroskopeinstellungen und Bildanpassungen erhalten wurden, sind dargestellt. Grüne, ATF4-positive Granula mit unklarer axonaler Lokalisation sind mit Fragezeichen gekennzeichnet.Blaue Bereiche sind dappy-gefärbte Kerne, wenn der Fisch mit hitzeinduziertem Antigen durchgeführt wurde. Die erneut in Rot dargestellte immunfluoreszente Färbung war erfolgreich. TF-vier-positive Granula, die in Axonen lokalisiert sind, erscheinen orange und sind als okay gekennzeichnet; anschließend wurden die ISH-Axone mit Luxol rot gefärbt.Die schnelle Blaufärbung und neuronale SOTA wurden mit krestalem Violet suboptimal luxal gegenständig gefärbt. Eine Färbung mit schnellem Blau kann auftreten, wenn die Temperatur gesenkt wird. Hier wurden die Proben vier Stunden lang bei 40 Grad Celsius mit luxal schnellem Blau gefärbt.TF-vier-positive Granula mit unklarer zufälliger Lokalisation sind mit Fragezeichen gekennzeichnet. Eine suboptimale Färbung tritt ebenfalls auf, wenn die Intensität der Gegengefärbung nach kurzen Inkubationszeiten nicht überprüft wird, wie hier zu sehen ist. Beispiele für eine optimale LFB-Färbung in Kombination mit ISH unter Verwendung einer Nicht-Ziel-Sonde oder der TF-vier-zielgerichteten Sonde werden hier gezeigt.Die Bildaufnahme wurde automatisch für das beste Signal-Rausch-Verhältnis eingestellt. Axon lokalisierte ein TF, vier Granula sind als in Ordnung markiert. Einmal gemeistert.Diese Technik kann je nach gewählter Kontrastfärbungsmethode nach ihrer Entwicklung in ein bis drei Tagen durchgeführt werden. Sie eröffnet Neurowissenschaftlern die Möglichkeit, die mRNA-Translation und -Lokalisation detailliert zu untersuchen.

detection-axonally-localized-mrnas-brain-sections-using-high

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Dieses Video beschreibt eine sequentielle Hybridisierungsstrategie, bei der mRNA-Sonden mit spezifischer Ziel-mRNA hybridisiert werden. Nach der Sondenhybridisierung wird eine Signalamplifikation durchgeführt, um die Auflösung durch Reduzierung des Signal-Rausch-Verhältnisses während des RNA-CISH histologischer Proben zu verbessern.

Sondenhybridisierung und Signalamplifikation in RNA in situ Hybridisierung: Eine Technik zum Nachweis spezifischer RNA-Sequenzen in Gewebeschnitten

Quelle: Jolly, S., et.al. Kombination von Doppelfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit Immunmarkierung zum Nachweis der Expression von drei Genen in Hirnschnitten von Mäusen. J. Vis. Exp. (2016). Dieses Video zeigt die Verwendung von Doppelfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, um die Expression von zwei RNA-Zielen in Hirnschnitten von Mäusen sichtbar zu machen. Das Protokoll umfasst den sequentiellen Nachweis von RNA mit Sonden, die mit Fluoresceinisothiocyanat und Digoxigenin markiert sind,...

 Durchführung einer Doppelfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung zum Nachweis der Genexpression in Gehirnschnitten von Mäusen

Quelle: Baleriola, J., et. al., Nachweis axonal lokalisierter mRNAs in Hirnschnitten mittels hochauflösender In-situ-Hybridisierung.  J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt den Nachweis von mRNA in cholinergen Axonen in fixierten Maus-Hippocampus-Schnitten mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt die räumliche Lokalisierung von sondenmarkierten mRNAs und Cholinacetyltransferase in cholinergen Neuronen.

Immunfärbung von Neuronen in Hirnschnitten von Mäusen nach Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und vereinfachte in situ Hybridisierungsmethode, die ideal für das Gehirn mit Paraformaldehyd-Präfix ist, wodurch der Bedarf an langwierigen komplexen Schritten bei der Verwendung von frischem gefrorenem Gewebe reduziert wird.  Die Methode wird anhand der Identifizierung des Serotonin-5-HT2A-Rezeptor-Gens htr2a bei Ratten validiert.

Schnelle<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung unter Verwendung von Oligonukleotidsonden auf Paraformaldehyd-Präfix Gehirn von Ratten mit Serotonin-Syndrom

Die Lokalisierung der Genexpression auf bestimmte Zelltypen kann aufgrund des Mangels an spezifischen Antikörpern eine Herausforderung darstellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen dreifachen Detektion der Genexpression durch Kombination von Doppelfluoreszenz-RNA-in-situ-Hybridisierung mit Immunfärbung.

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kombination von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Fluoreszenz-Immunhistochemie (IHC) sowohl in frisch gefrorenen als auch in fixierten Maus-Hirnschnitten, mit dem Ziel, Multilabel-FISH und Fluoreszenz-IHC-Signal zu erreichen. IHC zielte auf zytoplasmatische und membrangebundene Proteine ab.

Kombination von Multiplex-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit fluoreszierender Immunhistochemie an frischen, gefrorenen oder fixierten Mäusehirnschnitten

Expansion-Assisted Itercence In Situ Hybridization (EASI-FISH) ist eine robuste Technik, die Expansionsmikroskopie mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kombiniert, um die Expression mehrerer Gene in dickem Gewebe nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt die jüngsten Fortschritte in der Methode und ihre Anpassung an die Markierung des intakten Drosophila-Zentralnervensystems.

Multiplex-Detektion der Genexpression im intakten Drosophila-Gehirn mittels expansionsunterstützter iterativer Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Wir haben einen Duplex-in-situ-Hybridisierungsassay zur Kartierung der Insulinrezeptor-Isoformen IR-A und IR-B im murinen Plexus choroideus etabliert und damit die Einschränkungen traditioneller Methoden überwunden. Dieser hochauflösende Ansatz enthüllt die isoformspezifische Expression und bietet neue Einblicke in die Insulinsignalisierung im Gehirn und potenzielle isoform-gezielte Therapien für neurologische Erkrankungen.

Präzise Visualisierung der Insulinrezeptoren A und B im Gehirn von Mäusen mit einem RNA In Situ Hybridisierungsassay

Diese Studie präsentiert eine robuste Methode zur Isolierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraneinsätze, wodurch die Trennung von totalen Neuronen versus Neuriten und RNA-Reinigung ermöglicht wird. In Kombination mit RTddPCR ermöglicht der Ansatz eine absolute Quantifizierung von Low-Copy-Transkripten, was Studien zum mRNA-Transport und der lokalen Übersetzung mit hoher Sensitivität, Reproduzierbarkeit und breiter experimenteller Anwendbarkeit erleichtert.

Isolierung und Quantifizierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraninserts und RTddPCR

Erfahren Sie, wie In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie zur Visualisierung axonaler mRNAs in Maus- und menschlichem Gehirngewebe eingesetzt werden. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in die Genexpression in der Neuroforschung.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender

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