Maus-Modell der Alloimmune-induzierte Gefäßabstoßung und Transplantat-Arteriosklerose

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, bei Mäusen eine vollständige aortale Interpositionstransplantation durchzuführen, um die vaskuläre Abstoßung und die Transplantatarteriosklerose zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Segment der Bauchaorta von der Spendermaus entnommen wird. Anschließend wird das Segment orthotop in die intrarenale Aorta eines allogenen Empfängers transplantiert, der genetisch von dem Spender abweicht.

Im letzten Schritt wird das transplantierte Gefäßsegment entfernt und auf die Entwicklung einer Transplantatarteriosklerose untersucht. Letztendlich kann das Ausmaß der Transplantatarteriosklerose und der immunvermittelten alloreaktiven vaskulären Abstoßung durch die Messung der Intimaverdickung und Lumeneinengung sowie durch die immunhistochemische Analyse des Gewebes auf Ansammlung von Immunzellen beurteilt werden.

Im Allgemeinen benötigen Personen, die neu in diesem Verfahren sind, Zeit, um sich mit der mikrochirurgischen Technik vertraut zu machen, da ein hohes Maß an Geschicklichkeit und viel Übung erforderlich sind, um sie zu beherrschen. Dennoch sollte die Methode für die meisten Forscher durch sorgfältige und gewissenhafte Übung erlernbar sein. Die Demonstration des Verfahrens erfolgt gemeinsam mit Frau Winnie, einer talentierten Neurochirurgin, und Adam Roso, einem talentierten Doktoranden in meinem Labor. Beginnen Sie damit, die Spendermaus in Rückenlage auf einer sauberen, dünnen Plexiglasscheibe zu platzieren, die mit einem sterilen Tuch abgedeckt ist, unter dem Operationsmikroskop bei einer 30-fachen Vergrößerung.

Nachdem die ausreichende chirurgische Anästhesie durch Zupressen der Zehen bestätigt wurde, verwenden Sie sterile Scheren, um einen einzigen medianen Schnitt von der Schambeinfuge bis zum ZipID-Prozess anzulegen. Verwenden Sie danach einen kleinen Retraktor, um die Bauchdecke zu öffnen und die Bauchhöhle freizulegen. Anschließend verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um den Darm vorsichtig nach kranial auf die linke Seite des Tieres zu verlagern.

Bedecken Sie das Gewebe mit einem mit Kochsalzlösung angefeuchteten Mulltuch und verschieben Sie die Fortpflanzungsorgane nach kaudal, um die infrarenale Aorta und die untere Hohlvene (Vena cava inferior, VCI) zu lokalisieren. Verwenden Sie nun medizinische Pinzette Größe 5, um die Aorta an der linken Nierenarterie in der Nähe der Bifurkation von der VCI zu trennen. Ligieren Sie anschließend die kleinen Seitenäste in der Nähe der Aorta mit 10-0-Polyamid-Einzelstrang-Nähten.

Nachdem die Spenderaorta und die V. cava inferior getrennt wurden, die Gefäße mit Kochsalzlösung benetzen, die exponierte Körperhöhle mit feuchter Gaze abdecken und den Spender an einem sterilen Ort beiseitelegen. Danach das Empfängertier unter dem Mikroskop platzieren und die Aorta des Empfängers wie zuvor gezeigt von der V. cava inferior lösen. Anschließend zwei vier Millimeter große mikrovaskuläre Klammern, proximal und distal zum interessierenden Segment, in einem Abstand von etwa fünf Millimetern anbringen.

Danach mit verschiedenen mikrochirurgischen Tuben-Scheren einen einzelnen horizontalen Aortotomieschnitt setzen und nicht mehr als 0,5 Millimeter der abdominalen Aorta resektieren, um das Spender-Aortentransplantat aufzunehmen. Bringen Sie den Spender zurück unter das Mikroskop und trennen Sie ein drei bis vier Millimeter langes Transplantatsegment wie zuvor gezeigt ab. Anschließend spülen Sie die exzidierte Aorta mit einer 25-Gauge-5/8-Nadel mit heparinisiertem Kochsalzlösung aus.

Darauf achten, dass die Nadelspitze nicht mit dem Gefäß in Kontakt kommt, und das Gefäß in einen Behälter mit heparinhaltiger Eissalzlösung auf Eis stellen. Innerhalb von 30 Minuten nach der Entnahme das aortale Spendergefäß in orthotoper Position im Empfänger einsetzen, wobei die jeweilige anatomische Ausrichtung des Transplantats mit der des Empfängers übereinstimmen muss. Anschließend vorsichtig die Tunica externa des Gefäßes mit einer Pinzette der Größe fünf fassen und leicht zur Seite ziehen.

Verwenden Sie nun die Pinzette, um eine Nadel, die an einer 10-Null-Polyamid-Monofil-Naht befestigt ist, durch die gesamte Wanddicke des Gefäßes zu führen, um das Spender-Aortentransplantat an dem resezierten Gefäß des Empfängers zu befestigen, um Platz für kontinuierliche Nähte zu schaffen. Positionieren Sie Haltenähte um neun Uhr an beiden, dem oberen und unteren Ende des Transplantats. Beginnen Sie dann am oberen Ende des Transplantats um drei Uhr mit der Anastomose.

Die resezierten Enden mit zwei fortlaufenden Nähten verschließen und die Naht an der Haltenaht befestigen. Dann das Transplantat umdrehen und die fortlaufende Naht am dorsalen Teil des Gefäßes fortsetzen, bis zur Ursprungsstelle.

Halte-Naht. Sichern Sie die Naht, ohne viel Druck auf das Gefäß auszuüben, und wiederholen Sie das Nähen für die untere Anastomose. Sobald die Anastomose abgeschlossen ist.

Lösen Sie die distale mikrovaskuläre Klemme, um den retrograden Blutfluss durch das Gefäß zu ermöglichen. Wenn keine Blutung beobachtet wird, lösen Sie die proximale Klemme. Wenn keine Blutgerinnsel beobachtet werden, greifen Sie mit einer Pinzette vorsichtig ein Ende der Haltefäden und lenken das Gefäß leicht ab, um die Rückwand des Gefäßes zu untersuchen.

Es sollte keine Puckering beobachtet werden, wenn ein kräftiges Pulsationsmuster sowohl im Spender- als auch im Empfängergefäß sichtbar ist. Verwenden Sie Wattestäbchen, um den Darm in die Bauchhöhle zurückzubringen. Schließen Sie schließlich die Bauchwand mit einer Nadelhalterzange und einer Grof-Zange mittels Fünf-Null-Polypropylen-Nähten und kontinuierlicher Nahttechnik. Verschließen Sie die Hautschicht unter Verwendung einer subkutanen Naht mit denselben Nähten.

Die motorische Funktion der Hintergliedmaßen kann beobachtet werden, um den Erfolg der Operation zu beurteilen. Der Umfang der immunvermittelten allogenen vaskulären Schädigung wird untersucht, indem die intimalen Verdickungen und die Lumeneinengung in transplantierten Aortensegmenten am Tag 30 nach der Transplantation quantifiziert wird.

Tatsächlich zeigen die allogenen Arteriasegmente eine signifikante Intimaverdickung und Lumeneinengung, während in den ISO-Graft-Kontrollarterien keine Veränderungen beobachtet werden. Außerdem kann die Rekrutierung von Leukozyten in die allogene Arterie durch Untersuchung der Anreicherung von CD-vier- und CD-acht-positiven T-Zellen sowie von Makrophagen mittels Immunhistochemie bewertet werden. Wie erwartet wurden alle drei Typen von Immunzellen in der Intima des Spenderarteriengewebes nach der Entwicklung nachgewiesen.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Transplantation, um die alloimmunvermittelte Gefäßverminderung und die transplantationsbedingte arterielle Sklerose zu erforschen.