Isolierung und Charakterisierung von Satellitenzellen aus Ratte Kopf Branchiomeric Muscles

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Satellitenzellen aus repräsentativen Muskeln zu isolieren, die aus dem ersten, zweiten und vierten Branchialbogen stammen, um sie auf einer extrazellulären Matrix zu kultivieren. Gelflecken. Dies wird erreicht, indem zunächst die Musculus masseter, Musculus digastricus und Musculus levator veli palatini eines jungen adulten Rattentieres präpariert werden.

Im zweiten Schritt werden die Satellitenzellen aus jeder Muskelprobe durch enzymatische Verdauung und Dauerisolierung getrennt. Anschließend werden die Zellen auf extrazellulären Matrixgelen kultiviert. Letztendlich kann der dynamische Zustand der Myogenese der Satellitenzellkulturen durch Färbung für die gewünschten Muskelmarker verfolgt werden.

Die Lippen-Kiefer-Gaumenspalte ist eine der häufigsten kraniofazialen Missbildungen beim Menschen. Bei Vorliegen einer Spalte ist eine chirurgische Korrektur notwendig, um den Defekt zu schließen und eine normale Sprachentwicklung zu ermöglichen. Fibrose und eine gestörte Muskelregeneration können jedoch die funktionelle Wiederherstellung der Muskulatur des weichen Gaumens beeinträchtigen. Nach der Korrektur einer Gaumenspalte können Sie eine innovative Methode zur Kultur frisch isolierter Satellitenzellen mithilfe von exzellulären Matrix-Gel-Punktauflagen im Millimeterbereich demonstrieren.

Dies vermeidet die Notwendigkeit einer Expansion. Behandeln Sie diese Zellen, indem Sie einen Tag vor der Isolation achtlochige Kammerobjektträger in eine 100 Millimeter große Petrischale geben und die Schale auf eine gekühlte Oberfläche stellen. Nach 10 Minuten geben Sie mit einer vorgefüllten Mikropipette je einen einzelnen Tropfen von 10 µL extrazellulärem Matrixgel in jedes Loch ab.

Nachdem die Objektträger weitere sieben Minuten gekühlt wurden, das verbleibende Gel vollständig entfernen und die Vertiefungen am folgenden Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius trocknen lassen. Um den Musculus masseter zu präparieren, die Haut vom Kopf einer neun Wochen alten Ratte entfernen und Hohl­nadeln verwenden, um den Kopf seitlich fixiert zu halten. Auf einem Silikon­kissen die Parotis und den Nervus facialis isolieren und die Drüse entfernen.

Danach das Gesichtsnerv mit einer Klingennummer 15 vorsichtig entfernen. Den oberflächlichen Kopf des Musculus masseter identifizieren. Anschließend mit einer geraden Pinzette das Sehnenursprung am Processus zygomaticus lösen und danach das Sehnen vorsichtig mit einer Schere durchtrennen.

Präparieren Sie mit dem Skalpell den oberflächlichen Kopf des Musculus masseter bis zu seiner Ansatzstelle am Winkel und der unteren Hälfte der lateralen Fläche des Mandibularamus. Um den hinteren Bauch des Musculus digastricus zu präparieren, fixieren Sie den Kopf in Rückenlage mit Nadeln und entfernen Sie das subkutane Fettgewebe, das über den Glandula sublingualis und Glandula submandibularis liegt. Legen Sie die vorderen und hinteren Bäuche des Musculus digastricus frei, halten Sie dann mit einer geraden Pinzette die vordere Sehne des hinteren Bauches fest und dissezieren Sie vorsichtig die Sehne bis zu ihrem Ursprung am Tympanicum bullae.

Um den Musculus levator palatini zu präparieren, lokalisieren Sie den Musculus stylohyoideus. Ziehen Sie ihn lateral und entfernen Sie vorsichtig das Muskelgewebe. Lokalisieren Sie anschließend die Sehne des Musculus levator palatini, die am Tympanic bulla ansetzt, und präparieren Sie sie sorgfältig.

Heben Sie dann die Speiseröhre hinter der Luftröhre an. Identifizieren Sie den Bereich des weichen Gaumens, an dem der Musculus levator veli palatini ansetzt, und lösen Sie den Muskel durch einen Schnitt. Tauchen Sie den Muskel anschließend in 70 % Ethanol ein und überführen Sie ihn in kalte PBS-Lösung, die mit Antibiotika angereichert ist.

Um die Satellitenzellen zu isolieren, überführen Sie jeden Muskel in einzelne Vertiefungen einer 6-Loch-Platte und schneiden das Gewebe in kleine zwei Millimeter große Stücke, wobei darauf zu achten ist, die Muskeln nicht übermäßig zu zerkleinern. Danach werden die Gewebefragmente vorsichtig in 2,5 Milliliter 0,1%iger Pronase-Lösung pro Vertiefung bei 37 Grad Celsius 60 Minuten lang unter vorsichtiger Schüttelung alle 20 Minuten inkubiert.

Wenn die Faserbündel Exhibit A ein gelockertes Aussehen aufweisen, 2,5 Milliliter DMEM, ergänzt mit Pferdeserum und Antibiotika, zu jedem Brunnen hinzufügen und die verdaute Gewebeprobe in einzelne kegelförmige 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Die Gewebesuspensionen abzentrifugieren und die Überstände dekantieren. Anschließend je fünf Milliliter Medium zu jedem Röhrchen hinzufügen und das Gewebe mit einer 10-Milliliter-Kunststoffpipette homogenisieren.

Zentrifugieren Sie die Gewebe erneut und überführen Sie die Überstände in neue konische 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie dann weitere fünf Milliliter Medium zu den Röhrchen hinzu und pipettieren Sie die Gewebestücke erneut, bis die Fragmente leicht durch die Pipette gleiten. Nach einer weiteren Zentrifugation ziehen Sie die Überstände in die entsprechenden passenden Röhrchen und filtrieren die Zellsuspensionen durch 40-Mikrometer-Siebe in einzelne 50-Milliliter-Röhrchen.

Spülen Sie die Siebe mit einem Milliliter DMEM, um eine maximale Zellausbeute zu erzielen. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen, resuspendieren die Pellets in frischem Kulturmedium und zählen die Zellen, um die isolierten Satellitenzellen zu kultivieren. Verdünnen Sie danach die Zellsuspensionen auf 1,5 × 10³ Zellen pro 10 Mikroliter Kulturmedium.

Gegeben Sie dann 10 Mikroliter Zellen auf jeden zuvor vorbereiteten Fleck mit extrazellulärer Matrix-Gel und inkubieren Sie die Gele nach sechs Stunden bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie vorsichtig 400 Mikroliter Kulturmedium zu jedem Gel-Fleck hinzu und stellen Sie die Objektträger zurück in den Inkubator. Beginnen Sie nach drei Tagen die Differenzierung der Zellen durch Zugabe des geeigneten Kulturmediums unmittelbar nach der Isolierung.

Über 90 % der frisch isolierten Satellitenzellen exprimieren Pax7. Bis zum vierten Tag exprimieren die Satellitenzellen aus allen Muskelgruppen sowohl Pax7 als auch MyoD. MyoG wird am siebten Tag in allen Muskelgruppen stark exprimiert. Vier Tage nach der Aussaat auf der extrazellulären Matrix bilden sich Gel-Strukturen, und die proliferierenden Zellen beginnen zu fusionieren und kleine mehrkernige Myotubuli zu bilden, die am siebten und zehnten Tag Myosin-Schwerketten exprimieren.

Lange und gut organisierte Myoröhren sind am Tag 10 erkennbar. Zuckungen der Myoröhren können ebenfalls beobachtet werden. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung von Satellitenzellen, die aus den Kaumuskelmuskeln stammen, und bietet neue Möglichkeiten für die Behandlung von Patienten mit Gaumenspalte.