Neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Serum-freiem Monolayer-Kultur
14. Mai 2015
Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Methode zur Erzeugung von neuralen Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen unter Verwendung einer serumfreien Monolayer-Methode. Diese Vorläuferzellen können verwendet werden, um reife neuronale Zelltypen abzuleiten oder den Prozess der neuronalen Spezifikation zu untersuchen, und sind für die Skalierung im Multiwell-Format für das Screening von Verbindungen zugänglich.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, embryonale Stammzellen der Maus in einer serumfreien Monolayer-Zellkultur zu einer neuronalen Linie zu differenzieren. Dies wird erreicht, indem das Kulturgefäß zunächst mit Gelatine bestreicht wird. Im zweiten Schritt werden die embryonalen Stammzellen in Differenzierungsmedium zu einer Einzelzellsuspension assoziiert und auf die entsprechenden Plattierungsdichten verdünnt.
Im letzten Schritt werden die Zellen auf die Gel-ENC-beschichtete Platte ausgesiedelt. Letztendlich wird die Immunfluoreszenzmikroskopie eingesetzt, um den Erfolg der Differenzierung durch Visualisierung der interessierenden neuronalen Marker zu bestätigen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Beschichtung mit der richtigen Dichte entscheidend ist, um eine gute Differenzierung zu erreichen.
Und es gibt mehrere Faktoren, die die Beschichtungsdichte sowohl direkt als auch indirekt beeinflussen. Vor dem Plattieren erwärmen die Zellen ein Aliquot von 1%Gelatine in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad, bis es sich aufgelöst hat. Mischen Sie dann die Gelatine mit 500 Millilitern warmem PBS und bedecken Sie den Boden des Zellkulturbehälters mit gerade so viel der Lösung, dass die Oberfläche bedeckt ist, während die Gelatine bedeckt ist.
Spülen Sie die subkonfluente Kultur von Maus-Embr-Stammzellen zweimal in PBS. Geben Sie dann einen Milliliter Dissoziationsreagenz in die Kultur. Nach zwei bis fünf Minuten klopfen Sie auf das Gefäß, um die Monoschicht in eine Einzelzellsuspension zu lösen und die Kultur in insgesamt 10 Millilitern Medium und Zelldissoziationsreagenz zu sammeln.
Füllen Sie die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie sie in einer Zentrifuge herunter. Nach vorsichtiger Aspiration des Supinats wird das Pellet in 10 Millilitern vorwärmtem N zwei B 27 resuspendiert, indem es gegen die Seite des Rohres gedrückt wird. Um Blasenbildung zu vermeiden, zählen Sie nun die Zellen, die die Konzentration aufzeichnen, und suspendieren Sie sie bei der entsprechenden Anzahl von Zellen pro Volumeneinheit pro Vertiefung in der Vorwärmung von N zwei B 27 gemäß der Tabelle.
Aspirieren Sie dann die Gelatine aus dem Kulturgefäß und plattieren Sie die Zellen, ohne den Behälter zu verwirbeln. Stellen Sie die Kulturen in einen feuchten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie das Medium alle ein bis zwei Tage.
Mit frischem N zwei B 27 beginnen die Zellen sich zu differenzieren und zeigen Socken, eine Expression innerhalb von vier bis sechs Tagen, um die Zellen für die Immunfluoreszenzbildgebung zu färben. Entfernen Sie das Differenzierungsmedium aus den Kulturen und fixieren Sie die Zellen nach 15 Minuten in 500 Mikrolitern 4%Para-Formaldehyd, waschen und durchdringen Sie die Zellen zweimal mit zwei Millilitern PBS mit Tween. Blockieren Sie dann jede unspezifische Bindung mit einer einstündigen Inkubation der Zellen.
In einem Milliliter PBS-Tween mit Serum auf einer Tellerwippe ergänzt, nach dem Waschen der Zellen, wie gerade gezeigt. Bei 500 Mikrolitern Maus-IgG gegen Beta werden drei Tubulin in die Kulturen für eine Übernacht-Inkubation auf der Plattenwippe bei vier Grad Celsius gegeben. Am nächsten Tag.
Nach dem Waschen der Zellen werden die Proben in fluoreszenzmarkierten Anti-US-IgG-Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur inkubiert, die nach einer Stunde vor Licht geschützt und geschaukelt werden. Spülen Sie die Zellen erneut und färben Sie sie fünf Minuten lang in 500 Mikrolitern DPI. Nachdem Sie die Zellen ein letztes Mal gewaschen haben, lagern Sie sie schließlich bis zu zwei Wochen lang bei vier Grad Celsius in PBS-Tween.
Bis zum Bild. In diesem Experiment wurden embryonale Stammzellen der Maus mit einem endogenen SOX-1-GFP-Reporter verwendet, um die neuronale Differenzierung zu verfolgen. Am sechsten Tag wurden die Zellen fixiert und auf den neuronalen Marker Beta-3-Tubulin gefärbt
.Bei optimaler Dichte differenzierten sich die Zellen in neurale Vorläuferzellen und Neuronen, während die Platzierung in einer höheren Dichte zu einer verringerten Anzahl von SOX-1-GFP- und Beta-3-Tubulin-positiven Zellen führte. Auch das Volumen des Zellkulturbehälters beeinflusst die optimale Plattierungsdichte. Zum Beispiel benötigen Zellen, die in einer 96-Well-Platte gezüchtet werden, eine etwa 10-mal höhere Zelldichte.
Die Zellen wurden in einer Sechs-Well-Kulturschale plattiert, um die optimale und zwei Konfluenzzelldichten zu erreichen. Während der Differenzierung verändern embryonale Stammzellen nach und nach ihre Morphologie. In diesen Bildern ist zum Beispiel die Zell- und Koloniemorphologie vom ersten bis zum sechsten Tag nach dem Blazieren bei optimaler Zelldichte zu beobachten.
Am vierten Tag beginnen die Zellen, zu neuralen Vorläuferzellen zu werden, was durch das Erscheinen des grün fluoreszierenden Signals des SOX one GFP-Reporters belegt wird. Und am sechsten Tag sind die meisten Zellen SOX-1-positiv. Obwohl die Existenz einiger nicht-neuronaler Zellen erwartet wird Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die neuronale Differenzierung von Maus-Emry-Stammzellen in einer Monoschicht-Zellkultur initiieren können.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Differenzierung von embryonalen Mausstammzellen in neuronale Vorläuferzellen mithilfe eines serumfreien Monolayer-Verfahrens. Dieser Ansatz ermöglicht die Generierung ausgereifter neuronaler Zelltypen und eignet sich für die Skalierung im Mehrfachbrunnenformat zur Wirkstoffscreening-Anwendung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Stammzellforschung
Hintergrund
- Embryonale Stammzellen können sich in verschiedene Zelltypen differenzieren.
- Neurale Vorläuferzellen sind entscheidend für die Untersuchung der neuronalen Entwicklung.
- Serumfreie Kultivierungsmethoden können die Reproduzierbarkeit verbessern.
- Eine geeignete Ansiededichte ist entscheidend für eine erfolgreiche Differenzierung.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Erzeugung neuraler Vorläuferzellen etablieren.
- Die Untersuchung der Prozesse der neuronalen Spezifikation erleichtern.
- Ein Hochdurchsatz-Screening für Verbindungen, die die neuronale Differenzierung beeinflussen, ermöglichen.
Verwendete Methoden
- Beschichten von Kulturgefäßen mit Gelatine.
- Erstellen einer Einzelzell-Suspension von embryonalen Stammzellen.
- Aussäen der Zellen auf gelatinebeschichteten Platten.
- Verwendung der Immunfluoreszenzmikroskopie zur Bestätigung des Differenzierungserfolgs.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Differenzierung von embryonalen Stammzellen in neurale Vorläuferzellen.
- Die Visualisierung neuronaler Marker bestätigt die Differenzierung.
- Herstellung optimaler Ansiededichten für eine effektive Differenzierung.
- Das Verfahren ist für Anwendungen im Bereich des Wirkstoff-Screenings skalierbar.
Schlussfolgerungen
- Die serumfreie Monolayer-Methode ist wirksam zur Erzeugung neuronaler Vorläuferzellen.
- Die Immunfluoreszenz ist eine zuverlässige Technik zur Beurteilung der Differenzierung.
- Dieses Protokoll kann für verschiedene Forschungsanwendungen in der Neurowissenschaft angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die skalierbare Generierung von neuronalen Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus in einem definierten, serumfreien Monolayersystem und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen im Frühstadium sowie die mechanistische Risikominderung in der neurowissenschaftlichen Arzneimittelentwicklung. Die Methode bietet eine reproduzierbare, quantitative Plattform zur Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf die neuronale Differenzierung und erleichtert die Identifizierung von Leitsubstanzen sowie die Vorhersagesicherheit in präklinischen Abläufen. Die Verträglichkeit mit Reportergeh- und Hochdichte-Kultivierungsformaten erlaubt die Integration in Screening-Workflows für Untersuchungen zur Modulation von Signalwegen und zur Zielstrukturenbindung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen der neuronalen Spezifikation und die funktionelle Validierung neurodevelopmentaler Zielstrukturen durch gezielte Differenzierung.
- Operativer Wert: Bietet ein definiertes, serumfreies System, das die Variabilität verringert und die Reproduzierbarkeit zwischen Experimenten und Zelllinien verbessert.
- Predictiver Wert: Ermöglicht die Beurteilung von durch Verbindungen hervorgerufenen Veränderungen der Ausbeute an neuronalen Vorläuferzellen und der Markerexpression und liefert damit Hinweise auf Targetbindung und Modulation von Signalwegen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt eine homogene Population neuraler Vorläuferzellen, die für die Wirkstoffscreening und die phänotypische Beurteilung der neuronalen Differenzierung geeignet ist.
- Operativer Wert: Anpassbar an Mehrmuldenformate (z. B. 96-Loch) mit skalierbarer Optimierung der Ansiedledichte, wodurch Anwendungen mit mittlerer bis hoher Durchsatzleistung ermöglicht werden.
- Bereitschaft für Assays: Kompatibel mit Immunfluoreszenz, Durchflusszytometrie und molekularen Nachweismethoden zur multiparametrischen Analyse der Differenzierungseffizienz und Markerexpression.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht den Fortschritt von der Generierung neuronaler Vorläuferzellen bis hin zur funktionellen Reifung von Neuronen und Gliazellen und unterstützt damit die Modellierung krankheitsrelevanter Prozesse.
- Mechanistische Entwicklungsrisikominimierung: Erleichtert die Untersuchung von Linienentscheidung und Differenzierungsdynamik unter Verwendung von Reportzelllinien (z. B. SOX1-GFP), um die neuronale Spezifizierung in Echtzeit zu überwachen.
- Präklinische Anwendbarkeit: Ermöglicht die Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die neuronale Reifung und die Differenzierung von Gliazellen und unterstützt damit Sicherheitspharmakologie- und Wirkmechanismusstudien.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und unterstützt die Target-Validierung durch die mechanistische Untersuchung der neuronalen Differenzierung sowie die Entwicklung von Assays für die Wirkstoff-Screening in neurowissenschaftlichen Portfolios.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung neuroentwicklungsbedingter Signalwege und die Zielvalidierung mittels gezielter Differenzierung und markergestützter Nachweise.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays in Einfachschichtkulturen, wobei die Ansiededichte ein kritischer Parameter für die konsistente Erzeugung neuraler Vorläuferzellen ist.
- Analytik: Liefert quantitative Ergebnisse mittels Immunfluoreszenz (z. B. SOX1-GFP, βIII-Tubulin) und Durchflusszytometrie zur Messung der Differenzierungseffizienz und der Reaktion auf Wirkstoffe.
- Translationale Forschung: Verbindet die frühe Erzeugung neuraler Vorläuferzellen mit deren nachfolgender Reifung zu funktionellen Neuronen und Gliazellen und unterstützt so die präklinische Kontinuität.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Ein definiertes, skalierbares Protokoll ermöglicht die Wiederverwendung über mehrere ESC-Linien, Kulturgefäße und Screening-Kampagnen hinweg und reduziert den Aufwand für Neuentwicklungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in den neuralen Differenzierungswegen verringert werden.
- Operationaler Wert: Standardisierte, serumfreie Bedingungen verbessern die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit über verschiedene Labore und Zelllinien hinweg.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem eine frühzeitige Beurteilung der Wirkstoffeffekte auf die neuronale Linienzugehörigkeit und Differenzierungseffizienz ermöglicht wird.
- Portfolio-Implikation: Fördert die risikoadjustierte Priorisierung von Neurosciences-Targets durch mechanistische Risikominimierung und Pfad-Validierung.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur von Stammzellen, Differenzierungstechniken und Immunfluoreszenzmikroskopie.
- Setzt den Zugang zu CO2-Inkubatoren, Zentrifugen, Mikroskopen sowie Reagenzien wie Gelatine, N2B27, Dissoziationsreagenzien und Antikörpern voraus.
- Erfordert eine Standardisierung der Ansiedledichte und der Gelatinebeschichtungsverfahren zwischen verschiedenen Anwendern und Standorten, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Die Anpassung an verschiedene ESC-Linien oder Reporterkonstrukte kann eine Optimierung der Ansiedledichte und des Zeitpunkts der Differenzierung erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Empfindlichkeit gegenüber der Ansiedledichte und die Notwendigkeit einer sorgfältigen Monolayer-Dissoziation, um Klumpenbildung oder unvollständige Einzelzell-Suspensionen zu vermeiden.
