Ein Aquatic Microbial Metaproteomik Workflow: Von der Zelle zum tryptischen Peptide Geeignet für Tandem-Massenspektrometrie-basierte Analyse

Das Ziel dieses Verfahrens ist die Extraktion von Protein und DNA aus mikrobieller Biomasse aus Meerwasser, gefolgt von der Erzeugung tryptischer Peptide für die proteomische Analyse mittels Tandem-Massenspektrometrie. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen lysiert werden, die zuvor auf einem Kartuschenfilter angereichert wurden. Der zweite Schritt besteht darin, das Zelllysat mithilfe von Ultra-Zentrifalfiltereinheiten zu konzentrieren.

Anschließend wird das Lysat in zwei Fraktionen aufgeteilt, eine für die Proteinfällung und eine für die DNA-Fällung. Im letzten Schritt erfolgt die In-Gel-Trypsinverdauung der Proteine und die Extraktion von Peptiden, die für die Flüssigkeitschromatographie und die Tandem-Massenspektrometrie-Analyse geeignet sind. Letztendlich kann mittels nachfolgender bioinformatischer Analyse die Expression von Proteinen in der Probe identifiziert werden, während die isolierte DNA für die metagenomische und/oder 16S-rRNA-Gen-Analyse verwendet werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sowohl Protein als auch DNA gleichzeitig aus derselben Probe isoliert werden können. Zunächst wird die RNA-Stabilisierungslösung mithilfe einer 60-Milliliter-Spritze, die am Luer-Lock-Ende der Filterzentrifuge befestigt ist, aus der Kartuschenfiltereinheit in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ausgestoßen. Anschließend wird das 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen 10 Minuten lang bei 17.000 × g zentrifugiert, um zelluläre Bestandteile als Pellet abzutrennen. Danach wird das Überstand in eine 10-K-Ultra-Zentrifugalfiltereinheit überführt, um Proteine aufzufangen, die aus Zellen stammen, die in der Probe lysiert haben.

Verwerfen Sie das Pellet nicht. Zentrifugieren Sie die Ultra-Zentrifugalfiltereinheit bei 3.270 × g für 30 Minuten oder bis das Volumen auf etwa 600 Mikroliter reduziert ist. In der Zwischenzeit schmelzen Sie die Spitze einer P-10-Spitze an und verschließen Sie die Seite der Kartuschenfiltereinheit ohne Luer-Lock mit dem offenen Ende der Spitze.

Dadurch wird sichergestellt, dass während der folgenden Schritte kein Extraktionspuffer und keine Biomasse entweichen. Den Pellet in einem Milliliter SDS-Extraktionslösung suspendieren und mit einer Pipette in die ursprüngliche Kartuschenfiltereinheit überführen. Die einfachste Methode, um in die Kartuschenfiltereinheit zu pipettieren, besteht darin, eine P200-Spitze auf eine P1000-Spitze zu stecken und diese Doppelspitze zum Pipettieren zu verwenden. Ein zusätzliches Milliliter SDS-Extraktionslösung zur Kartuschenfiltereinheit hinzufügen, sodass das Gesamtvolumen etwa zwei Milliliter beträgt.

Para-Folie. Das Lure-Lock-Ende der Kartuschenfiltereinheit schließen und die Kartuschenfiltereinheit in das 50-Milliliter-Röhrchen geben. Danach drei zerknüllte Laborwischtücher auf den Boden eines 50-Milliliter-Konusröhrchens legen.

Schließen Sie den Deckel und geben Sie das Röhrchen in den Hybridisierofen, um es 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren zu inkubieren. Nach 10 Minuten platzieren Sie den Filter auf einem Schaumstoffschwimmer und sichern ihn mit einer 5-Milliliter-Spritze am Luer-Lock-Ende. Laden Sie auf und inkubieren Sie 15 Minuten in einem Wasserbad bei 95 Grad Celsius. Lassen Sie anschließend die Kartuschenfiltereinheit abkühlen und eine Stunde bei Raumtemperatur unter Rühren rotieren. Sobald sie abgekühlt ist, drücken Sie die SDS-Extraktionslösung (Zelllysat) mit einer 60-Milliliter-Spritze aus dem Filter in dieselbe Ultra-Zentrifalfiltereinheit.

Wie zuvor einen Milliliter frische SDS-Extraktionslösung zur Kartuschenfiltereinheit hinzufügen und 30 Sekunden lang per Hand mischen. Anschließend den Inhalt des Filters mit der 60-Milliliter-Spritze in die Ultra-Zentrifalfiltereinheit auspressen, um den Filter auszuwaschen und sicherzustellen, dass alle Proteine entfernt und gesammelt wurden. Die Ultra-Zentrifalfiltereinheit 45 Minuten bei 3.270 × g zentrifugieren, oder bis das Volumen in der Filtereinheit weniger als 600 Mikroliter beträgt.

Entsorgen Sie das Durchflussvolumen und füllen Sie die Ultra-Zentrifalfiltrationseinheit mit frischer SDS-Extraktionslösung auf. Zentrifugieren Sie die Filterspitze weitere 45 Minuten bei 3.270 × g, bevor Sie diesen Schritt insgesamt zweimal wiederholen. Stellen Sie sicher, dass das Endvolumen in der Ultra-Zentrifalfiltrationseinheit nach dem letzten Zentrifugationsschritt maximal 600 Mikroliter beträgt.

Messen Sie an dieser Stelle das Volumen des Konzentrats und teilen Sie es in zwei Hälften. Ein Anteil wird für die DNA-Präzipitation verwendet, der andere für die Proteinpräzipitation. Für die Proteinpräzipitation geben Sie vier Volumina Methanol und Aceton im Verhältnis 50 zu 50 zu einem Volumen Konzentrat hinzu, wirbeln 10 Sekunden lang und inkubieren über Nacht bei minus 20 Grad Celsius.

Am nächsten Tag die Mischung bei 17.000 × g 30 Minuten lang zentrifugieren, nach dem Abgießen des Überstandes das Pellet eine Stunde im Speed-Vac trocknen lassen. Das Pellet nicht übermäßig trocknen, da es sonst schwer wieder aufnehmbar sein könnte.

Suspendieren Sie das Pellet in 25 Mikrolitern SDS-Extraktionslösung. Lassen Sie es eine Stunde lang stehen und resuspendieren Sie es anschließend durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Führen Sie die SDS-Gelelektrophorese an den Proteinen gemäß dem schriftlichen Protokoll durch, arbeiten Sie dabei in einem biologischen Sicherheitswerkbank, um Kontaminationen zu minimieren, und schneiden Sie das überschüssige Gel unterhalb der 10-Kilodalton-Linie für jede Spur ab.

Jede Spur wird an einem Tandem-Massenspektrometer analysiert. Schneiden Sie jede Spur separat in Quadrate von einem Millimeter mal einem Millimeter, um die Oberfläche zu vergrößern, und geben Sie alle Quadrate der Spur in ein Low-Binding-Mikrozentrifugenröhrchen. Um zu verhindern, dass das Gel austrocknet und schwer schneidbar wird, kann 1 %ige Essigsäure verwendet werden; wiederholen Sie dies für alle Spuren.

Fahren Sie mit der in-Gel-Trypsinverdauung und Peptidextraktion wie im Textprotokoll beschrieben fort, oder führen Sie eine DNA-Fällung im SDS-Extraktionslösungsschritt bis zur Konzentratfraktion durch, die für die DNA-Fällung bis zur Marke von 500 Mikrolitern verwendet wird. Dieser Schritt dient lediglich dazu, das Volumen der Lösung zu erhöhen, wodurch die Handhabung erleichtert wird. Danach geben Sie 0,583 Volumina eines Proteinfällungsreagenzes, wie beispielsweise des MPC-Proteinfällungsreagenzes, hinzu und wirbeln die Probe kräftig im Vortex.

Zentrifugieren Sie 10 Sekunden lang eine weiße Niederschlagsform bei 17.000 × g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Nach der Zentrifugation überführen Sie das Überstand in ein anderes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und geben 0,95 Volumina Isopropanol hinzu, das 30 bis 40 Mal invertiert wird, bevor es 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert wird. Anschließend den Überstand vorsichtig dekantieren und verwerfen. Danach den Pellet zweimal mit 750 Mikrolitern 70 %igem Ethanol waschen.

Entfernen Sie so viel Ethanol wie möglich durch Pipettieren und lassen Sie das Pellet anschließend an der Luft trocknen. Trocknen Sie die DNA nicht zu stark aus, da dies die Wiederaufnahme erschweren kann. Suspendieren Sie das Pellet in 25 Mikrolitern Puffer LT, pH 8.

Quantifizieren Sie die DNA mithilfe eines doppelsträngigen DNA-Assay-Kits und gemäß den Herstelleranweisungen. Führen Sie außerdem eine Agarose-Gelelektrophorese mit drei Mikrolitern der DNA durch, um deren Qualität zu überprüfen. Die Peptide wurden einer Tandem-Massenspektrometrie-Analyse unterzogen. Pro Probe wurden über 23.000 Spektren generiert, anhand derer Peptide und Proteine identifiziert wurden.

Die taxonomische und funktionelle Zusammensetzung der Metaproteome wurde mithilfe einer Kombination aus BlastP und dem Metagenom-Analysator untersucht. Proteine, die Alpha-Proteobakterien zugeordnet wurden, waren im Datensatz am stärksten vertreten. Der überwiegende Teil davon wurde der SAR11-Klade zugeordnet.

Die Roter-Klade der Alpha-Proteobakterien war ebenfalls stark vertreten und wurde identifiziert. Am häufigsten in Oberflächengewässern. Proteine, die bakteriellen Krankheiten zugeordnet wurden, waren gleichmäßig zwischen der Oberfläche und dem Chlorophyll-Maximum verteilt, aber Proteine von Flügelbakterien wurden stärker im Chlorophyll-Maximum nachgewiesen.

Gamma-Proteobakterien-Proteine waren gleichmäßig in der Wassersäule verteilt, während Beta-Proteobakterien-Proteine vorwiegend an der Oberfläche gefunden wurden. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von drei Tagen durchgeführt werden.