Name: Ein Aquatic Microbial Metaproteomik Workflow: Von der Zelle zum tryptischen Peptide Geeignet für Tandem-Massenspektrometrie-basierte Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Erfahren Sie einen mikrobiellen Metaproteomik-Workflow für Meeresproben: Extraktion von Protein und DNA aus Biomasse, Trypsin-Verdauung und Tandem-Massenspektrometrie für umfassende ökologische Analysen.

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Die Autoren danken Marcos Di Falco für seine Expertise und Beratung bei der Vorbereitung der Proben für die Nano-LC MS/MS sowie Dr. Zoran Minic von der University of Regina für die LC MS/MS-Analyse. Diese Arbeit wurde durch NSERC (DG402214-2011) und SFB (950-221184) gefördert. D.C. wurde vom Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems und FQRNT unterstützt.

1. Bereiten Reagenzien <ol><li> Vorbereitung SDS-Extraktionslösung: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% Glycerin, 10 mM EDTA und 1% SDS. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei 4 ° C. </li><li> Bereiten stock Reagenzien für die Polyacrylamid-Gel nötig. <ol><li> Bereiten 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei Raumtemperatur lagern. </li><li> 0,5 M Tris-HCL pH 6,8. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei Raumtemperatur lagern. </li><li> Bereiten Sie 10% SDS. Filter zu sterilisieren mit einem 0,22 um Filter und bei Raumtemperatur lagern. </li></ol></li><li> Bereiten Sie Lösungen für in-Gel-Trypsin zu verdauen und Peptidextraktion benötigt wird. <ol><li> Bereiten 100 mM Ammoniumbicarbonat. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei 4 ° C. </li><li> Bereiten Sie 1 M DTT Aktien. In 100 mM Ammoniumbicarbonat und Öffnungs suspendiert bei -80 ° C. </li><li> Bereiten 550 mM Iodacetamid Aktien. In Hänge100 mM Ammoniumbicarbonat und bei -80 ° C. </li><li> Bereiten 100 ng / &amp; mgr; l Trypsin Aktien. Aliquot 60 ul in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C. </li><li> Bereiten Extraktionslösung: 1% Ameisensäure, 2% Acetonitril. </li><li> Vorbereitung Resuspensionslösung: 5% Acetonitril und 0,1% Ameisensäure. </li></ol></li></ol> 2. Führen Sie Cell Lysis in Patronenfilteranlage mit Zellen in RNA Stabilization Lösung konserviert <ol><li> Vertreiben die RNA Stabilisierungslösung aus dem Patronenfiltereinheit (1,5 ml) gelöst und in einem 2 ml Mikroröhre mit einer 60 ml Spritze am Luer-Ende des Filters angebracht ist. </li><li> Zentrifugieren Sie die 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen für 10 min bei 17.000 xg, jede Zelltrümmer zu pelletieren. Dies geschieht so, dass der Filter im Schritt 2.3 nicht verstopfen. </li><li> Überstand in einem 10 K Ultrazentrifugenfiltereinheit, um alle Proteine ​​aus Zellen stammen, die von der Gefrier / tha lysiert wurden erfassenw der Probe. Werfen Sie die Tablette. Es wird in Schritt 2.5 verwendet werden. Zuführen Zentrifugation der Ultrazentrifugenfiltereinheit bei 3.270 × g für 30 min oder bis das Volumen auf etwa 600 &amp; mgr; l verringert. </li><li> Schmelzen Sie die Spitze eines p10 Spitze und blockieren die Nicht Luer-Lock-Seite des Patronenfilteranlage mit dem offenen Ende der Spitze. Dadurch wird sichergestellt, dass kein Extraktionspuffer und Biomasse während der Schritte 2,5-2,7 entweicht. </li><li> Hängen Sie das Pellet in 1 ml SDS-Extraktionslösung pipettieren und es in die ursprüngliche Patronenfilteranlage. Der einfachste Weg, um in die Patronenfilteranlage Pipette, um eine p200 Spitze auf eine p1000 Spitze stapeln und diese Doppelspitze zum Pipettieren. </li><li> 1 ml SDS-Extraktionslösung auf den Patronenfiltergerät so das Gesamtvolumen beträgt etwa 2 ml und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur, während in einem Hybridisierungsofen dreht. Platzieren 3 zerknitterten lab wischt den Boden eines 50 ml konischen Röhrchen. Parafilm beide Enden des Patronenfilteranlage geschlossenund setzen Sie den Patronenfilteranlage in das 50-ml-Tube. Schließen Sie den Deckel und setzen Sie den Schlauch in die Hybridisierungsofen. </li><li> Nach 10 Minuten statt der Sterivex Filter auf einem Schaumstoff-Schwimmer und befestigen Sie sie mit einer 5-ml-Spritze am Luer-Lock-Ende. Float und Inkubation in einem 95 ° C Wasserbad für 15 min. </li><li> Lassen Sie die Patronenfilteranlage kühl und drehen bei Raumtemperatur für 1 Stunde (wie in Schritt 2.6). </li><li> Vertreiben die SDS-Extraktionslösung / Zelllysat aus dem Filter mit einem 60-ml-Spritze in der gleichen Ultrazentrifugen-Filtereinheit wie zuvor beschrieben (Schritt 2.3). 1 ml frisches SDS-Extraktionslösung zur Patronenfilteranlage und Mischen für 30 Sekunden mit der Hand, dann in der Ultrazentrifugen-Filtereinheit auszustoßen unter Verwendung der 60-ml-Spritze. Dies wird auf die Patronenfiltereinheit spülen, um sicherzustellen, dass alle Proteine ​​entfernt wurden. </li><li> Zuführen Zentrifugation auf dem Ultrazentrifugenfiltereinheit für 45 min bei 3.270 × g oder, bis das Volumen in der Filtereinheit von weniger als 600 &amp; mgr;. </li><li> Durchfluss verwerfen und füllen Sie die Ultrazentrifugenfiltereinheit mit frischen SDS-Extraktionslösung. </li><li> Zentrifugieren Sie die Filtereinheit für einen weiteren 45 min bei 3270 x g. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.11 und 2.12 noch zweimal. Sicherzustellen, das Endvolumen in der Ultrazentrifugen-Filtereinheit beträgt höchstens 600 &amp; mgr; l am Ende der letzten Schleudern. </li><li> An diesem Punkt gespalten das Konzentrat in zwei. Eine Fraktion wird für die DNA-Niederschlag und der andere für die Proteinfällung werden. Anmerkung: Die Fraktionierung Menge hängt von der Menge an Biomasse, die gefiltert wurde, und dem beabsichtigten Verwendungszweck der Produkte. In unserem Fall teilen wir das Konzentrat mit 10% gegenüber DNA-Niederschlag und 90% gegenüber Proteinfällung. </li></ol> 3. Proteinniederschlag <ol><li> In 4 Volumina Methanol: Aceton (50:50) mit einem Volumen von Konzentrat und Vortex für 10 Sekunden. Inkubieren über Nacht bei -20 ° C. </li><li> Spin down bei 17.000 × g für 30 min. Den Überstand umfüllenund lassen Sie das Pellet trocken in einem Speedvac 1 Stunde (oder bis trocken) (kann nicht sichtbar sein). Hinweis: Nicht über das Pellet trocknen, da dies es schwierig, wieder zu suspendieren machen kann. </li><li> Aussetzen des Pellets in 25 ul SDS-Extraktionslösung. Lassen Sie sitzen für eine Stunde dann durch Auf- und Abpipettieren resuspendiert. </li><li> Quantifizierung Protein unter Verwendung eines Protein-Assay-Kit und den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 4. DNA-Niederschlag <ol><li> In SDS-Extraktionslösung auf den Konzentratfraktion, für DNA-Niederschlag, bis die 500 ul Zeichen verwendet werden. Dieser Schritt besteht einfach darin, das Volumen der Lösung zu erhöhen, so dass es leichter zu handhaben. </li><li> In 0.583 Bände eines Proteins Fällungsreagenz (wie dem MPC-Protein Fällungsreagenz) und Vortex für 10 Sekunden. Sie sollten einen weißen Niederschlag Form zu sehen. Anmerkung: Wir haben auch Phenol: Chloroform-DNA-Extraktionsverfahren, aber es ist schwieriger aufgrund der geringen Volumina. Wir erhalten eine bessere DNA-Ausbeuten unter Verwendung derMPC Protein Precipitation Reagent. </li><li> Zentrifuge bei 17.000 × g und 4 ° C für 10 min. </li><li> Überstand in einem anderen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und fügen 0,95 Volumina Isopropanol. Kehren 30-40 mal. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 4 ° C bei maximaler Geschwindigkeit. </li><li> Dekantieren Sie vorsichtig und den Überstand verwerfen. </li><li> Spülung zweimal mit 750 ul 70% Ethanol. </li><li> Entfernen Sie so viel Ethanol wie möglich durch Pipettieren, dann lassen Sie an der Luft trocknen. Hinweis: Nicht über die DNA zu trocknen, da dies es schwierig, wieder zu suspendieren machen kann. </li><li> Resuspendiere in 25 ul TE niedriger Puffer, pH 8 (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA). </li><li> Quantifizierung der DNA unter Verwendung eines dsDNA Assay-Kit und den Anweisungen des Herstellers. Führen Agarose-Gel (1%) Elektrophorese auf 3 ul der DNA, um seine Qualität zu überprüfen. </li></ol> 5. SDS-PAGE-Gel von Proteinen <ol><li> Vorbereitung Probenpuffer (950 &amp; mgr; l Laemmli-Probenpuffer und 50 &amp; mgr; l β-Mercaptoethanol). &lt;/ li&gt; <li> Hinzufügen des entsprechenden Volumens von 15 ug Protein oder ein Maximum von 20 ul bis gleiches Volumen Probenpuffer hinzu und kocht 4 min. Proben können nun bei -80 ° C gelagert, bis SDS-PAGE durchgeführt werden kann. </li><li> Herstellung von 10% Acrylamid-Trenngel mit einer 5% Acrylamid-Sammelgel. </li><li> Legen Sie das Gel mit Proben und 4 &amp; mgr; l eines Proteins Leiter. Führen Sie das Gel bei konstanten 120 V bis 250 kDa Leiter Marker hat gerade erreichte das Trenngel. </li><li> Fleck des Gels mit Coomassie-Beize nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 6. In-Gel-Trypsin Digest und Peptid-Extraktion Hinweis: Alle Schritte von hier bis 6.10 werden in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt, um eine Kontamination zu minimieren. <ol><li> Schneiden Sie überschüssiges Gel unter der 10 kDa Leiter Zeichen für jede Spur. Jede Spur wird auf dem MS / MS getrennt analysiert werden. Schneiden Sie jede Spur in 1 mm x 1 mm Quadrate, um die Oberfläche zu vergrößern und legen Sie alle squares von der Fahrspur in einen Niederbindemikrozentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie dies für alle Spuren. (1% ige Essigsäure verwendet werden, um das Gel nicht austrocknen und schwer zu schneiden zu vermeiden). Hinweis: Die Minimierung Verunreinigungen ist entscheidend in dieser Phase, so gel Slicing in einer biologischen Sicherheitswerkbank auf dem Glas SDS-PAGE-Gel-Form verwendet wird, um das Gel zu machen durchgeführt. </li><li> De-Flecken- <ol><li> Dispense 50 ul 100 mM Ammoniumbicarbonat in jedem Low-Bindungsröhre, in der Nähe Kappe und bei 37 ° C für 10 min. </li><li> Dispense 50 ul Acetonitril, in der Nähe Kappe und bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Absaugen und entsorgen Sie 150 ul. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6.2.1 und 6.2.2. </li><li> Absaugen und entsorgen 95 &amp; mgr; l. </li></ol></li><li> Entwässerung <ol><li> Dispense 50 ul Acetonitril, nahe Kappe und warten Sie 5 Minuten. Absaugen und entsorgen 45 &amp; mgr; l und warten Sie 10 min. </li></ol></li><li> Reduktion <ol><li> Geben Sie 50 &amp; mgr; l DTT (10 mM, 100 mM verdünnt ammOnium-Bicarbonat), in der Nähe Kappe und warten 30 Minuten bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Alkylierung <ol><li> Dispense 50 ul Iodacetamid (55 mM, 100 mM Ammoniumbicarbonat verwässert), in der Nähe Kappe und warten Sie 20 min bei 37 ° C. </li><li> Dispense 100 ul Acetonitril, nahe Kappe und Inkubation für 5 min bei 37 ° C. Absaugen und entsorgen Sie 195 ul. </li></ol></li><li> Wash <ol><li> Dispense 50 ul Ammoniumbicarbonat, nahe Kappe und Inkubation für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Dispense 50 ul Acetonitril, in der Nähe Kappe und bei 37 ° C für 5 min. Absaugen und entsorgen Sie 120 ul. </li></ol></li><li> Entwässerung <ol><li> Dispense 50 ul Acetonitril, nahe Kappe und warten Sie 5 Minuten. Absaugen und entsorgen 45 &amp; mgr; l. </li><li> Dispense 50 ul Acetonitril, warten Sie 5 Minuten. </li><li> Absaugen und entsorgen 75 ul und warten Sie 5 Minuten. </li></ol></li><li> Verdauung <ol><li> Verzichten 25-30 ul von 6 ng / ul Trypsin (until alle Gelfragmente abgedeckt sind). Schließen Kappe und warten Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren über Nacht (4,5 hr Minimum) bei 37 ° C. </li><li> Lassen Sie sitzen bei Raumtemperatur für 30 min. </li></ol></li><li> Extraktion und Peptidtransfer <ol><li> Dispense 30 ul Extraktionslösung und Deckel mit Deckel für 30 Minuten auf Eis. </li><li> Saugen Sie 30 ul und verzichten saugte Volumen in einem neuen markierten Tiefbindungsrohr. </li><li> Verzichtet werden 12 &amp; mgr; l Extraktionslösung und 12 ul Acetonitril in das ursprüngliche Rohr (mit Gel). Schließen Kappe und Inkubation für 30 min auf Eis. </li><li> Saugen Sie 15 ul und Einlagen in die neue Röhre. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte (6.9.3 und 6.9.4). </li></ol></li><li> Legen Sie neue Rohre in einem SpeedVac bis trocken. </li><li> Resuspendiere in 50 ul Resuspensionslösung. Vortex auf Medium für 10 Minuten, um wieder zu suspendieren. </li><li> Pipette Peptidlösung entweder nano / LC Fläschchen oder 96-Well-Platten geeignet für Nano / LCMS / MS-Arbeit. </li></ol>

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<li>Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+environmental+sequences+using+MEGAN4%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.</a> Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Probenkonservierung ist der Schlüssel zur metaproteomic Studien und früheren Arbeiten gezeigt, dass ein RNA-Stabilisierungslösung ist eine nützliche Speicherpuffer zum Speichern von Zellen vor der Proteinextraktion 28. Idealerweise würden Proben in situ erhalten werden, um Verschiebungen in der Protein-Expression während der Handhabung 33,34 negieren. In der Tat, in situ Probenahme und Fixierungstechniken sind entwickelt worden, die für die autonome Sammlung und Aufbewahrung von P...

Mikroorganismen sind allgegenwärtig und spielen eine essentielle Rolle in der Erde biogeochemischen Kreisläufen 1. Derzeit gibt es zahlreiche Ansätze zur Charakterisierung von molekularen mikrobiellen Gemeinschaft Struktur und Funktion zur Verfügung. Am häufigsten ist die Analyse der 16S-rRNA-Gensequenzen aus Umwelt-DNA 2 PCR-amplifizierte - 4. Ein Nachteil des 16S-rRNA-Gen-Analyse ist, dass es nur gibt Auskunft über phylogenetische Identität und Gemeinschaftsstruktur, mit wenig Informationen über die Stoffwechselfunktion. Im Gegensatz dazu Ansätze wie Metagenomik, metatranscriptomics und Metaproteomik Informationen über Community-Struktur und den Stoffwechsel. Metagenomik, oder die Analyse der Gen-Gehalt von einer Ansammlung von Organismen, bietet Informationen über die Struktur und funktionelle Potential der Community 5-8. Obwohl stark, kann dies Funktionspotenzial nicht auf die Stoffwechsel entsprechenAktivitäten der Organismen. Eines Organismus Genotyp von den Genen, von denen jeder zu RNA transkribiert werden und weiter zu Protein translatiert wird, was zu einem Phänotyp repräsentiert. Somit, um das Verständnis der mikrobiellen funktionelle Aktivität in einer Umgebung zu unterstützen, sollte postgenomische Analyse durchgeführt 9 werden. Metatranscriptomics oder die Analyse von RNA-Transkripten ist nützlich, weil es zeigt, welche Gene in einer bestimmten Umgebung transkribiert werden. Jedoch mRNA-Niveaus nicht immer ihre entsprechenden Proteinniveaus entsprechen aufgrund Translationsregulation, RNA-Halbwertszeit und der Tatsache, dass Mehrfachkopien-Protein kann für jede mRNA 10 erzeugt werden. Aus diesen Gründen Metaproteomik wird jetzt als ein wichtiges Instrument zur Umweltmikrobiologie anerkannt. Gemeinsame metaproteomic Analysen verwenden eine Schrotflinte Proteomics Ansatz, wo die in der Nähe vollen Ergänzung der Proteine, die in einer komplexen Probe werden in der Regel durch en gereinigt und gleichzeitig analysiert,enzymatische Verdauung in Peptide und Analysen zu einem Massenspektrometer. Nachfolgende Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) &quot;Peptid-Fingerprinting&quot; wird verwendet, um die Peptidsequenz und potentiellen Proteinherkunfts durch Proteindatenbanksuche (für eine Übersicht siehe 11) zu bestimmen. Proteom-Arbeit hat einen langen Weg in den letzten 25 Jahren dank der Zunahme der genomischen Datenverfügbarkeit und der Erhöhung der Empfindlichkeit und Genauigkeit von Massenspektrometern so dass für Hochdurchsatz-Protein Identifizierung und Quantifizierung 11,12 kommen. Da Proteine ​​sind das Endprodukt der Genexpression kann metaproteomic Daten helfen, festzustellen, welche Organismen in einem bestimmten Umfeld und welche Proteine ​​sie ausdrücken aktiv sind. Dies ist vorteilhaft, wenn versucht wird, zu bestimmen, wie ein bestimmter Satz von Umgebungsvariablen den Phänotyp des Organismus oder Gemeinde betreffen. Schon früh, MS / MS-basierte metaproteomic Studien im Ozean wurden verwendet, um spezifische Proteine ​​gezielt zu identifizierenmikrobielle Abstammungslinien, wobei die erste Studie über die Licht angetrieben Protonenpumpen Proteorhodopsin in SAR11 Meeresbakterien 13. In jüngerer Zeit wurden vergleichende Analysen metaproteomic differentiellen Proteinexpressionsmuster zwischen komplexen Gemeinschaften erläutert. Beispiele hierfür sind die Identifizierung von zeitlichen Verschiebungen im Stoffwechsel in der Küsten Nordwest-Atlantik 14 oder der Antarktischen Halbinsel 5. Andere Studien haben Schwankungen der Proteinexpressionsmuster auf räumlichen Skalen von einem nährstoffarmen Ozean gyre zu einer hoch produktiven Küstenauftriebssystem 15 beschrieben, zum Beispiel entlang einer geographischen Transekt. Für weitere Bewertungen von Metaproteomik empfehlen wir Schneider et al. (2010) 9 und Williams et al. (2014) 16. Gezielte Proteomik ist in den letzten Jahren verwendet worden, um die Expression von spezifischen Stoffwechselwege in die Umgebung 17,18 quantifizieren. There sind drei Hauptphasen in metaproteomic Analyse. Die erste Phase ist die Probenvorbereitung, die Probenentnahme, die Zelllyse und die Konzentration des Proteins umfasst. Probensammlung in Marine Mikrobiologie häufig mit der Filtration von Meerwasser durch einen Vorfilter zu größeren eukaryotischen Zellen, Partikel und Partikel-assoziierten Bakterien zu entfernen, gefolgt von Filtration, für die Abscheidung von frei lebenden Mikrobenzellen, die üblicherweise mit der Verwendung eines 0,22 um Patrone Filtereinheit 19,20. Diese Filter werden in einem Plastikzylinder hüllt und eine Zelllyse und Proteinextraktionsprotokoll, das innerhalb der Filtereinheit durchgeführt werden kann, wäre ein wertvolles Werkzeug ist. Einmal Biomasse erhalten wird, müssen die Zellen lysiert werden, um die Proteinextraktion zu ermöglichen. Mehrere Verfahren können verwendet werden, einschließlich Guanidin-HCl-Lyse 21 und Natriumdodecylsulfat (SDS) basierte Lyseverfahren. Obwohl Detergenzien wie SDS sind sehr effizient bei stören Membranen und Solubilisieren vielen Proteinarten, concentrations von nur 0,1% kann mit nachgeschalteten Proteinverdauung und MS-Analyse 22 stören. Wichtiges Anliegen ist die negative Wirkung von SDS auf Trypsinverdau Effizienz, Auflösungsvermögen von Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie und Ionensuppression oder Ansammlung innerhalb der Ionenquelle 23. Die zweite Phase ist die Fraktionierung und Analyse, wo Proteine ​​einer enzymatischen Verdauung, gefolgt von LC MS / MS-Analyse unterzogen, was zu einer m / z-Fragmentierungsmuster, das verwendet werden kann, um die primäre Aminosäuresequenz des ursprünglichen tryptischen Peptids festzustellen. In Abhängigkeit von den Arten von Waschmitteln, sowie die nachgeschaltete Massenspektrometrie Workflow verschiedene Aufschlußmethoden durchgeführt werden. In unserem Protokoll wird 1-D-PAGE-Elektrophorese, gefolgt von Entfernung von SDS aus dem Gel, um jegliche Verunreinigungen zu entfernen Detergens verwendet wird. Die Analyse von Proteinen, die schwer zu solubilisieren, wie Membranproteine ​​sind, erfordert die Verwendung von hohen Konzentrationen von SDS oder andere Reinigungsmittel. Dies führt zu Kompatibilitätsprobleme mit SDS-Gelelektrophorese. Wenn das Ziel einer Studie erfordert die Solubilisierung dieser schwer Proteine ​​löslich, kann das Rohr-Gel-System verwendet werden 22,24. Das Rohr-Gel-Verfahren enthält Proteine ​​innerhalb der Gel-Matrix ohne die Verwendung von Elektrophorese. Anschließend jegliche Detergenzien zur Solubilisierung verwendet werden, bevor die Proteinverdauung entfernt. Die dritte Phase ist die Bioinformatik-Analyse. In dieser Phase werden die MS / MS Peptid Daten werden mit einer Datenbank von setzten Nukleotidsequenzen durchsucht, um festzustellen, welche Peptide und Proteine ​​in der Probe vorhanden sind. Die Identifizierung von Peptiden ist von der Datenbank gegen gesucht. Meeres metaproteomic Daten werden häufig gegen Datenbanken von Referenzgenome, Metagenom-Daten wie die Global Ocean Sampling-Datensatz 25, ebenso wie einzelne Zelle verstärkt Genome von unkultivierten li umfasst gesuchtneages 26,27. Proteinidentifikation kann auch durch den Einschluss von metagenomic Sequenzen aus der gleichen Probe erhöht, wenn der metaproteomic Daten wurden 5 abgeleitet werden. Hier stellen wir ein Protokoll für die Erzeugung von Peptiden geeignet für MS / MS-basierte Analyse von mikrobiellen Biomasse durch Filtration gesammelt und in einem RNA-Stabilisierungslösung gelagert. Das hier beschriebene Protokoll erlaubt DNA und Protein, von der gleichen Probe, so dass alle Schritte, die zu dem Protein und DNA Fällungen identisch sind, isoliert werden. Aus praktischer Sicht wird weniger Filtration erforderlich, da nur ein Filter ist sowohl für Protein und DNA-Extraktion erforderlich. Wir möchten auch, um zu bestätigen, dass dieses Protokoll wurde durch die Kombination, die Anpassung und Änderung von zwei bisher veröffentlichten Protokollen erstellt. Zelllysis Schritte von Saito et al (2011) 28 angepasst. Und die In-Gel-Trypsin-Verdauung Komponente aus Shevche angepaßtNKO et al. (2007) 29.

<table><tbody><tr><td>Sterivex -GP 0,22 μm m Filtereinheit</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td>Probenahme</td></tr><tr><td>RNAlater Stabilisierungslösung</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td>Probenahme</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1 oder TB0196-500G</td><td>Proteinextraktion / SDS PAGE Gel</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>Proteinextraktion</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio Basic</td><td>15-21-3</td><td>Proteinextraktion / SDS PAGE Gel</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Basic</td><td>6381-92-6</td><td>Proteinextraktion</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td>Proteinextraktion</td></tr><tr><td>10K Amicon Filter</td><td>Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Proteinextraktion</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-4L</td><td>Proteinfällung</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-64-1</td><td>Proteinfällung</td></tr><tr><td>MPC Protein Fällungsreagenz</td><td>Epizentrum</td><td>mmP03750</td><td>DNA-Fällung</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td>DNA-Fällung</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>DNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>Qubit Protein Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q33211</td><td>Proteinquantifizierung</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Bio Basic</td><td>57-50-1</td><td>SDS PAGE Gel</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio Rad</td><td>161-0800</td><td>SDS PAGE Gel</td></tr><tr><td>APS</td><td>Bio Rad</td><td>161-0700</td><td>SDS PAGE Gel</td></tr><tr><td>30% Acrylamid</td><td>Bio Rad</td><td>161-0158</td><td>SDS PAGE Gel</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>SDS PAGE Gel</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Bio Rad</td><td>161-0718</td><td>SDS PAGE Gel</td></tr><tr><td>B-mercaptoethanol</td><td>Bio Basic</td><td>60-24-2</td><td>SDS PAGE Gel</td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio Rad</td><td>161-0737</td><td>SDS PAGE Gel</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder</td><td>Bio Rad</td><td>161-0375EDU</td><td>SDS PAGE Gel</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>VWR</td><td>CABDH6044-4</td><td>In-Gel Trypsin Aufschluss</td></tr><tr><td>NH4HCO3</td><td>Bio Basic</td><td>1066-33-7</td><td>In-Gel Trypsin Aufschluss</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>In-Gel Trypsin Aufschluss</td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507-500ML</td><td>In-Gel Trypsin Aufschluss</td></tr><tr><td>HPLC-Qualität H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-4L</td><td>In-Gel Trypsin Aufschluss</td></tr><tr><td>Iodacetamid</td><td>Bio Basic</td><td>144-48-9</td><td>In-Gel Trypsin Aufschluss</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>In-Gel Trypsin Verdau</td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>Gel Trypsin Aufschluss</td></tr><tr><td>2 ml ROBO Fläschchen 9 mm</td><td>Candian Life Science</td><td>VT009/C395SB</td><td>In-Gel-Trypsin-Verdau</td></tr><tr><td>PP BM-Einsatz, keine Feder</td><td>Candian Life Science</td><td>4025P-631</td><td>In-Gel-Trypsin-Aufschluss</td></tr></tbody></table>

ein aquatic microbial metaproteomik workflow: von der zelle zum tryptischen peptide geeignet für tandem-massenspektrometrie-basierte analyse

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Meta-omische Technologien wie Metagenomik, Metatranskriptomik und Metaproteomik können zum Verständnis der Struktur und des Stoffwechsels der mikrobiellen Gemeinschaft beitragen. Die Metagenomik allein ist zwar leistungsfähig, kann aber nur das funktionelle Potenzial aufklären. Andererseits ermöglicht die Metaproteomik die Beschreibung des exprimierten in situ Stoffwechsels und der Funktion einer Gemeinschaft. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Zelllyse, die Protein- und DNA-Isolierung sowie den Peptidverdau und die Extraktion aus marinen mikrobiellen Zellen, die auf einer Patronenfiltereinheit (z. B. der Sterivex-Filtereinheit) gesammelt und in einer RNA-Stabilisierungslösung (wie RNAlater) konserviert wurden. In massenspektrometrischen Proteomik-Studien erfolgt die Identifizierung von Peptiden und Proteinen durch den Vergleich von Peptid-Tandem-Massenspektren mit einer Datenbank translatierter Nukleotidsequenzen. Die Aufnahme des Metagenoms einer Probe in die Suchdatenbank erhöht die Anzahl der Peptide und Proteine, die anhand der Massenspektren identifiziert werden können. Daher wird bei diesem Protokoll DNA aus demselben Filter isoliert, der anschließend für die metagenomische Analyse verwendet werden kann.

Als Demonstration, das Protokoll führten wir auf zwei Meerwasserproben von der Oberfläche und der Chlorophyllmaximum des Küsten Ozean in Nord-Kanada gesammelt. Auf See wurde 6-7 L des Meerwassers durch eine 3 &amp; mgr; GF / D-Vorfilter geleitet, dann mikrobiellen Zellen wurden auf eine 0,22 um-Patronenfiltergerät nach dem Protokoll von Walsh et al. 20 gesammelt. Zellen wurden sofort in einem RNA-Stabilisierungslösung bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Nach der Rückkehr in das Labor, das Protoko...

Dieses Protokoll ist für die Extraktion und Konzentration von Protein und DNA aus mikrobieller Biomasse, die aus Meerwasser gesammelt wurde, gefolgt von der Erzeugung von tryptischen Peptiden, die für die Tandem-Massenspektrometrie-basierte Proteomanalyse geeignet sind.

Ein Aquatic Microbial Metaproteomik Workflow: Von der Zelle zum tryptischen Peptide Geeignet für Tandem-Massenspektrometrie-basierte Analyse

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

Das Ziel dieses Verfahrens ist die Extraktion von Protein und DNA aus mikrobieller Biomasse aus Meerwasser, gefolgt von der Erzeugung tryptischer Peptide für die proteomische Analyse mittels Tandem-Massenspektrometrie. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen lysiert werden, die zuvor auf einem Kartuschenfilter angereichert wurden. Der zweite Schritt besteht darin, das Zelllysat mithilfe von Ultra-Zentrifalfiltereinheiten zu konzentrieren.Anschließend wird das Lysat in zwei Fraktionen aufgeteilt, eine für die Proteinfällung und eine für die DNA-Fällung. Im letzten Schritt erfolgt die In-Gel-Trypsinverdauung der Proteine und die Extraktion von Peptiden, die für die Flüssigkeitschromatographie und die Tandem-Massenspektrometrie-Analyse geeignet sind. Letztendlich kann mittels nachfolgender bioinformatischer Analyse die Expression von Proteinen in der Probe identifiziert werden, während die isolierte DNA für die metagenomische und/oder 16S-rRNA-Gen-Analyse verwendet werden kann.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sowohl Protein als auch DNA gleichzeitig aus derselben Probe isoliert werden können. Zunächst wird die RNA-Stabilisierungslösung mithilfe einer 60-Milliliter-Spritze, die am Luer-Lock-Ende der Filterzentrifuge befestigt ist, aus der Kartuschenfiltereinheit in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ausgestoßen. Anschließend wird das 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen 10 Minuten lang bei 17.000 × g zentrifugiert, um zelluläre Bestandteile als Pellet abzutrennen. Danach wird das Überstand in eine 10-K-Ultra-Zentrifugalfiltereinheit überführt, um Proteine aufzufangen, die aus Zellen stammen, die in der Probe lysiert haben.Verwerfen Sie das Pellet nicht. Zentrifugieren Sie die Ultra-Zentrifugalfiltereinheit bei 3.270 × g für 30 Minuten oder bis das Volumen auf etwa 600 Mikroliter reduziert ist. In der Zwischenzeit schmelzen Sie die Spitze einer P-10-Spitze an und verschließen Sie die Seite der Kartuschenfiltereinheit ohne Luer-Lock mit dem offenen Ende der Spitze.Dadurch wird sichergestellt, dass während der folgenden Schritte kein Extraktionspuffer und keine Biomasse entweichen. Den Pellet in einem Milliliter SDS-Extraktionslösung suspendieren und mit einer Pipette in die ursprüngliche Kartuschenfiltereinheit überführen. Die einfachste Methode, um in die Kartuschenfiltereinheit zu pipettieren, besteht darin, eine P200-Spitze auf eine P1000-Spitze zu stecken und diese Doppelspitze zum Pipettieren zu verwenden. Ein zusätzliches Milliliter SDS-Extraktionslösung zur Kartuschenfiltereinheit hinzufügen, sodass das Gesamtvolumen etwa zwei Milliliter beträgt.Para-Folie. Das Lure-Lock-Ende der Kartuschenfiltereinheit schließen und die Kartuschenfiltereinheit in das 50-Milliliter-Röhrchen geben. Danach drei zerknüllte Laborwischtücher auf den Boden eines 50-Milliliter-Konusröhrchens legen.Schließen Sie den Deckel und geben Sie das Röhrchen in den Hybridisierofen, um es 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Rühren zu inkubieren. Nach 10 Minuten platzieren Sie den Filter auf einem Schaumstoffschwimmer und sichern ihn mit einer 5-Milliliter-Spritze am Luer-Lock-Ende. Laden Sie auf und inkubieren Sie 15 Minuten in einem Wasserbad bei 95 Grad Celsius. Lassen Sie anschließend die Kartuschenfiltereinheit abkühlen und eine Stunde bei Raumtemperatur unter Rühren rotieren. Sobald sie abgekühlt ist, drücken Sie die SDS-Extraktionslösung (Zelllysat) mit einer 60-Milliliter-Spritze aus dem Filter in dieselbe Ultra-Zentrifalfiltereinheit.Wie zuvor einen Milliliter frische SDS-Extraktionslösung zur Kartuschenfiltereinheit hinzufügen und 30 Sekunden lang per Hand mischen. Anschließend den Inhalt des Filters mit der 60-Milliliter-Spritze in die Ultra-Zentrifalfiltereinheit auspressen, um den Filter auszuwaschen und sicherzustellen, dass alle Proteine entfernt und gesammelt wurden. Die Ultra-Zentrifalfiltereinheit 45 Minuten bei 3.270 × g zentrifugieren, oder bis das Volumen in der Filtereinheit weniger als 600 Mikroliter beträgt.Entsorgen Sie das Durchflussvolumen und füllen Sie die Ultra-Zentrifalfiltrationseinheit mit frischer SDS-Extraktionslösung auf. Zentrifugieren Sie die Filterspitze weitere 45 Minuten bei 3.270 × g, bevor Sie diesen Schritt insgesamt zweimal wiederholen. Stellen Sie sicher, dass das Endvolumen in der Ultra-Zentrifalfiltrationseinheit nach dem letzten Zentrifugationsschritt maximal 600 Mikroliter beträgt.Messen Sie an dieser Stelle das Volumen des Konzentrats und teilen Sie es in zwei Hälften. Ein Anteil wird für die DNA-Präzipitation verwendet, der andere für die Proteinpräzipitation. Für die Proteinpräzipitation geben Sie vier Volumina Methanol und Aceton im Verhältnis 50 zu 50 zu einem Volumen Konzentrat hinzu, wirbeln 10 Sekunden lang und inkubieren über Nacht bei minus 20 Grad Celsius.Am nächsten Tag die Mischung bei 17.000 × g 30 Minuten lang zentrifugieren, nach dem Abgießen des Überstandes das Pellet eine Stunde im Speed-Vac trocknen lassen. Das Pellet nicht übermäßig trocknen, da es sonst schwer wieder aufnehmbar sein könnte.Suspendieren Sie das Pellet in 25 Mikrolitern SDS-Extraktionslösung. Lassen Sie es eine Stunde lang stehen und resuspendieren Sie es anschließend durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Führen Sie die SDS-Gelelektrophorese an den Proteinen gemäß dem schriftlichen Protokoll durch, arbeiten Sie dabei in einem biologischen Sicherheitswerkbank, um Kontaminationen zu minimieren, und schneiden Sie das überschüssige Gel unterhalb der 10-Kilodalton-Linie für jede Spur ab.Jede Spur wird an einem Tandem-Massenspektrometer analysiert. Schneiden Sie jede Spur separat in Quadrate von einem Millimeter mal einem Millimeter, um die Oberfläche zu vergrößern, und geben Sie alle Quadrate der Spur in ein Low-Binding-Mikrozentrifugenröhrchen. Um zu verhindern, dass das Gel austrocknet und schwer schneidbar wird, kann 1 %ige Essigsäure verwendet werden; wiederholen Sie dies für alle Spuren.Fahren Sie mit der in-Gel-Trypsinverdauung und Peptidextraktion wie im Textprotokoll beschrieben fort, oder führen Sie eine DNA-Fällung im SDS-Extraktionslösungsschritt bis zur Konzentratfraktion durch, die für die DNA-Fällung bis zur Marke von 500 Mikrolitern verwendet wird. Dieser Schritt dient lediglich dazu, das Volumen der Lösung zu erhöhen, wodurch die Handhabung erleichtert wird. Danach geben Sie 0,583 Volumina eines Proteinfällungsreagenzes, wie beispielsweise des MPC-Proteinfällungsreagenzes, hinzu und wirbeln die Probe kräftig im Vortex. Zentrifugieren Sie 10 Sekunden lang eine weiße Niederschlagsform bei 17.000 × g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Nach der Zentrifugation überführen Sie das Überstand in ein anderes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und geben 0,95 Volumina Isopropanol hinzu, das 30 bis 40 Mal invertiert wird, bevor es 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert wird. Anschließend den Überstand vorsichtig dekantieren und verwerfen. Danach den Pellet zweimal mit 750 Mikrolitern 70 %igem Ethanol waschen.Entfernen Sie so viel Ethanol wie möglich durch Pipettieren und lassen Sie das Pellet anschließend an der Luft trocknen. Trocknen Sie die DNA nicht zu stark aus, da dies die Wiederaufnahme erschweren kann. Suspendieren Sie das Pellet in 25 Mikrolitern Puffer LT, pH 8.Quantifizieren Sie die DNA mithilfe eines doppelsträngigen DNA-Assay-Kits und gemäß den Herstelleranweisungen. Führen Sie außerdem eine Agarose-Gelelektrophorese mit drei Mikrolitern der DNA durch, um deren Qualität zu überprüfen. Die Peptide wurden einer Tandem-Massenspektrometrie-Analyse unterzogen. Pro Probe wurden über 23.000 Spektren generiert, anhand derer Peptide und Proteine identifiziert wurden.Die taxonomische und funktionelle Zusammensetzung der Metaproteome wurde mithilfe einer Kombination aus BlastP und dem Metagenom-Analysator untersucht. Proteine, die Alpha-Proteobakterien zugeordnet wurden, waren im Datensatz am stärksten vertreten. Der überwiegende Teil davon wurde der SAR11-Klade zugeordnet.Die Roter-Klade der Alpha-Proteobakterien war ebenfalls stark vertreten und wurde identifiziert. Am häufigsten in Oberflächengewässern. Proteine, die bakteriellen Krankheiten zugeordnet wurden, waren gleichmäßig zwischen der Oberfläche und dem Chlorophyll-Maximum verteilt, aber Proteine von Flügelbakterien wurden stärker im Chlorophyll-Maximum nachgewiesen.Gamma-Proteobakterien-Proteine waren gleichmäßig in der Wassersäule verteilt, während Beta-Proteobakterien-Proteine vorwiegend an der Oberfläche gefunden wurden. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von drei Tagen durchgeführt werden.

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