Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den klassischen Yamanaka-iPS-Ansatz zu verkürzen, indem direkt induzierte neuronale Vorläuferzellen aus einer Hautbiopsie eines Patienten für therapeutische Anwendungen erzeugt werden. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Stanzbiopsie vom Patienten entnommen wird, um primäre Fibroblasten zu gewinnen, die in vitro kultiviert werden können. Der zweite Schritt besteht darin, die kultivierten Fibroblasten zu vermehren und anschließend mit Viren zu infizieren, die Reprogrammierungsfaktoren kodieren, um eine transdifferenzierung zu induzieren.

Anschließend müssen die mutmaßlich umgewandelten induzierten neuronalen Vorläuferzellen oder INPC-Kolonien etwa 20 Tage nach der Infektion durch visuelle Überprüfung sorgfältig ausgewählt und anschließend durch manuelles Picken isoliert werden. Der letzte Schritt besteht darin, die IPCs monoklonal zu erweitern, indem sie in einem neuronalen Induktionsmedium kultiviert werden; abschließend erfolgt eine gezielte in-vitro-Differenzierung, und die Immunfluoreszenzmikroskopie wird eingesetzt, um nachzuweisen, dass die direkt umgewandelten, patienteneigenen IPCs in der Lage sind, sich in neuronale sowie gliale Zellen zu differenzieren, wodurch sie eine nahezu unbegrenzte Quelle für biomedizinische Anwendungen darstellen. Der Vorteil dieser direkten Umwandlungstechnik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Yamanaka-artigen Herstellung induzierter pluripotenter Stammzellen und deren anschließender Differenzierung, ist zweifach.

Die Umwandlung von DI in multipotente induzierte neurale Stammzellen, die wir INS-Zellen nennen, ist nicht nur deutlich schneller, sondern auch sicherer. Somit wird durch das Transdifferenzierungsverfahren die Erzeugung patientenspezifischer Zellen für therapeutische Anwendungen weitaus zugänglicher, und das Risiko der Tumorbildung ist im Vergleich zu iPS-Zellen erheblich geringer. Dadurch können wir nun zwei wesentliche Hindernisse der regenerativen Medizin heutzutage überwinden.

Das ist klinische Sicherheit und Effizienz. Beginnen Sie die Stanzbiopsie, indem Sie die Haut des Patienten desinfizieren und die Hautstelle, an der die Biopsie entnommen wird, mit 0,5 bis einem Milliliter Mepivacainhydrochlorid intrakutan betäuben. Entnehmen Sie die Hautbiopsie mit einer sterilen 3-mm-Biopsiestanze.

Spülen Sie die Biopsie mit Dobe Echo's Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung oder DPBS plus einem Mikroliter pro Milliliter Gentamycin. Entfernen Sie das Fett von der Biopsie mit einem Skalpell und einer Pinzette. Anschließend spülen Sie die Biopsie noch zweimal mit dem Puffer, bevor Sie sie vollständig aspirations.

Bedecken Sie die Biopsie mit Dis-Paste Two und inkubieren Sie sie 16 bis 18 Stunden bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation aspirieren Sie die Dis-Paste Two vollständig, bevor Sie die Biopsie zweimal mit DPBS waschen. Entfernen Sie die Epidermis mit einer Pinzette und waschen Sie die Biopsie anschließend noch zweimal mit DPBS.

Fügen Sie anschließend zwei Milliliter Kollagenase Typ zwei hinzu und überführen Sie die Probe in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Füllen Sie Kollagenase bis zu einem Gesamtvolumen von fünf Milliliter auf. Inkubieren Sie das Gesamtvolumen 45 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten bei 180 × g und entsorgen Sie danach den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter DMEM-Fötenkälberserum-Gentamycin-Medium, bevor Sie die Probe erneut fünf Minuten bei 180 × g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1,5 Milliliter des gleichen Mediums. Überführen Sie die Probe anschließend in einen T-25-Anheftungs-Gewebekulturflasche und inkubieren Sie bei 37 °C und 5 % CO2. Wechseln Sie das Medium alle drei Tage, nach ungefähr zwei Wochen.

Sobald die Zellen die Hautanteile umwachsen haben, die Zellen mit Trypsin-EDTA wie im Textprotokoll beschrieben aufspalten. Vermehren Sie die Zellen weiter, indem Sie alle drei Tage das Medium wechseln und die Zellen bei Konfluenz aufspalten. Nachdem Mykoplasmakontamination durch Standardtests ausgeschlossen wurde, bereiten Sie die Zellen für das Direktumwandlungs-Experiment vor, indem Sie die Zellen einmal mit DPBS waschen, dann das DPBS abpipettieren und 2,5 Milliliter Trypsin-EDTA hinzufügen. Nach einer fünfminütigen Inkubation der Zellen bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2, klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen zu lösen.

Suspendieren Sie die Zellen in 2,5 Milliliter Fibroblastenmedium und überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 180 × g für fünf Minuten und aspirieren Sie das Überstand. Suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Fibroblastenmedium und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um eine Einzelzell-Suspension zu erzeugen.

Die Anzahl der Zellen mithilfe einer Zellzählkammer vor dem Ansäen bestimmen. 30.000 Zellen pro Vertiefung. In einer 24-Loch-Platte die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren. Schritte, bei denen mit Virus gearbeitet wird, müssen in einem biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, wobei geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen wird, einschließlich einer chirurgischen Maske zum Schutz vor Schleimhautexposition.

Um die Infektion durchzuführen, ersetzen Sie zunächst das vorhandene Zellmedium durch 100 Mikroliter Fibroblastenmedium. Resuspendieren Sie dann aufgetaute Aliquote von T vier, KLF vier, SOX zwei und cmix Sendi-Virus in einem Milliliter Fibroblastenmedium. Geben Sie jedes Virus mit einem MOI von drei zu den Zellen und mischen Sie vorsichtig. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2. Nach 24 Stunden saugen Sie das Medium ab und geben 500 Mikroliter Neuroinduktionsmedium hinzu. Kultivieren Sie die Zellen ab jetzt bei 39 Grad Celsius, 5 % CO2, wobei Sie das Medium jeden zweiten Tag wechseln. Am sechsten Tag nach der Infektion bereiten Sie lamininbeschichtete Sechs-Loch-Platten vor.

Geben Sie ein Milliliter eines Laminins mit einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter in DPBS in sechswellige Platten und lagern Sie die Platten 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius am siebten Tag nach der Infektion; passagieren Sie die Zellen anschließend wie im Textprotokoll beschrieben mithilfe von D-P-B-S-E-D-T-A. Fügen Sie 500 Mikroliter D-M-E-M-F 12 hinzu und überführen Sie die Suspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie danach die Probe bei 180 × g für fünf Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1,5 Milliliter Neuroinduktionsmedium. Impfen Sie die Zellen in lamininbeschichtete Sechswell-Platten aus und geben Sie einen RO-Kinaseinhibitor bis zu einer Endkonzentration von 10 Mikromolar hinzu. Kultivieren Sie die Zellen bei 39 Grad Celsius und 5 % CO2, wobei das Medium ab Tag 14 jeden zweiten Tag gewechselt wird. Nach der Infektion kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2; neuroepitheliale Kolonien werden ab etwa Tag 17 nach Infektion sichtbar, wie mittels Phasenkontrastmikroskopie zu erkennen ist.

Sie sollten groß genug sein, um etwa am Tag 20 nach der Infektion ausgewählt zu werden, einen Tag vor der Auswahl beschichten Sie die 48-Well-Platte mit Laminin, wie im Textprotokoll beschrieben. Einen Tag später saugen Sie das Laminin von den Platten ab und geben 200 Mikroliter Neuroinduktionsmedium in die Vertiefungen. Waschen Sie die sechs Vertiefungen, die die auszuwählenden Kolonien enthalten, einmal mit DPBS, bevor Sie zwei Milliliter Neuroinduktionsmedium hinzufügen.

Mittels einer dünnen Nadel für jede Vertiefung einer sechswelligen Platte mechanisch die Zellen um die Kolonien herum abkratzen, um die umliegenden Zellen zu entfernen, und die Kolonien anschließend mit Pipettenspitzen aufnehmen. Dazu eine auf 50 Mikroliter eingestellte 200-Mikroliter-Pipette verwenden. Jede Kolonie in eine Vertiefung einer laminierten 48-Well-Platte überführen und durch zehnmaliges Auf- und Abpipettieren eine Einzelzell-Suspension mechanisch erzeugen.

Fügen Sie den R-Kinase-Inhibitor in einer Endkonzentration von 10 µM den Zellen hinzu. Kultivieren Sie die Zellen in der 48-Well-Platte bei 37 °C und 5 % CO2 für zwei Tage. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen.

Siehe Textprotokoll zur Ausdehnung und Kryokonservierung der IPCs zur Differenzierung der IPCs in eine neuronale Zelllinienkultur. Die Zellen auf laminatbeschichteten Platten. Wie zuvor das Medium wechseln in Neuro-Diff-Medium, wenn die Zellen etwa 70 % konfluent sind, und das Medium alle zwei Tage für drei Wochen weiter wechseln.

Teilen Sie die Zellen während der Differenzierung nach drei Wochen nicht; die Zellen sollten den neuronalen Marker TUJ1 exprimieren, um reifere Neuronen und neuronale Subtypen zu erhalten. Setzen Sie die Differenzierung bis zu drei Monate fort, um die Differenzierung von IPCs speziell in Richtung einer glialen Linie zu ermöglichen. Wechseln Sie das Medium in ein gliales Induktionsmedium, das 20 Nanogramm pro Milliliter epidermalem Wachstumsfaktor enthält, um die Differenzierung in gliale Vorläuferzellen zu induzieren.

Entfernen Sie alle zwei Tage die Hälfte des Mediums und ersetzen Sie es durch frisches Medium über einen Zeitraum von etwa zwei Wochen. Während dieser Zeit sollten die Zellen im Anschluss an Erreichen von 100 % Konfluenz im Beisein von 10 Mikromolar R-Kinase-Inhibitor im Verhältnis 1 zu 3 geteilt werden. Differenzieren Sie die Zellen durch Wechsel des Mediums in kommerziell erhältliches Astrozyten-Medium weiter zu Astrozyten, sobald die Zellen nahezu konfluent sind, und setzen Sie den Mediumwechsel alle zwei Tage fort. Etwa sieben Tage später beginnen die Zellen, Astrozyten-Marker zu exprimieren.

Wenn die Zellen während des Differenzierungsprotokolls 100 % konfluent werden, sollten sie im Verhältnis eins zu zwei geteilt werden. Bei Anwesenheit von 10 Mikromolar RO-Kinaseinhibitor führte die Infektion der Fibroblasten mit T 4K LF vier, SOX zwei und cmix Sendi-Viren und die Kultivierung unter neuroinduktiven Mediumbedingungen zu einer Veränderung der Morphologie der Fibroblasten und anschließend zur Bildung von Kolonien. 17 Tage nach der Infektion erzeugte monoklonale Zelllinien können expandiert werden und färben positiv für Marker von neuronalen Stammzellen wie SOX zwei, SOX eins Nestin und PAC sechs sowie für den Proliferationsmarker KI 67, während sie den mit Pluripotenz assoziierten Marker T vier nicht exprimieren.

Außerdem können die neuralen Vorläuferzellen durch Zugabe neuronaler Wachstumsfaktoren zum Zellkulturmedium durch Anwendung einer Astrozyten-Differenzierung in Neuronen differenziert werden. Induzierte neurale Vorläuferzelllinien können ebenfalls in gliale Linien differenziert werden, wie durch die Analyse typischer morphologischer Veränderungen und Färbungen gegen GFAP beurteilt werden kann. Durch diese direkte Umwandlung erzeugen wir multipotente induzierte neurale Vorläuferzellen aus Patienten-Fibroblasten innerhalb von drei bis vier Wochen.

Diese Zellen könnten für zahlreiche biomedizinische Anwendungen verwendet werden. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie, Diagnose und Modellierung neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson sowie anderer neurologischer Zustände.