Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den klassischen Yamanaka-IPS-Ansatz zu verkürzen, indem induzierte neurale Vorläuferzellen direkt aus der Hautbiopsie eines Patienten für therapeutische Anwendungen erzeugt werden. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Stanzbiopsie des Patienten durchgeführt wird, um primäre Fibroblastenzellen zu gewinnen, die in vitro kultiviert werden können. Der zweite Schritt besteht darin, kultivierte Fibroblasten zu vermehren und anschließend mit Viren zu infizieren, die Reprogrammierungsfaktoren kodieren, um die trans-Differenzierung zu induzieren.

Als nächstes müssen die mutmaßlich konvertierten induzierten neuralen Vorläuferzellen oder INPC-Kolonien durch visuelle Validierung sorgfältig ausgewählt und anschließend etwa 20 Tage nach der Infektion durch manuelle Entnahme isoliert werden. Der letzte Schritt besteht darin, monoklonal zu expandieren, die IPCs in Neuroinduktionsmedium zu expandieren, schließlich eine gezielte in vitro-Differenzierung sowie Immunfluoreszenzmikroskopie zu verwenden, um zu zeigen, dass die direkt umgewandelten IPCs der Patienten in der Lage sind, sich in neuronale sowie Gliazellen zu differenzieren, was sie zu einer praktisch unbegrenzten Quelle für biomedizinische Anwendungen macht. Der Vorteil dieser direkten Umwandlungstechnik gegenüber bestehenden Methoden wie der Yamanaka-Typ-Gewinnung von induzierten blauen potenten Stammzellen und deren anschließender Differenzierung ist zweifach.

Die DI-Umwandlung in multipotente induzierte Neurostammzellen, wir nennen sie INS-Zellen, ist nicht nur erheblich schneller, sondern auch sicherer. Auf diese Weise wird das trans-Differenzierungsverfahren es viel einfacher machen, patientenspezifische Zellen für therapeutische Anwendungen herzustellen und ein dramatisch geringeres Risiko für die Tumorbildung im Vergleich zu IPS-Zellen zu erzielen. Auf diese Weise sind wir jetzt in der Lage, zwei große Hindernisse für die heutige medizinische Versorgung in der Region abzubauen.

Das ist klinische Sicherheit und Effizienz. Zu Beginn der Stanzbiopsie desinfizieren Sie die Haut des Patienten, betäuben Sie die Haut, an der die Biopsie entnommen wird, mit 0,5 bis einem Milliliter Mepivacainhydrochlorid intrakutan. Entnehmen Sie die Hautbiopsie mit einem sterilen Drei-Millimeter-Biopsiestempel

Spülen Sie die Biopsie mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder DPBS von Dobe Echo plus einem Mikroliter pro Milliliter Gentamycin. Entfernen Sie das Fett aus der Biopsie mit einem Skalpell und einer Pinzette. Spülen Sie dann die Biopsie noch zweimal mit dem Puffer aus, bevor Sie sie vollständig absaugen.

Decken Sie die Biopsie mit Dispaste zwei ab und inkubieren Sie sie 16 bis 18 Stunden bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation aspirieren Sie die Dys-Paste vollständig, bevor Sie die Biopsie zweimal mit DPBS waschen. Entfernen Sie die Epidermis mit einer Pinzette und waschen Sie die Biopsie noch zweimal mit DPBS.

Als nächstes fügen Sie zwei Milliliter Kollagenase Typ zwei hinzu und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen in der Tube. Fügen Sie Kollagenase bis zu fünf Milliliter hinzu. Das Gesamtvolumen inkubiert 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Die Probe wird fünf Minuten lang bei 180-fachem G zentrifugiert und die Schlinge anschließend verworfen. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Millilitern DMEM-Kälberserum-Gentamicin-Medium, bevor Sie es erneut fünf Minuten lang bei 180-fachem G zentrifugieren.Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1,5 Millilitern desselben Mediums. Dann wird die Probe in einen T 25-adhärenten Gewebekulturkolben überführt und bei 37 Grad Celsius 5 % CO2 inkubiert, wobei das Medium nach etwa zwei Wochen alle drei Tage gewechselt wird.

Sobald die Zellen um die Hautteile herum zusammenfließen, spalten Sie die Zellen mit Trypsin-EDTA, wie im Textprotokoll beschrieben. Erweitern Sie die Zellen weiter, indem Sie das Medium jeden dritten Tag wechseln und teilen, wenn die Zellen zusammenfließen. Nachdem Sie eine Mykoplasmenkontamination durch Standardassays ausgeschlossen haben, bereiten Sie die Zellen für das direkte Umwandlungsexperiment vor, indem Sie die Zellen einmal mit DPPS waschen, dann das DPBS aspirieren und 2,5 Milliliter Trypsin EDTA hinzufügen. Nachdem Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubiert haben, klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen zu lösen.

Resuspendieren Sie die Zellen in 2,5 Millilitern Fibroblastenmedium und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 180 mal G und aspirieren Sie das Snat. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Fibroblastenmedium und pipettieren Sie auf und ab, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen.

Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einer Zellzählkammer vor dem Plattieren. 30.000 Zellen pro Well. In einer 24-Well-Platte inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius, 5 %CO2-Schritte, die mit dem Virus umgehen, müssen in einer biologischen Sicherheitswerkbank mit geeigneter persönlicher Sicherheitsausrüstung durchgeführt werden, einschließlich einer chirurgischen Maske, um eine Exposition der Schleimhäute zu verhindern.

Um die Infektion durchzuführen, ersetzen Sie zuerst das vorhandene Zellmedium durch 100 Mikroliter Fibroblastenmedium. Dann resuspendieren Sie aufgetaute Aliquots von T vier, KLF vier, SOX zwei und cmix sendi Virus in einem Milliliter Fibroblastenmedium. Fügen Sie jedes Virus in einem MOI von drei zu den Zellen hinzu und mischen Sie die Zellen vorsichtig über Nacht bei 37 Grad Celsius, 5% CO2 nach 24 Stunden, aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 500 Mikroliter Neuroinduktionsmediumkultur hinzu, die Zellen bei 39 Grad Celsius, 5% CO2 von nun an, und wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag am sechsten Tag nach der Infektion. Bereiten Sie Laminin-beschichtete Sechs-Well-Platten vor.

Geben Sie einen Milliliter eines Mikrogramms pro Milliliter Laminin in DPBS auf Sechs-Well-Platten und halten Sie die Platten am siebten Tag nach der Infektion 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius, spalten Sie die Zellen mit D-P-B-S-E-D-T-A, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie 500 Mikroliter D-M-E-M-F 12 hinzu und geben Sie die Suspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Probe dann fünf Minuten lang bei 180 mal G.

Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1,5 Millilitern Neuroinduktionsmedium, plattieren Sie die Zellen auf laminatbeschichteten Sechs-Well-Platten und fügen Sie den RO-Kinase-Inhibitor zu einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren hinzu. Die Zellen bei 39 Grad Celsius, 5% CO2, wechseln das Medium ab Tag 14 jeden zweiten Tag. Nach der Infektionskultur werden die Zellen bei 37 Grad Celsius 5%CO2 Neuroepithelkolonien um den 17. Tag nach der Infektion sichtbar, wie durch Phasenkontrastmikroskopie sichtbar gemacht wurde.

Sie sollten groß genug sein, um etwa am 20. Tag nach der Infektion gepflückt zu werden, einen Tag vor der Aufnahme von Mantel 1 48. Einen Tag später eine Well-Platte mit Laminin, wie im Textprotokoll beschrieben, Laminat aus den Platten aspirieren und 200 Mikroliter Neuroinduktionsmedium in die Wells geben. Waschen Sie die sechs Well-Platten mit den zu pflückenden Kolonien einmal mit DPBS, bevor Sie zwei Milliliter Neuroinduktion hinzufügen.

Medium pro Well einer Sechs-Well-Platte Nehmen Sie die Zellen mechanisch auf, indem Sie mit einer dünnen Nadel um die Kolonien herum kratzen, um die umgebenden Zellen zu entfernen, und indem Sie die Kolonien mit Pipettenspitzen entnehmen. Montiert auf einer 200-Mikroliter-Pipette ist der Mann auf 50 Mikroliter eingestellt. Übertragen Sie jede Kolonie in eine Vertiefung einer laminatbeschichteten 48-Well-Platte und erzeugen Sie mechanisch eine Einzelzellsuspension, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren.

Geben Sie den Zellen einen R-Kinase-Inhibitor in einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren zu. Züchten Sie die Zellen auf der 48-Well-Platte bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2 für zwei Tage. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis die Zellen eine Sprachflüssigkeit von 80 bis 90 % erreichen.

Siehe das Textprotokoll zur Expansion und Kryokonservierung der IPCs zur Differenzierung von IPCs in Richtung einer neuronalen Abstammungskultur. Die Zellen auf laminierten beschichteten Platten. Wechseln Sie wie zuvor das Medium auf das Neuro-Diff-Medium, wenn die Zellen zu etwa 70 % konfluent sind, und wechseln Sie das Medium drei Wochen lang jeden zweiten Tag.

Teilen Sie die Zellen nicht während der Differenzierung nach drei Wochen, die Zellen sollten den neuronalen Marker TUJ one exprimieren, um reifere Neuronen und neuronale Subtypen zu gewinnen. Setzen Sie die Differenzierung bis zu drei Monate fort, um die IPCs zu differenzieren, insbesondere in Richtung einer glialen Linie. Wechseln Sie das Medium zu glialem Induktionsmedium, einschließlich 20 Nanogramm pro Milliliter epidermalem Wachstumsfaktor, um die Differenzierung in gliale Vorläuferzellen zu induzieren.

Entfernen Sie die Hälfte des Mediums und ersetzen Sie es etwa zwei Wochen lang jeden zweiten Tag durch frisches Medium. Während dieses Zeitraums sollten die Zellen in Gegenwart eines 10-mikromolaren R-Kinase-Inhibitors um ein bis drei gespalten werden, wenn nach zwei Wochen eine 100%ige Co-Flüssigkeit erreicht ist. Differenzieren Sie die Zellen weiter in Astrozyten, indem Sie das Medium auf das kommerziell erhältliche Astrozytenmedium umstellen, wenn die Zellen fast zusammenfließen, und indem Sie das Medium jeden zweiten Tag wechseln, etwa sieben Tage später, beginnen die Zellen mit der Expression von Astrozytenmarkern.

Wenn Zellen während des Differenzierungsprotokolls zu 100 % zusammenfließen, teilen Sie sie in einem Verhältnis von eins zu zwei auf. In Gegenwart von 10 mikromolaren RO-Kinase-Inhibitoren führte eine Infektion der Fibroblasten mit T-, 4K-, LF-, 4-, SOX-, 2- und cmix-Send-Viren und Kultur unter neuroinduktiven Medienbedingungen zu einer Veränderung der Morphologie der Fibroblasten und der anschließenden Entstehung von Kolonien. 17 Tage nach der Infektion können monoklonale Zelllinien expandiert werden und sich positiv für neurale Stammzellmarker wie SOX zwei, SOX eins neston und PAC sechs sowie für den Proliferationsmarker KI 67 färben, während sie den pluripotenzassoziierten Marker T vier nicht exprimieren.

Darüber hinaus können durch Zugabe von neuronalen Wachstumsfaktoren zum Zellkulturmedium die neuralen Vorläuferzellen durch Anwendung einer Astrozytendifferenzierung in Neuronen differenziert werden. Protokollinduzierte neurale Vorläuferzelllinien können auch in gliale Linien differenziert werden, wie durch die Analyse typischer morphologischer Veränderungen und die Färbung gegen GFAP beurteilt wird. Durch diese direkte Umwandlung generieren wir innerhalb von drei bis vier Wochen multipotente induzierte Neurovorläuferzellen aus Fibroblasten von Patienten.

Diese Zellen könnten für zahlreiche biomedizinische Anwendungen eingesetzt werden. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie, Diagnose und Modellierung neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson sowie anderer neurologischer Erkrankungen.