In-situ-Nachweis von Bakterien in Paraffin eingebetteten Geweben Unter Verwendung eines Digoxin-markierte DNA-Sonde Targeting 16S rRNA

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Lokalisierung von Bakterien in paraffineingebetteten Geweben mit Hilfe von DIG-markierter ribosomaler 16-s-RNA, die auf DNA-Sonden abzielt. Dies wird erreicht, indem die Sonde zunächst mit PCR-Amplifikation und DIG-Markierung vorbereitet wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Gewebeschnitte so vorzubereiten, dass sie besser zugängliche Zielstellen und eine geringere Hintergrundbindung haben.

Als nächstes werden die präparierten Gewebeschnitte mit der dig-markierten Sonde hybridisiert. Schließlich wird die hybridisierte Sonde mit alkalischer Phosphatase, markierten Anti-D-Dig-Antikörpern, nachgewiesen. Letztendlich kann diese in C zwei Hybridisierungsverfahren das Vorhandensein von Bakterien mit in Paraffin eingebettetem Gewebe nachweisen.

Der Domänenvorteil dieses Nachweisverfahrens gegenüber bestehenden Verfahren wie ING besteht darin, dass dieses Verfahren bakterielle SHS im Kontext einiger histologischer Strukturen nachweisen kann. Diese Methode kann einen Einblick in die Pathogenese geben, kann aber auch verschiedene Entzündungsorgane wie Parodontitis und R-Planet entzündlich sein. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Gewebevorbereitung und die hybriden Verdauungsschritte schwierig durchzuführen sind, da die Gewebeschnitte leicht beschädigt werden können.

Um die U-Bakteriensonde herzustellen, werden ein 70-Basenpaar, ein DNA-Fragment als Template und zwei 15-Basenpaar-Primer verwendet, um die Sonde durch PCR zu amplifizieren. Sammeln Sie das Amplikon in Puffer in einer bekannten Konzentration. Markieren Sie dann die Sonde mit einem DIG-DNA-Markierungs- und Nachweiskit.

Mischen Sie zunächst drei Mikrogramm der Sonde in 15 Mikroliter Wasser. Denaturieren Sie die Sonde im Heizblock für 10 Minuten bei 95 Grad Celsius. Legen Sie dann die vergällte Sonde auf Eis.

Fügen Sie als Nächstes zwei Mikroliter 10 XH-Nukleotide, zwei Mikroliter DN NTPs und einen Mikroliter Kanalenzym hinzu. Lassen Sie die Sonde nach dem Mischen 24 bis 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Mischung auf 65 Grad Celsius erhitzen.

Messen Sie dann die DNA-Konzentration der markierten Sonde bei 260 Nanometern und stellen Sie eine Konzentration auf 100 Nanogramm pro Mikroliter ein. Überprüfen Sie mit dem Kit die Empfindlichkeit der Sonde zuerst auf eine Nylonmembran und laden Sie einen Mikroliter seriell verdünnte Positivkontrolle. Sonde und grabe die beschriftete Sonde.

Lassen Sie die Membran fünf Minuten trocknen. Tauchen Sie die Membran nach dem Trocknen kurz in zwei XSSC und geben Sie sie dann für eine Stunde in einen 80 Grad Celsius heißen Inkubator. Um die DNA nach der Inkubation zu immobilisieren, weichen Sie die Membran kurz in Maleinsäurepuffer ein und überführen Sie ihn dann nach einer halben Stunde in einen Blockpuffer, der mit AP-konjugierten Antikörpern in einer Verdünnung von ein bis 5.000 konzentriert ist.

Waschen Sie die Membran in MABT. Mischen Sie dann 40 Mikroliter N-B-T-B-C-I-P in zwei Milliliter Nachweispuffer. Und nach dem Bad geben Sie diese Mischung eine Minute lang zur Membran.

Nach der Entfernung des Paraffins und der Rehydratisierung der Gewebeschnitte, wie im Textprotokoll beschrieben, bereiten Sie diese für die zweite Hybridisierung in C vor und tauchen Sie die Objektträger zunächst für 20 Minuten in 0,1 % normale Salzsäure ein. Waschen Sie die Objektträger nach dem Säurebad 30 Sekunden lang mit DEPC-behandeltem Wasser ab. Zeichnen Sie dann mit einem Wachsstift die Proben auf jedem Objektträger um.

Geben Sie anschließend je nach Größe 50 bis 400 Mikroliter Proteinase K-Lösung zu den Proben. Lassen Sie das Enzym 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius wirken und waschen Sie dann die Objektträger eine Minute lang in DEPC-behandeltem XPBS. Übertragen Sie nun die Objektträger für 10 Minuten auf 4%Paraformaldehyd in DEPC-behandeltem PBS.

Waschen Sie das Fixiermittel wie zuvor mit PBS ab. Dann die Objektträger nach 20 Minuten in 0,1 molaren Triethanolaminhydrochlorid bei pH acht mit 0,5% Essigsäure und Hydrid baden, die Objektträger wie zuvor mit klarem Wasser abwaschen. Beginnen Sie nun in C zwei, indem Sie zuerst die Folien für 20 Minuten in zwei XSSC eintauchen.

In der Zwischenzeit verdünnen Sie die markierte Sonde auf ein Nanogramm pro Mikroliter in Hybridisierungspuffer für eine Negativkontrolle. Verwenden Sie die 10-fache Konzentration der nicht markierten Sondensonde. Anschließend denaturieren Sie die Sonden, indem Sie sie 10 Minuten lang auf 90 Grad Celsius erhitzen und anschließend schnell auf Eis abkühlen.

Als nächstes wenden Sie auf jeden Objektträger das gleiche Volumen der Sondenverdünnung an, das zuvor angewendet wurde. Anschließend die Rutschpartien vorsichtig abdecken und mit Nagellack versiegeln. Erhitzen Sie nun die Objektträger auf einem PCR-Maschinenblock 10 Minuten lang bei 90 Grad Celsius und überführen Sie sie am nächsten Tag über Nacht in einen 45 Grad Celsius befeuchteten Inkubator.

Kühlen Sie die Objektträger eine halbe Stunde lang bei vier Grad Celsius ab und entfernen Sie dann vorsichtig die Deckgläser. Das Gewebe ist zerbrechlich. Zum Schluss werden die Objektträger bei Raumtemperatur durch eine Reihe von SSC-Puffern geführt.

Waschen Sie zuerst die beiden hybridisierten Objektträger NC fünf Minuten lang in MABT. Tragen Sie dann 50 bis 400 Mikroliter Blockierlösung in 1%tween 20 für 20 Minuten auf. Nach der Blockinkubation 50 bis 400 Mikroliter eines bis 1000 Anti-D-Dig-Alkali-Phosphatase-Antikörpers und eine Blockierungslösung auftragen.

Lassen Sie es 90 Minuten bei 37 Grad Celsius binden, nachdem die Primärfarbe aufgetragen wurde. Waschen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in MAHABT. Legen Sie dann die Objektträger fünf Minuten lang in einen Erkennungspuffer mit 1 %Tween 20.

Tragen Sie nun 50 bis 400 Mikroliter einer millimolaren Ole in Nachweispufferlösung auf jeden Objektträger auf und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang, um die endogene alkalische Phosphatase zu inaktivieren. Als nächstes fügen Sie 50 bis 400 Mikroliter N-B-T-B-C-I-P hinzu, das in der Detektion verdünnt ist. Puffern Sie bei einem bis 100 pro Objektträger und lassen Sie die Objektträger zwei bis drei Stunden lang in einer befeuchteten Kammer inkubieren, basierend auf den Erfahrungen.

Spülen Sie die Objektträger mit DI-Wasser ab, tragen Sie dann Methylgrün mit 0,05 Vol.-% auf und lassen Sie den Gegenfleck 10 Minuten lang auf das Gewebe einwirken. Bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Objektträger erneut mit DI-Wasser und dehydrieren Sie sie dann mit 100 % Ethanol, gefolgt von einem Eintauchen in Xylol.

Zum Schluss tragen Sie 80 Mikroliter Eindeckmedium und Deckglas auf. Die Objektträger nach den Sonden wurden mit Grabungen beschriftet. Ihre Sensitivität wurde mit der Verdünnung der Positivkontrollsonde verglichen.

Die 3 43 Basenpaar p gingivalis-spezifische Sonde war 25-mal empfindlicher als die speziell entwickelte Bakteriensonde mit 70 Basenpaaren. Die beiden Sonden wurden dann bei hoher Vergrößerung auf Zahnfleischgewebe von Patienten mit chronischer Parodontitis aufgebracht. Die verschiedenen Formen der Bakterien waren mit der Bakteriensonde erkennbar.

Während die p gingivalis-spezifische Sonde nur stäbchenförmige Bakterien nachweiste, wurde eine Tight Junction zerstörende Chemikalie DSS auf die Zahnfleischschleimhaut von Mäusen aufgebracht. Gewebeproben dieser Mäuse wurden verwendet, um die Sonden in einem anderen Kontext zu vergleichen. Hier konnte die U-Bakteriensonde die Bakterien nachweisen, die die andere nicht nachweisen konnte.

Als nächstes wurde die U-Bakteriensonde auf ihre Fähigkeit getestet, andere Bakterien in Lungengewebeschnitten mit Tumoren zu erkennen. Bakterien wurden sowohl außerhalb des Tumors als auch innerhalb des Tumors nachgewiesen. Bei der Untersuchung von Geweben von Patienten mit oralem Lichen planus, einer Erkrankung unbekannter Ätiologie, entdeckte die Bakteriensonde bakterielle Signale in den Zellen des Epithels und der Lamina propria, wo eine entzündliche Infiltration beobachtet wurde.

Seit ihrer Entwicklung hat diese Technik dem Forscher auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten geholfen, das Eindringen von Bakterien in Gewebe sowohl bei Menschen als auch bei Tieren nach diesem Verfahren zu untersuchen. Andere Methoden, wie z. B. der immunchemische Nachweis des Wachstums von Zellmarkern, können ED sein, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Art von Zellen die Bakterien im Gewebe beherbergen.