Name: In-situ-Nachweis von Bakterien in Paraffin eingebetteten Geweben Unter Verwendung eines Digoxin-markierte DNA-Sonde Targeting 16S rRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Lernen Sie die In-situ-Hybridisierung zur Lokalisierung von Bakterien in paraffingelegten Geweben mit DIG-markierten 16S rRNA-Sonden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung bakterieller Infektionen bei Parodontitis, Krebs und Entzündungen.

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Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss (2013R1A1A3005669) von der National Research Foundation Korea und einem Zuschuss (HI13C0016) des koreanischen Health Technology R &amp; D Project, Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt unterstützt.

1. Probe Vorbereitung <ol><li> PCR-Amplifikation der Sonde <ol><li> Für die P. gingivalis-spezifischen Sonde, verstärken eine 343-bp-DNA-Fragment von P. gingivalis 16S rRNA durch PCR unter Verwendung der genomischen DNA von P. gingivalis und der folgenden Primer: 5&#39;TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 &#39;und 5&#39;-ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3&#39; 10. Zuführen Amplifikationen mit den folgenden Zyklusbedingungen: 35 Zyklen bei 95 ° C für 30 sec, 60 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 1 min 20 sec, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung bei 72 ° C 10,11. </li><li> Verstärken die eubakteriellen Sonde mit Hilfe eines 70-bp-DNA-Fragment (5&#39;-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 &#39;) synthetisiert werden, wie einem Oligonukleotid und der folgenden Primer: 5&#39;-CAG CTG GTR CMT GGY-3&#39; und 5&#39;-AGG GTT GCG CTC GTT-3 &#39;11. Führen Amplifikationen mit den folgenden Zyklusbedingungen: 40 Zyklen9 4 ° C für 30 sec, 60 ° C für 30 sec und 72 ° C für 1 min 20 s, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung bei 72 ° C 11,12. </li><li> Ausfällen der PCR-Produkte (≥500 ul) durch Zugabe von 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 100% Ethanol (in einer 10: 1: 2-Verhältnis) und Inkubation bei -20 ° C für 2 Std. </li><li> Zentrifuge das Gemisch bei 14.000 × g für 15 min, das Pellet in 100 ul TE-Puffer und Messung der DNA-Konzentration durch optische Dichte bei 260 nm. </li></ol></li><li> DIG-Markierung mit einem DIG DNA-Markierung und Nachweis-Kit <ol><li> Mix 3 ug der Sonde mit Wasser auf ein Endvolumen von 15 ul. </li><li> Denaturieren der DNA bei 95ºC für 10 min und schnell auf Eis kühlen. </li><li> Add 2 ul 10fach Hexanukleotid-Mix, 2 &amp; mgr; l dNTP-Markierungsmischung und 1 ul Klenow-Enzym zu 15 &amp; mgr; l des denaturierten DNA. </li><li> Mischen und bei 37 ° C für 24 h bis 48 h und Stop-Reaktion durch Erhitzen auf 65 ° C. </li></ol></li><li> Überprüfen Sie die Empfindlichkeit der DIG-markierten Sonde mit einem DIG DNA-Markierung und Nachweis-Kit <ol><li> Manuell laden 1 ul Verdünnungsreihen der positive Kontrollsonde im Kit enthalten und 1 ng der DIG-markierten Sonde auf der Nylonmembran und trocken für 5 min bei RT. </li><li> Kurz einwirken die Membran in 2 × SSC-Puffer (0,3 M NaCl, 30 mM Natriumcitrat, pH 7,0) und Inkubieren der Membran bei 80 ° C für 1 Stunde, um die DNA zu immobilisieren. </li><li> Kurz einwirken der Membran in Maleinsäurepuffer (MAB, 0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5) und Inkubieren mit Anti-DIG-Alkalische Phosphatase (AP) konjugiertem Antikörper verdünnt (1: 5000) in 6 ml Blockierungslösung bereitgestellt im Kit bei RT für 30 min. </li><li> Waschen der Membran mit MABT (MAB, das 1% Tween 20) und wendet wurden 40 ul der NBT / BCIP-Lösung mit 2 ml Nachweispuffer (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl 2, pH 9,5) auf das gemischt- Membran für 1 min. Wenn die Empfindlichkeit der markierten Sonde istnicht zufriedenstellend, wiederholen Sie die Schritte von 1.1.3 bis 1.3.4. </li><li> Messung der DNA-Konzentration der markierten Sonde (OD260) Die Konzentration ist anzupassen, um 100 ng &amp; mgr; l -1. </li></ol></li><li> Überprüfen Sie die Spezifität der DIG-markierten Sonde <ol><li> Denaturieren genomischer DNA-Proben (25 ng 3 ul -1 pro jeder Probe) aus verschiedenen Bakterienspezies, einschließlich des Bakteriums von der spezifischen Sonde ausgerichtet, bei 95 ° C für 10 min und schnell auf Eis kühlen. </li><li> Die denaturierte DNA auf der Nylonmembran und trocken manuell laden für 20 min bei RT. </li><li> Kurz einwirken die Membran in 2 × SSC-Puffer und Inkubation der Membran bei 80 ° C für 2 Stunden, um die DNA zu immobilisieren. </li><li> Blockieren der Membran mit einer Blockierungslösung bei Raumtemperatur für 1 Std. </li><li> Verdünnen Sie die Sonde bei 1 ng ul -1 in Hybridisierungspuffer, Denaturierung der verdünnten Proben, und wenden auf die Membran. </li><li> Inkubieren der Membran bei 45 ° C für 1 Stunde. </li><li> Waschen Sie die Membran dreiMal mit 2x SSC-Puffer. </li><li> Kurz einweichen die Membran in MAB. </li><li> Inkubieren mit Anti-DIG-AP-konjugierten Antikörper, verdünnt (1: 2000) in 6 ml Blockierungslösung bei Raumtemperatur 1 Stunde. </li><li> Waschen der Membran mit MABT und anzuwenden 40 ul der NBT / BCIP-Lösung mit 2 ml Nachweispuffer gemischt. </li><li> Wenn die Sonde nicht die erhoffte Spezifität erhöhen die Hybridisierungstemperatur, bis der Spezifität beobachtet. </li></ol></li></ol> 2. In situ-Hybridisierung Hinweis: Um die Trocknung der Proben und Reagenzien zu vermeiden, führen alle Inkubationen in einer befeuchteten Kammer mit feuchten Papiertüchern ausgekleidet. <ol><li> De-paraffinization und Rehydrierung der Gewebeschnitte <ol><li> Bereiten Sie 4 um dicke Gewebeschnitte von in Paraffin eingebetteten Blöcken. Formalin, Paraformaldehyd und Zinkbasis Fixiermittel sind mit diesem Protokoll kompatibel. </li><li> Bereiten Sie alle Reagenzien mit DEPC-behandeltem Wasser. </li><li> Wärmeträger in einem Trockenofen bei 60 ° C für 30 min inkubieren Folien bei Raumtemperatur 30 min. </li><li> Einzutauchen gleitet in 100% Xylol für 5 min dreimal; frisches Xylol jedes Mal. Hinweis: Führen Sie diese Entparaffinierung Verfahren in einem Chemieabzug benutzen. </li><li> Einzutauchen gleitet in 100% Ethanol für 5 min zweimal mit frischem Ethanol gewaschen und rehydrieren Proben in serielle 90%, 80% und 70% Ethanol-Lösungen für jeweils 5 Minuten. </li><li> Einzutauchen Folien in DEPC-behandeltem Wasser für 1 min und waschen Folien in mit DEPC behandeltem PBS (pH 7,4) für 6 min. </li></ol></li><li> Vorbehandlungen von Gewebeschnitten <ol><li> Einzutauchen Folien in 0,1 N Salzsäure für 20 Minuten und Waschen Folien in DEPC-behandeltem Wasser für 30 sec. </li><li> Zeichnen Sie eine hydrophobe Barriere rund um Proben mit einem Wachsstift. Hinweis: Die Größe der hydrophoben Barriere hängt von der Größe der Proben. Daher variieren die Mengen der Reagenzien in den folgenden Schritten verwendet wird, auf die Größe der Proben abhängig, sondern den hy füllenphobe Barriere (50 ul für kleine Proben und 400 &amp; mgr; l für große Proben). </li><li> Behandlung von Proben mit 50 bis 400 &amp; mgr; l Proteinase K (1-10 ug ml-1 in mit DEPC behandeltem PBS) in einem Trockenofen bei 37 ° C für 30 Minuten und Waschen Folien in DEPC-behandeltem 1x PBS für 1 min. </li><li> Einweichen gleitet in 4% Paraformaldehyd in DEPC behandeltem PBS für 10 min, dann waschen Folien in mit DEPC behandeltem PBS für 1 min. </li><li> Einweichen Folien in 0,1 M Triethanolamin-HCl (pH 8,0), enthaltend 0,5% Essigsäureanhydrid für 20 Minuten und Waschen Folien in DEPC-behandeltem Wasser für 30 sec. </li></ol></li><li> Die Hybridisierung mit Sonde und Waschen <ol><li> Einzutauchen Folien in 2 × SSC-Puffer für 20 min. </li><li> Verdünne die Sonde bei 1 ng &amp; mgr; l -1 in Hybridisierungspuffer (4 × SSC, 50% [Vol / Vol] Formamid, 1x Denhardt-Lösung, 10% [w / v] Dextransulfat, 0,1% [Gew / Vol] Natriumdodecylsulfat, 0,4 mg ml -1 Lachssperma-DNA). Für Negativkontrollen, mischen Sie die markierte Sonde mitein 10-facher Überschuß von nicht-markierten Sonde. </li><li> Denaturierung der verdünnten Proben und gelten 50 bis 400 &amp; mgr; l auf Gewebeschnitten. Legen Sie ein Deckglas auf den Objektträger und Dichtung mit Nagellack. </li><li> Wärmeträger in PCR-Maschine bei 90 ° C für 10 min inkubieren Objektträger in einer Feuchtkammer O / N bei 45 ° C oder optimale Temperatur beim Schritt 1.4.11 bestimmt. </li><li> Kühlen Sie die Objektträger bei 4 ° C für 30 Minuten, entfernen Sie Deckgläser und Objektträger eintauchen in eine serielle SSC-Puffer als Followings: 4x SSC für 10 Minuten, vorgewärmten (45 ° C) 2 × SSC für 20 Minuten, 2x SSC für 10 min und 0,2 × SSC für 10 min. </li></ol></li><li> Detektion mit anti-DIG AP-konjugierten Antikörper <ol><li> Waschen Folien MABT für 5 min. </li><li> Block mit 50 bis 400 &amp; mgr; l Blockierlösung mit 1% Tween 20 für 20 min. </li><li> Hinzuzufügen 50-400 ul anti-DIG-AP-Antikörper in Blockierungslösung (1: 1.000) verdünnt anld bei 37 ° C für 90 min. </li><li> Waschen Folien MABT für 10 min. </li> &lt;li&gt; Tauchen Folien in Detektionspuffer, der 1% Tween 20 für 5 min. </li><li> Behandlung mit 50 bis 400 μ von 1 mM Levamisol (in Nachweispuffer, der 1% Tween 20) für 5 min auf endogene alkalische Phosphatase zu inaktivieren. </li><li> Verteilen von 50 bis 400 ul der vorgemischten NBT / BCIP-Lösung (in Detektionspuffer auf 1: 100 verdünnt) auf jeder Probe und inkubiere Folien in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur für 2 bis 3 h, bis das entwickelte Signal zufriedenstellend. </li><li> Spülen Sie Dias mit entionisiertem Wasser bis zur Visualisierung an und ziehen Sie 50 bis 400 &amp; mgr; l von 0,05% [w / v] methyl grün als Gegenfärbung bei 37 ° C für 10 min. </li><li> Spülen Sie Dias mit entionisiertem Wasser, entwässern in 100% Ethanol, und tauchen in Xylol. </li><li> Übernehmen 80 ul Befestigungslösung auf jedem Objektträger geben und mit Deckgläschen. </li></ol></li></ol>

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<li>Hajishengallis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Low-abundance+biofilm+species+orchestrates+inflammatory+periodontal+disease+through+the+commensal+microbiota+and+the+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement.</a> Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).</li>
<li>Axon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+cancer+and+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Aliment.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gastric cancer and Helicobacter pylori.</a> Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).</li>
<li>Fenhalls, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ.+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+transcripts+in+human+lung+granulomas+reveals+differential+gene+expression+in+necrotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions.</a> Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier ein Protokoll, um Bakterien in Paraffin eingebetteten Gewebe unter Verwendung eines DIG-markierte DNA-Sonde wurde beschrieben zu lokalisieren. Die Sonde selektiv DNA oder RNA-Moleküle von bakteriellen 16S-rRNA-Gens und des 16S-rRNA-Targeting-Sonden können entweder als artspezifische oder Universal ausgebildet sein. Die spezifische Hybridisierung des P. gingivalis-spezifischen Sonde an P. gingivalis, aber nicht auf andere orale Bakterien wurde bereits gezeigt worden 10. Im Gegensatz dazu...

Bakterien spielen eine Rolle in der Ätiologie der verschiedenen oralen Erkrankungen wie Parodontitis, Pulpitis, Perikoronitis, Cellulitis und Osteomyelitis. Um die Rolle von Bakterien in der Pathogenese der Krankheit zu verstehen und um die Wirkung der Behandlung zu überwachen, ist die Lokalisierung von Bakterien innerhalb des Gewebes wichtig. Die Anwesenheit von Bakterien im Zahnfleischgewebe von Patienten mit Periodontitis wurde mit verschiedenen Methoden dargestellt, mit Elektronenmikroskopie 1,2, Immunhistochemie und Immunfluoreszenz unter Verwendung von Bakterien-spezifischen Antikörpern 3-7 und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) unter Verwendung eines Fluoreszenz-8 markierte Oligonukleotidsonde Targeting 16S-rRNA. Gleichwohl sind diese Verfahren nicht in großem Umfang aufgrund technischer Einschränkungen oder Schwierigkeiten eingesetzt. Verglichen mit den Antikörpern, sind Sonden Targeting 16S rRNA einfach herzustellen und zu erreichen Artspezifität. FISH hat sich als ein hervorragendes Werkzeug zur Visualisierung von bact seineria in ihrer natürlichen Umgebung, wie beispielsweise Plaque-Biofilm. Jedoch ist die Anwendung der FISH zur Gewebeproben aufgrund Autofluoreszenz der verschiedenen Gewebekomponenten beschränkt. Zum Beispiel die starke Autofluoreszenz von roten Blutkörperchen die oft den Einsatz von Fluoreszenz-Technologie entzündeten Geweben, wenn sie beinhalten Blutungen 9. Um Bakterien in den entzündeten Zahnfleischgewebe zu lokalisieren, damit eine in situ-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung einer Digoxigenin (DIG) -markierten DNA-Sonde wurde entwickelt und erfolgreich angewendet 10,11. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Lokalisierung von Bakterien in Paraffin eingebettetem Gewebe unter Verwendung von P. gingivalis-spezifischen und universellen eubakteriellen Sonden wurde beschrieben. Es wird besonders auf die Standardisierung des Verfahrens so, dass ähnliche Ergebnisse in anderen Labors reproduziert werden konzentriert. Dieses Protokoll ermöglicht die Lokalisierung von Bakterien in ihrem Kontext und der histologischen results sind hoch reproduzierbar. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um Bakterien entweder in einer artspezifischen oder universell in verschiedenen Geweben zu lokalisieren. Die Universalsonde ist besonders nützlich, um Bakterien in polymicrobial Krankheiten zu detektieren und eine mögliche Rolle von Bakterien bei Krankheiten zu studieren, wo die Rolle von spezifischen Bakterien nicht bekannt ist.

<table><tbody><tr><td>Essigsäureanhydrid</td><td>Sigma</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>50%ige Dextransulfatlösung</td><td>Millipore</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>50X Denhardt' </td><td>Sigma</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>P159220</td><td></td></tr><tr><td>DIG DNA-Markierungs- und Detektionskit</td><td>Roche</td><td>11 093 657 910</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge&trade; Kugelschreiber</td><td>Dako</td><td>H-400</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol</td><td>Vector</td><td>SP-5000</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td></td><td>Sigma 246964</td><td></td></tr><tr><td>Maleininsäure</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Methylgrün</td><td>Sigma</td><td>M6776</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Lachssperma DNA-Lösung</td><td>Invitrogen</td><td>#15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Duksan</td><td>D1420</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Amresco</td><td>227</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamin-HCl</td><td>Sigma</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Research organics</td><td>3098T</td><td></td></tr></tbody></table>

in-situ-nachweis von bakterien in paraffin eingebetteten geweben unter verwendung eines digoxin-markierte dna-sonde targeting 16s rrna

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Das Vorhandensein von Bakterien im Taschenepithel und im darunter liegenden Bindegewebe in Zahnfleischbiopsien von Patienten mit Parodontitis wurde mit verschiedenen Methoden berichtet, einschließlich Elektronenmikroskopie, Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz mit bakterienspezifischen Antikörpern und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) mit einer fluoreszenzmarkierten Oligonukleotidsonde. Dennoch sind diese Methoden aufgrund technischer Einschränkungen oder Schwierigkeiten nicht weit verbreitet. Hier wurde eine Methode zur Lokalisierung von Bakterien in paraffineingebettetem Gewebe mit Hilfe von DIG-markierten DNA-Sonden vorgestellt. Die in Paraffin eingebetteten Gewebe sind die häufigste Form von Biopsiegeweben, die von Pathologiebanken erhältlich sind. Bakterien können entweder artspezifisch oder universell nachgewiesen werden. Bakterielle Signale werden entweder als diskrete Formen (Kokken-, Stäbchen-, Fusiform- und Haarform) von Bakterien oder als dispergierte Formen nachgewiesen. Die Technik ermöglicht es, weitere histologische Informationen zu erhalten: Die Epithelien, das Bindegewebe, die entzündlichen Infiltrate und die Blutgefäße werden gut unterschieden. Mit dieser Methode kann die Rolle von Bakterien bei verschiedenen Krankheiten wie Parodontitis, Krebs und entzündlichen Immunerkrankungen untersucht werden.

Figur 1 zeigt Dot-Blotting von DIG-markierten Sonden im Vergleich mit der positiven Kontrollsonde in dem Satz um ihre Empfindlichkeit zu bestimmen. Das 343 bp P. gingivalis -spezifischen Sonde ist 25-mal empfindlicher ist als die 70 bp eubakteriellen Sonde, Fig. 2 zeigt in-situ-Hybridisierung von Patienten mit chronischer Periodontitis zum Nachweis von P. erhalten Gingivagewebe gingivalis und Eubakterien. Die Bakterien Signale, in violett dargestellt,...

Hier wurde eine Methode zur Lokalisierung von Bakterien in Paraffin-eingebetteten Geweben mit Hilfe von DIG-markierten 16S rRNA-Ziel-DNA-Sonden beschrieben. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um die Rolle von Bakterien bei verschiedenen Krankheiten wie Parodontitis, Krebs und entzündlichen Immunerkrankungen zu untersuchen.

In-situ-Nachweis von Bakterien in Paraffin eingebetteten Geweben Unter Verwendung eines Digoxin-markierte DNA-Sonde Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Bakterien in Paraffin eingebetteten Geweben mithilfe von DIG-markierten 16S-ribosomalen RNA-DNA-Sonden zu lokalisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Sonde mittels PCR-Amplifikation und DIG-Markierung vorbereitet wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Gewebeschnitte so vorzubereiten, dass die Zielbindungsstellen besser zugänglich sind und unspezifische Hintergrundbindung verringert wird. Anschließend werden die vorbereiteten Gewebeschnitte mit der Dig-markierten Sonde hybridisiert. Schließlich wird die hybridisierte Sonde mittels alkalischer Phosphatase und markierten Anti-Dig-Antikörpern nachgewiesen. Letztendlich kann diese in-situ-Hybridisierungsmethode das Vorhandensein von Bakterien in paraffin-eingebetteten Geweben aufzeigen.Der Vorteil dieses Nachweissystems gegenüber bestehenden Methoden wie ING besteht darin, dass mit dieser Methode Bakterien SHS im Zusammenhang mit bestimmten histologischen Strukturen detektiert werden können. Diese Methode kann Einblicke in die Pathogenese liefern, die jedoch verschiedene entzündliche Erkrankungen wie Parodontitis und R-Planet betreffen. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da die Gewebeproteparation und die Hybridisierungs-Digestionsschritte schwierig durchzuführen sind, weil die Gewebeschnitte leicht beschädigt werden können.Um die U-Bakterien-Sonde herzustellen, verwenden Sie ein 70 Basenpaare langes DNA-Fragment als Vorlage und zwei 15 Basenpaare lange Primer, um die Sonde mittels PCR zu amplifizieren. Sammeln Sie das Amplifikat in Puffer bei einer bekannten Konzentration. Markieren Sie anschließend die Sonde mit einem Dig-DNA-Markierungs- und Nachweiskit.Mischen Sie zunächst drei Mikrogramm des Probes mit 15 Mikroliter Wasser. Denaturieren Sie den Probe 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius im Heizblock. Anschließend stellen Sie den denaturierten Probe auf Eis. Fügen Sie anschließend zwei µL 10 XH-Nukleotide, zwei µL DN-NTPs und ein µL Kanalenzym hinzu. Nach dem Mischen wird der Probe eine Inkubation bei 37 °C für 24 bis 48 Stunden ermöglicht. Beenden Sie die Reaktion durch Erhitzen der Mischung auf 65 °C.Danach die DNA-Konzentration der markierten Sonde bei 260 Nanometern messen und die Konzentration auf 100 Nanogramm pro Mikroliter einstellen. Mithilfe des Kits zuerst die Empfindlichkeit der Sonde auf einer Nylonmembran überprüfen, indem ein Mikroliter seriell verdünnter Positivkontrolle aufgetragen wird. Probe und dig-markierte Sonde.Lassen Sie die Membran fünf Minuten lang trocknen. Nach dem Trocknen tauchen Sie die Membran kurz in zwei XSSC und überführen sie dann eine Stunde lang in einen 80 Grad Celsius warmen Inkubator. Um die DNA nach der Inkubation zu immobilisieren, durchfeuchten Sie die Membran kurz in Maleinsäurepuffer, überführen sie anschließend nach einer halben Stunde in einen Blockierpuffer, der mit AP-konjugierten Antikörpern in einer Verdünnung von 1 zu 5.000 angereichert ist.Spülen Sie die Membran mit MABT. Anschließend mischen Sie 40 Mikroliter N-B-T-B-C-I-P in zwei Milliliter Nachweis-Puffer. Nach dem Bad fügen Sie diese Mischung für eine Minute zur Membran hinzu.Nachdem die Paraffin entfernt und die Gewebeschnitte wie im Textprotokoll beschrieben rehydriert wurden, bereiten Sie diese für die in-situ-Hybridisierung vor, indem Sie die Objektträger zunächst 20 Minuten lang in 0,1 normaler Salzsäure einlegen. Nach dem Säurebad spülen Sie die Objektträger 30 Sekunden lang mit DEPC-behandeltem Wasser ab. Umreißen Sie dann mithilfe eines Wachsstifts die Proben auf jedem Objektträger.Fügen Sie anschließend je nach Größe der Proben 50 bis 400 Mikroliter Proteinase-K-Lösung hinzu. Lassen Sie das Enzym 30 Minuten bei 37 Grad Celsius wirken und waschen Sie die Objektträger anschließend eine Minute lang in DEPC-behandeltem 1x PBS. Überführen Sie die Objektträger nun für 10 Minuten in 4 % Paraformaldehyd in DEPC-behandeltem PBS.Spülen Sie das Fixativ wie zuvor mit PBS ab. Anschließend baden Sie die Objektträger 20 Minuten lang in 0,1 molarer Triethanolamin-Hydrochlorid-Lösung bei pH 8 mit 0,5 % Essigsäure und Hydrid, danach spülen Sie die Objektträger wie zuvor mit sauberem Wasser ab. Beginnen Sie nun die Denaturierung in 2× SSC, indem Sie die Objektträger zunächst 20 Minuten lang in 2× SSC eintauchen.Unterdessen verdünnen Sie die markierte Sonde in Hybridisierungspuffer auf ein Nanogramm pro Mikroliter, um eine negative Kontrolle herzustellen. Verwenden Sie die 10-fache Konzentration der nicht markierten Sonde. Denaturieren Sie anschließend die Sonden, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 90 Grad Celsius erhitzen und danach schnell auf Eis abkühlen.Als Nächstes dieselbe Menge der Sonde verdünnt auf jeden Objektträger auftragen wie zuvor Proteinase K. Dann vorsichtig mit einem Deckglas bedecken und die Schnitte mit Nagellack versiegeln. Die Objektträger anschließend 10 Minuten lang auf einem PCR-Block bei 90 Grad Celsius erhitzen und am folgenden Tag über Nacht in einen feuchten Inkubator bei 45 Grad Celsius überführen.Kühlen Sie die Objektträger eine halbe Stunde lang auf vier Grad Celsius ab und entfernen Sie dann vorsichtig die Deckgläser. Die Gewebe sind empfindlich. Zuletzt führen Sie die Objektträger einer Reihe von SSC-Puffer bei Raumtemperatur zu.Zunächst waschen Sie die beiden NC-Hybridisierungspräparate fünf Minuten lang in MABT. Anschließend geben Sie 50 bis 400 Mikroliter Blockierungslösung in 1 % Tween 20 für 20 Minuten auf. Nach der Blockierungsinkubation geben Sie 50 bis 400 Mikroliter einer 1:1000 verdünnten Anti-Dig-Alkalischen-Phosphatase-Antikörperlösung in Blockierungspuffer auf.Lassen Sie es 90 Minuten bei 37 Grad Celsius binden, nachdem der Primärantikörper aufgetragen wurde. Waschen Sie die Objektträger 10 Minuten in MABT. Danach legen Sie die Objektträger fünf Minuten in Detektionspuffer mit 1 % Tween 20.Tragen Sie nun 50 bis 400 Mikroliter einer einmillimolaren Ole-Lösung im Nachweis-Puffer auf jeden Objektträger auf und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang, um die endogene alkalische Phosphatase zu inaktivieren. Fügen Sie danach 50 bis 400 Mikroliter von N-B-T-B-C-I-P, verdünnt im Nachweis-Puffer im Verhältnis 1:100, auf jeden Objektträger hinzu und lassen Sie die Objektträger zwei bis drei Stunden lang in einer feuchten Kammer inkubieren, basierend auf Erfahrungswerten.Spülen Sie die Objektträger mit entionisiertem Wasser, geben Sie anschließend Methylgrün mit einem Gewichtsanteil von 0,05 % (m/V) auf und lassen Sie die Gegengefärbung 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf das Gewebe einwirken. Spülen Sie die Objektträger erneut mit entionisiertem Wasser und dehydrieren Sie sie dann mit 100 % Ethanol, gefolgt von einem Bad in Xylol.Schließlich 80 µL Eindeckmedium auftragen und mit einem Deckglas abdecken. Die Objektträger wurden nach der Markierung mit den Sonden beschriftet. Ihre Empfindlichkeit wurde mit der Verdünnung der positiven Kontrollsonde verglichen.Die 343 Basenpaar lange, spezifische Sondensequenz für P. gingivalis wies eine um das 25-fache höhere Empfindlichkeit auf als die konstruierte, 70 Basenpaar lange Bakterien-Sonde. Anschließend wurden die beiden Sonden bei hoher Vergr&ouml;&szlig;erung an Zahnfleischgeweben von Patienten mit chronischer Parodontitis angewendet. Mithilfe der Bakterien-Sonde waren die unterschiedlichen Bakterienformen erkennbar.Während die P. gingivalis-spezifische Sonde nur stabförmige Bakterien nachwies, wurde eine tight-junction-störende Chemikalie, DSS, auf die Gingivamukosa von Mäusen appliziert. Gewebeproben dieser Mäuse wurden verwendet, um die Sonden in einem anderen Kontext zu vergleichen. Hier konnte die universelle bakterielle Sonde die Bakterien detektieren, die die andere nicht nachweisen konnte.Die U-Bakterien-Sonde wurde anschließend daraufhin überprüft, ob sie weitere Bakterien in Lungen-Gewebeschnitten mit Tumoren nachweisen kann. Bakterien wurden sowohl außerhalb als auch innerhalb des Tumors detektiert. Bei der Untersuchung von Gewebeproben von Patienten mit oraler Lichen planus, einer Erkrankung mit unbekannter Ätiologie, wies die Bakterien-Sonde bakterielle Signale innerhalb der Zellen des Epithels und der Lamina propria nach, wo eine inflammatorische Infiltration beobachtet wurde.Seit ihrer Entwicklung hat diese Technik den Forscher im Bereich der Infektionskrankheiten dabei unterstützt, die Invasion von Bakterien in Gewebe bei Menschen und Tieren mithilfe dieses Verfahrens zu untersuchen. Weitere Methoden wie der immunchemische Nachweis von Wachstum an Zellmarkern können eingesetzt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Art von Zellen die Bakterien innerhalb des Gewebes beherbergen.

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Research

Forschung

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Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, "Mix-and-read" Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluoreszenz-Erzeugungseinheit erzeugt...

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Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

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In-situ-Nachweis von Bakterien in Paraffin eingebetteten Geweben Unter Verwendung eines Digoxin-markierte DNA-Sonde Targeting 16S rRNA (Video) | JoVE Journal

In-situ-Nachweis von Bakterien in Paraffin eingebetteten Geweben Unter Verwendung eines Digoxin-markierte DNA-Sonde Targeting 16S rRNA

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