Name: Intramuskuläre Injektionen Entlang der motorischen Endplatten: eine minimal-invasive Ansatz zur Shuttle Tracers Direkt in Motoneuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Lernen Sie eine minimal-invasive Methode zur intramuskulären Injektion von Tracern entlang motorischer Endplatten zur verbesserten retrograden Markierung von Motoneuronen im Rückenmark. Diese Technik unterstützt die Neurowissenschaft.

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Diese Arbeit wurde von einem National Health &amp; Medical Research Centre (NHMRC) Projektförderung zu RM unterstützt

Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren mit der Tierpflege und Ethikkommission der UNSW Australien eingehalten und wurden in Übereinstimmung mit dem National Health und Medical Research Council of Australia Vorschriften für Tierversuche durchgeführt. Alle Verfahren in diesem Protokoll sollte in Übereinstimmung mit den Anforderungen der einschlägigen Tierpflege und Ethik-Kommission durchgeführt werden. 1. Acetylcholinesterase histochemische Färbung <ol><li> Bereiten Sie die Acetylcholinesterase Reaktionsgemisch <ol><li> Add 290 mg Acetylthiocholiniodid zu 200 ml 0,1 M Phosphatpuffer (PB). Mischen mit einem Magnetrührer bei 900 Umdrehungen pro Minute. </li><li> In 600 mg Glycin unter ständigem Rühren. </li><li> Werden langsam 420 mg Kupfersulfat zu der Reaktionsmischung unter kontinuierlichem Rühren, bis das Produkt vollständig gelöst ist. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Haut an der Tierkörper durch Einschnitte (durch Gewebe-Sharing erhalten)in die Haut eines perfundierten Ratte oder Maus, Greifen der Haut von der Hals-Bereich und ziehen zu ihren Füßen. Sicherzustellen, dass die Faszie bedeckt jeden Muskel wird entweder entfernt oder erheblich perforiert, um eine ausreichende Belichtung der Muskelfasern zu der Reaktionslösung zu gewährleisten. </li><li> Tauchen Sie den ganzen Körper oder Gliedmaßen von Interesse in der Reaktionsmischung und Inkubieren O / N bei 4 ° C. </li><li> Für 2 min in destilliertem Wasser waschen den Kadaver. Hinweis: In dieser Phase werden die Muskeln zeigen eine Blaufärbung und die motorischen Endplatten (MdEP) als weiße Punkte zu sehen. </li><li> Expose der Karkasse zu einer 10% Ammoniumsulfid-Lösung für 3-5 sec. Hinweis: Die Muskelfasern schnell braun werden und die Abgeordneten werden beobachtbare als schwarze Punkte gesprenkelt sein. Wenn die Reaktion tritt zu schnell, und die Muskelfasern zu dunkel, um zwischen den Abgeordneten und den Muskelfasern unterscheiden befleckt versuchen mit niedrigeren Konzentrationen von Ammoniumsulfid-Lösung (zB 5%) werden. Die Reaktionszeit, um das zu bekommenoptimalen Kontrast zwischen den Abgeordneten und den Muskelfasern variiert von einer Probe zur anderen. Daher ist es schwierig, die genaue Belichtungszeit an das Reagenz zu definieren. Die Reaktion sollte sorgfältig überwacht werden und angehalten, wenn der Kontrast als angemessen. </li><li> Zweimal Waschen der Karkasse unter Rühren in destilliertem Wasser und sanft pat den Kadaver trocken. </li><li> Fotografie sowohl die lateralen und medialen Aspekte der Extremität, sicherzustellen, dass die Mitglieder des Europäischen Parlaments für alle Muskeln von Interesse erfasst. </li></ol> 2. intramuskuläre Injektionen an den motorischen Endplatten <ol><li> Ziehen Glasmikropipetten mit einer Mikropipette Abzieher (die Verwendung von Mikropipetten mit abgestuften Kolben wird empfohlen). Mit Hilfe eines Binokular, brechen die Spitzen der Mikropipetten mit einer Pinzette, so daß der Innendurchmesser des Lumens des Mikropipette ist etwa 0,5 mm. </li><li> Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumenten verwendet werden frisch autoklaviert und thim OP-Bereich ist steril. </li><li> Füllen Sie die Mikropipetten mit Fluoro-Gold-(5% in destilliertem Wasser). </li><li> Induzieren anaesthetise im Tier in einer Induktionskammer, die mit Isofluoran (4% in O 2). Überprüfen Sie für Aufrichtungsreflexes und Gewährleistung ihrer Abwesenheit, bevor es von der Induktionskammer zu entfernen. Sichern Sie sich einen Nasenkegel über der Schnauze der Ratte und liefern Isofluoran (2% in O 2) zur Aufrechterhaltung der Anästhesie. Klemmen Sie das Tier Zehen und sanft berühren Auge des Tieres, um sicherzustellen, dass sowohl die Pedal Rückzug und die Hornhautreflexe sind nicht vorhanden. Anmerkung: Eine Mischung aus Ketamin und xylazil können ebenfalls verwendet werden (80 und 10 mg / kg, intraperitoneal geliefert). Ketamin ist ein Schedule 8 (&quot;Controlled&quot;) Arzneimittel und notwendigen Protokolle mit dem Kauf, Verwendung, Lagerung und Entsorgung der Droge verbunden müssen eingehalten werden. </li><li> Gelten Auge Schmiermittel Trocknung der Augen bei dem während des Verfahrens zu verhindern. </li><li> Rasieren Sie die targeted Gliedmaßen und die Verwendung Gaze, um die rasierte Fläche mit drei Wechsel scheuert von Chlorhexidin und 70% Alkoholtupfer. Übertragen Sie das Tier auf den OP-Bereich. </li><li> Legen Sie das Tier auf eine saubere Unterlage und positionieren Sie sie angemessen auf eine gute Anbindung an die gezielte Muskel (n) zu gewährleisten. </li><li> Verwenden Sie eine Pinzette mit Zahngriffe, um die Haut über den gezielten Muskel weg von der zugrunde liegenden Muskulatur anzuheben und einen Einschnitt in der Haut mit chirurgische Scheren. Sicherzustellen, dass der Einschnitt ist groß genug, um den Muskel (n) von Interesse vollständig freizulegen. Stellen Sie sicher, dass es eine minimale Unterbrechung der Faszie. </li><li> Verwenden Sie die MEP Fotografien geistig transponieren die Position und Form des Bereichs MEP auf den Muskel (n). Hinweis: Eine feine Filzschreiber könnte helfen, die MEP-Region aus der Fotografie auf den Muskel (n) von Interesse zu reproduzieren. </li><li> Vielfache Injektionen entlang der vollen Länge des Bereichs MEP (für Fluor-Gold, 3 bis 4 Injektionen von 1-2 &amp; mgr; l jedes should ausreichen). Wischen Sie den Muskel (n), um Eindringen zu entfernen. </li><li> Bringen Sie die beiden Enden des eingeschnittenen Haut eng mit stumpfen Pinzette und schließen Sie die Wunde mit Operationsklammern. Infiltrieren 0,1 ml Bupivacain (0,5% in Wasser) (oder andere Lokalanästhetika) entlang der gesamten Spanne der Wunde. </li><li> Drehen Sie den Narkosegerät aus und überwachen die Tier bis es vollständig aus der Narkose erholt. </li><li> Warten für 14 Tage zwischen der Verabreichung intramuskuläre Injektionen und die Perfusion der Tiere. </li></ol> 3. Perfusionen <ol><li> Verabreichung einer letalen Dosis von Pentobarbitonnatrium Lösung (zB Lethabarb; 150 mg / kg) dem Tier durch intraperitoneale Injektion. <ol><li> Das Tier genau zu überwachen, bis eine tiefe Ebene der Narkose erreicht ist, wie durch die Abwesenheit des Pedals Rückzug und den Corneareflexe bestätigt. </li></ol></li><li> Positionieren Sie das Tier auf dem Rücken auf einem Brett über einem Seziertisch gelegt perfusion Waschbecken. </li><li> Verwenden Sie eine Pinzette mit Zahngriffe, um die Haut für die Basis des Brustbeins zu heben. Machen Sie einen kleinen Hautschnitt mit einem Paar starken chirurgische Schere unmittelbar unter dem Brustbein und verwenden Sie dann die Zange zu greifen den Schwertfortsatz Knorpel des Brustbeins. Beim Halten des xiphoid Knorpel vergrössern Einschnitt auf beiden Seiten der Brusthöhle, vom Brustbein zu den Achseln. </li><li> Schneiden Sie die Blende, um das Herz freizulegen. <ol><li> Injizieren 0.ml Heparin direkt in die Spitze des Herzens, um die Koagulation des Blutes zu verhindern. </li><li> Schneiden die Spitze, um das Einführen einer Kanüle in die linke Herzkammer zu ermöglichen, und dann schnell zu klemmen die Kanüle an Ort und Stelle mit Hilfe eines Hämostatikums. </li><li> Einen Einschnitt in den rechten Vorhof mit einem Paar von einer feinen Schere und sofort beginnen die peristaltische Pumpe. Perfusion mit 0,1 M PB, bis die aus dem Atrium strömenden Flüssigkeit ist nahezu frei von Blut und die Farbe der Leber wird hellbraun. Dann Perfusion mit Lösungention von Paraformaldehyd (4% in 0,1 M PB), bis der gesamte Körper des Tieres wird starr. </li></ol></li></ol> 4. Halsmark Dissection und Vorbereitung für die Histologie <ol><li> Legen Sie das Tierkörper auf seiner Unterleib. </li><li> Schneiden Sie die Haut auf die Körpermittellinie mit einem Skalpell und beziehen sie aus der Basis des Schädels, um das Niveau des Darmbein. </li><li> Messer durch und spiegeln die paravertebralen Muskeln, um die dorsalen Aspekt der Wirbelsäule freizulegen. </li><li> Identifizieren Sie die knöchernen Dornfortsatz des Atlas, der zweiten Halssegment (dh, C2), und entfernen Sie sie mit einem Paar von chirurgischen Knochenzangen oder Pinzetten, um den entsprechenden Basiswert Algan finden. <ol><li> Identifizieren Sie den rechten C2 root durch Färben mit einem permanenten Filzstift. </li><li> Nehmen Sie die nächste Wirbel einer nach dem anderen und markieren Sie die rechten dorsalen Wurzeln mit wechselnder Farbe (also C2, C4, C6 und C8 können in grün und C3 eingefärbt werden, C5, C7, T1 kann col seinODER-Verknüpfung in blau). </li></ol></li><li> Mit einem kleinen chirurgischen Nadel (beispielsweise 30 G Nadel) vorsichtig durchstechen die Dura, die die untere Ende des Rückenmarks. Mit der Abschrägung der Nadel nach oben, heben Sie die Dura von der Schnur während der Bewegung der Nadel rostral um einen Längsschlitz zu machen. <ol><li> Spiegeln die Dura. </li></ol></li><li> Schneiden Sie das Rückenmark quer in Ein- oder Zweisegmentblöcken mit einem neuen Skalpellklinge. <ol><li> Lassen Sie die Rückenmarksegmente in situ und für jeden Block, sorgfältig einen kleinen Bezugsmarke auf der linken Seite jedes Blocks mit der Skalpellklinge in der Mitte zwischen zwei benachbarten Wurzeln. Sicherzustellen, dass die Bezugsmarkierung ist tief genug, durch das Gewebe, um von der ventralen Seite der Blöcke sichtbar. Machen Sie den Bezugsmarke in einem Winkel von etwa 45 ° und deutete entweder anterior oder posterior in Bezug auf Tieranatomie, um in der Orientierung der Gewebesegment folgende Dissektion unterstützen. </li></ol></li><li> Sammeln Sie die einzelnen Blöcke in kleine, klar gekennzeichnet Flaschen, die eine Lösung von Paraformaldehyd (4% in 0,1 M PB) und lassen bei RT O / N. </li><li> Übertragen Sie die Bausteine ​​in sauberen, deutlich etikettierten Flaschen, die eine Lösung von Saccharose (30% in 0,1 M PB) und halten bei 4 ° C für mindestens zwei Tage. </li><li> Legen Sie die Segmente in Kryo-Formen und bedeckte sie mit Gewebe Einfriermedium. Für Längs histologischen Präparat, orientieren Sie die Blöcke mit der dorsalen Seite nach oben und verwenden Sie die Bezugsmarke, um den Block in der Kryo-Formen zu orientieren. </li><li> Frieren Sie die Kryo-Formen bei -20 ° C und schneiden mit einem Kryostat in 50 &amp; mgr; m dicke Schnitte. Anmerkung: Die Abschnitte können direkt auf die Adhäsion von Objektträgern montiert werden und trocknen gelassen O / N. Alternativ können die Abschnitte in 48-Well-Platten mit 0,1 M PB gefüllt flotiert werden und anschließend mit Hilfe der Bezugsmarkierung, um die Gewebeschnitten auf den Objektträgern befestigt zu orientieren. </li></ol> 5. Lendenwirbelsäule Cord Dissection und Vorbereitung für die Histologie <ol><li> Legen Sie das Tierkörper auf dem Rücken. </li><li> Führen Sie ein Mittellinienschnitt entlang der Bauch des Tieres und entfernen Sie die Eingeweide. Sezieren die Muskeln der hinteren Bauchwand, den ventralen Seite der Wirbelsäule freizulegen. </li><li> Suchen Sie den Kurzschwanz-Rippe und die meisten der angrenzenden Wirbelkörper T13 T13, wo der ventralen Wurzel verlässt den Knochen. <ol><li> Nacheinander zu entfernen einen nach dem anderen der zwei oder drei Wirbel rostral T13 (dh, T12, T11 und, falls erforderlich, T10) mit feinen chirurgischen Knochenzangen, um die T13 ventralen Wurzel bis zu seiner Eintrittspunkt in der ventralen Aspekt der ventralen Kabel zu folgen und markieren Sie es mit einem permanenten Filzstift. </li><li> Von diesem Punkt an, wiederholen Sie den Vorgang, um den Ort der ventralen Wurzel Einstiegspunkte für L1, L2, L3, L4, L5, L6 und S1 zu identifizieren, mit wechselnder Farbe und färben sie. </li></ol></li><li> Gehen Sie genauso vor, wie in Abschnitt 4,5 bis 4,10 für lum beschriebenBar Rückenmark Dissektion. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Intramuskulär Targeting und anschließende Rückübertragung von therapeutischen Transgenen zu den entsprechenden α-Motoneuronen zur experimentellen Behandlung von neuromuskulären Zustand ist keine neue Strategie. Zum Beispiel hat dieses Liefermethode wurde verwendet, um die neuromuskuläre Degeneration in verschiedenen Stadien des ALS Progression SOD1 Mäusen und Ratten 1,9-12 sowie in Mäusen mit SMA 13 verzögern. Obwohl vielversprechend, die Wirksamkeit dieser Gentherapie Szenarien begrenzt wurde. In ...

Der Verlust der Kontrolle über willkürliche Bewegung, die von neurologischen Erkrankungen wie Motoneuronerkrankung führt und Spinal- als auch Duchenne Muskelatrophie ist eine schwächende Krankheit, die hohe und lang anhaltende Auswirkungen auf den Alltag der Betroffenen hat. Während des letzten Jahrzehnts, Forschungsanstrengungen zu stoppen oder zumindest zu verzögern die schädlichen Auswirkungen dieser neuromuskulären Erkrankungen ist eine Priorität für viele Ärzte und Wissenschaftler auf der ganzen Welt. In dieser Hinsicht ist die neueste Generation von Tiermodellen, die diese neuromuskulärer Krankheiten nachahmen war maßgeblich bei der Erlangung grundlegende Einsichten in die physiologischen Mechanismen, die der Entwicklung und Progression von diesen Bedingungen 1-13 Basiswert. Behandlung dieser neuromuskuläre Erkrankung ist ein direkter Zugriff auf das Rückenmark und durch Rückenmarks Injektionen 14,15 erreicht werden. Jüngste Fortschritte in der Gentherapie wurden ins Visier der quergestreiften Muskulatur des oberen undunteren Gliedmaßen Shuttle therapeutische Gene in die entsprechenden α-Motoneuronen, die innerhalb des Vorderhorns des Rückenmarks 1,9-13 befinden. Allerdings hat diese einst vielversprechende Strategie versäumt, den Ausgang dieser neurologischen Erkrankungen zu verbessern. Während es ist fair zu schließen, dass diese schlechte Ergebnisse könnte, zumindest teilweise auf die geringe Wirksamkeit dieser Schutz Gene sein, kann man die geringe Wirksamkeit dieser Gentransferverfahren nicht aus. Motor Endplatten (MEPs) sind spezialisierte Regionen der Skelett Muskelfasern, die von den Axonterminalen großer peripheren motorischen Fasern aus α-Motoneuronen Ursprung eingerückt sind. Zusammen bilden die peripheren Nervenfaserenden und die Abgeordneten bilden die neuromuskulären Synapse, dh der Ort, an dem synaptischen Impulse werden von der anterograde Freisetzung des Neurotransmitters Acetylcholin ausgelöst. Wichtig ist, daß die Beziehung zwischen peripheren Nervenfasern und der MEPs bi-direclen, obwohl verschiedene Motoren sind für den Transport von Molekülen und Organellen in Richtung als auch weg von dem Neuron verantwortlich somata 16-18. Angesichts dieser anatomischen Erwägungen erscheinen die Abgeordneten, um die Ziele der Wahl für die Lieferung und anschließender retrograden Transport von genetischem Material in die entsprechenden motorischen Neuronen sein. In diesem Zusammenhang ist es nicht überraschend, dass der Erfolg der Motoneuronen Transduktion hängt stark von dem Abstand zwischen der intramuskulären Injektion von viralen Vektoren und MEPs 19-20 des Muskels. Überraschenderweise ist jedoch die genaue Lage der MEP Zonen an den Muskelfasern des Labor Ratte und Maus, die beiden Arten der Wahl, um neuromuskuläre Erkrankungen modellieren, die bis vor kurzem nicht möglich. Wir haben umfassende Karten der Region MEP für mehrere Vorderbein Muskeln bei der Ratte und der Maus 21-22 produziert. Vor kurzem haben wir die Einzelheiten der Organisation des MEP r gezeigtegion für mehrere Muskeln der Maus Hinterlauf 23 und wir sind derzeit die Analyse der Merkmale der Abgeordneten an der Ratte Hinterlauf. In unseren Händen hielt intramuskuläre Injektionen von retrograder Tracer auf die gesamten MEP Zonen in diesen Muskeln gerichtet zu mehr markierte Motoneuronen, die mehr Rückenmarksegmente spannt sind als bisher angenommen. Hier stellen wir das Protokoll, das in den letzten Jahren entwickelt worden ist, um den Standort der MEPs auf der äußeren Oberfläche als auch über die Tiefe der Hintergliedmaßen und Vorderbein Muskeln zeigen sowohl in der Maus und der Ratte.

<table><tbody><tr><td>Fluor-Gold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>null</td><td>verdünnt auf 5%</td></tr><tr><td>Drummond PCR Mikropipetten 1-10 & Mikro; l</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td>mit Kolben</td></tr><tr><td>Acetylthiocholin Iodid</td><td>Sigma Life Science</td><td>A5751-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61230-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Ajax Finechem</td><td>1083-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Tetramethylrhodamin und Biotin</td><td>Life Technologies</td><td>D-3312</td><td>Diliutiert in destilliertem Wasser</td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Provet</td><td>ISOF00</td><td>1000 mg/g Isofluran Inhalationsdampf</td></tr><tr><td>Autoclip 9 mm Wound Clips</td><td>Texas Scientific Instruments, LLC</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>Lethabarb Enthanasia Injection</td><td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td><td></td><td></td>LETHA450</tr><tr><td>Formaldehydlösung</td><td>Ajax Finechem</td><td>A809-2.5L PL</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Objektträger</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1952</td><td>Verdünnt auf 10%</td></tr><tr><td>Marcain Spinal 0,5% (Bupivacainhydrochlorid)</td><td>Astrazenca</td><td></td><td>Verdünnt auf 0,25%</td></tr></tbody></table>

intramuskuläre injektionen entlang der motorischen endplatten: eine minimal-invasive ansatz zur shuttle tracers direkt in motoneuronen

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Krankheiten, die die Integrität des Rückenmarks Motoneuronen gehören zu den schwächenden neurologischen Erkrankungen. In den letzten Jahrzehnten hat sich die Entwicklung der verschiedenen Tiermodellen dieser neuromuskulären Erkrankungen die wissenschaftliche Gemeinschaft mit anderen therapeutischen Szenarien bei Verzögerung oder Umkehren des Fortschreitens dieser Bedingungen ausgerichtet ist. Durch Ausnutzung des Rück Maschinen von Neuronen, wobei einer dieser Ansätze hat, um die Skelettmuskulatur um Shuttle therapeutische Gene in entsprechende Rückenmarksmotoneuronen zu zielen. Obwohl einmal vielversprechend, wurde der Erfolg einer solchen Gentransfer Ansatz der suboptimalen Anzahl der transduzierten Motoneuronen es bisher gezeigt, ergeben behindert. Motor Endplatten (MEP) sind hochspezialisierte Bereiche auf der Skelettmuskulatur, die in direktem Kontakt mit dem synaptischen Rückenmarks α Motoneuronen sind. In dieser Hinsicht ist es wichtig zu beachten, dass, so weit die Bemühungen, retrogradTransfer von Genen in Motoneuronen wurden ohne Bezug auf die Lage der Region MEP in die gezielten Muskeln. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll 1), um die genaue Lage der Abgeordneten auf der Oberfläche der Skelettmuskulatur zu offenbaren und 2), diese Informationen zu verwenden, um die intramuskuläre Lieferung und anschließende optimale retrograden Transport von retrograde Tracer in Motoneuronen zu führen. Wir hoffen, dass die Ergebnisse aus diesen Experimenten Tracing in weiteren Studien zu untersuchen retrograden Transport von therapeutischen Genen, um Rückenmark Motoneuronen durch die Ausrichtung der Europaabgeordneten zu nutzen.

Acetylcholinesterase histochemische Färbung zeigt den Standort der motorischen Endplatten über die Breite der Muskeln. 1 zeigt die Ergebnisse einer solchen Färbung auf einem ganzen Rattenvorderbein durchgeführt. Es wird vorgeschlagen, um die Konzentration des Ammoniumsulfidlösung zu optimieren (z. B. 5-7% anstelle von 10%), wenn die nicht-spezifische Hintergrundfärbung auf die Muskelfasern zu sowie der Zeit wird die Probe in die Lösung eingetaucht trieben. 2 veranschaulicht ein...

Die Wirksamkeit der intramuskulären Aufnahme und des retrograden Transports von Molekülen zu den entsprechenden Motoneuronen hängt von der Lage der Injektionsstellen in Bezug auf die motorischen Endplatten (MEPs) ab. Hier beschreiben wir, wie MEPs auf der Skelettmuskulatur lokalisiert werden können, um den retrograden Transport von Tracern in die Motoneuronen zu optimieren.

Intramuskuläre Injektionen Entlang der motorischen Endplatten: eine minimal-invasive Ansatz zur Shuttle Tracers Direkt in Motoneuronen

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Wirksamkeit des retrograden Transports neuroanatomischer Marker zu den Motoneuronen des Rückenmarks nach intramuskulärer Injektion zu erhöhen. Dies wird erreicht, indem eine acetylcholinesterase-histochemische Reaktion in einem simulierten Zielgewebe initiiert wird, um die Lage der motorischen Endplatten in der Muskulatur des Tieres zu identifizieren. Im zweiten Schritt werden intramuskuläre Injektionen des retrograden Markers entlang der gesamten Ausdehnung des Bereichs der motorischen Endplatten durchgeführt.An den betroffenen Muskeln werden die Tiere anschließend 14 Tage lang gehalten, um den Transport des Tracers in das Rückenmark zu ermöglichen. Motorische Neuronen, die letztendlich die gesamte Länge des motorischen Endplattenbereichs innervieren, führen unter Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie zu einer höheren Anzahl markierter motorischer Neuronen, die sich über mehrere Segmente des Nagetier-Rückenmarks erstrecken. Die Bedeutung dieser Studie reicht bis zur Entwicklung von Therapien bei neuromuskulären Funktionsstörungen, zu denen Rückenmarkverletzungen und amyotrophe Lateralsklerose gehören.Da dies eine minimalinvasive und daher klinisch relevante Methode zur Übertragung therapeutischer Gene in das Rückenmark und die Motoneurone darstellt, haben in der Regel Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die motorischen Endplattenbereiche in der Muskulatur lebender Tiere nicht sichtbar gemacht werden können. Eine visuelle Demonstration dieser Technik ist entscheidend, da die intramuskulären Injektionen die mentale Übertragung der Lage der motorischen Endplatte auf die Muskulatur erfordern. Um eine Karte der motorischen Endplatte für die intramuskuläre Injektion anzufertigen, tauchen Sie den enthauteten Körper oder das betreffende Glied zunächst über Nacht in das Reaktionsgemisch ein und inkubieren es bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen spülen Sie die Leiche zwei Minuten lang mit destilliertem Wasser ab.In diesem Stadium weisen die Muskeln eine blaue Färbung auf und die motorischen Endplatten erscheinen als weiße Punkte. Tauchen Sie den Kadaver in Ammoniumsulfid, waschen Sie den Kadaver dreimal, trocknen Sie das Gliedmaßen ab und detektieren Sie den MEP-Bereich. Analysieren Sie anschließend den Kontrast, um den lebenden Muskel an den motorischen Endplatten zu injizieren. Zunächst verwenden Sie einen Mikropipettenzug, um gestufte Glas-Mikropipetten, die mit Kolben ausgestattet sind, zu ziehen. Danach brechen Sie unter Verwendung eines Stereomikroskops die Spitzen der Mikropipetten mit einer Pinzette so ab, dass der Innendurchmesser jedes Lumens etwa 0,5 Millimeter beträgt.Füllen Sie dann die Pool-Pipetten mit Flora Gold. Tragen Sie nun Augenschmiermittel auf ein anästhesiertes Tier auf und rasieren Sie die zu injizierende Extremität. Wischen Sie den rasierten Bereich mit Mulltuch durch dreimaliges abwechselndes Abreiben mit Chlorhexidin und 70 %igem Alkohol ab.Legen Sie das Tier dann auf eine saubere Unterlage, um Zugang zum Zielmuskel zu erhalten. Wenn sich das Tier in der richtigen Position befindet, heben Sie mit einer Zahnzange die Haut über dem Zielmuskel von der darunterliegenden Muskulatur ab und führen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt in die Haut ein. Achten Sie darauf, dass der Einschnitt groß genug ist, um den Muskel von Interesse vollständig freizulegen, ohne die Faszie übermäßig zu beeinträchtigen.Danach mithilfe der Fotografien der motorischen Endplatte die Lage und Form des interessierenden Bereichs der motorischen Endplatte mental auf den Muskel übertragen und entlang der gesamten Länge des Bereichs der motorischen Endplatte drei bis vier Injektionen von ein bis zwei Mikroliter Floral Gold vornehmen. Nach der letzten Injektion den Muskel vorsichtig abwischen, um austretende Flüssigkeit zu entfernen. Anschließend mit stumpfen Pinzetten die beiden Enden des eingeschnittenen Hautgewebes aneinander annähern, die Wunde mit chirurgischen Clips verschließen und die gesamte Ausdehnung der Wunde mit dem geeigneten Lokalanästhetikum infiltrieren.Zwei Wochen nach den Injektionen perfundieren Sie das Tier intrakardial mit Fixans. Um das zervikale Rückenmark zu präparieren, legen Sie das Tier in Bauchlage und schneiden mit einem Skalpell die Haut entlang der Körpermitte. Klappen Sie die Haut vom Schädelbasis bis zur Höhe des Darmbeins nach lateral um.Schneiden Sie dann die paravertebralen Muskeln durch und klappen Sie sie zurück, um die dorsale Seite der Wirbelsäule freizulegen. Nachdem Sie den knöchernen Dornfortsatz des Axis identifiziert haben, entfernen Sie das Segment mit der Pinzette, um die darunterliegende dorsale Wurzel zu lokalisieren. Markieren Sie die rechte C2-Wurzel mit einem permanenten Filzstift.Entfernen Sie anschließend die aufeinanderfolgenden Wirbel nacheinander und markieren Sie die rechten dorsalen Wurzeln abwechselnd mit verschiedenen Farben. Hier wurden beispielsweise C 2, 4, 6 und 8 blau gefärbt, während C 3, 5, 7 und T 1 schwarz markiert wurden. Verwenden Sie danach eine chirurgische Nadel mit 30er Gauge, um vorsichtig durch die Dura zu stechen, die das untere Ende des Rückenmarks bedeckt, wobei die Schräge der Nadel nach oben zeigt.Heben Sie die Dura vom Rückenmarkstrang ab, während Sie die Nadel vorsichtig bewegen. Um einen Längsschnitt zu erstellen und die Dura zu reflektieren, verwenden Sie eine neue Skalpellklinge, um das Rückenmark quer in ein- bis zweisegmentige Blöcke zu schneiden, was bei der Orientierung des Gewebesegments nach der Dissektion hilft. Lassen Sie die Segmente an Ort und Stelle, und setzen Sie für jeden Block mit dem Skalpell vorsichtig eine kleine Orientierungsmarke auf der rechten Seite jedes Blocks, jeweils in der Mitte zwischen den beiden benachbarten Wurzeln. Danach die Gewebeproben für die histologische Analyse vorbereiten, indem die einzelnen Blöcke in kleine, deutlich beschriftete Fläschchen mit Paraldehyd überführt werden und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert werden. Am nächsten Morgen die Blöcke in neue Fläschchen mit Saccharoselösung bei vier Grad Celsius überführen. Nach mindestens zwei Tagen die Segmente in einzelne Kryoschneidformen bringen.Positionieren Sie die Gewebeproben mit der dorsalen Seite nach oben und bedecken Sie sie mit einem Gefriermittel für Gewebe. Anschließend frieren Sie die Kryoschnittprofile bei minus 20 Grad Celsius ein und schneiden 50 µm dicke Schnitte mit einem Kryostaten. Um das lumbale Rückenmark zu präparieren, legen Sie das Tier in Rückenlage und führen einen medianen Schnitt entlang des Abdomens durch.Entfernen Sie die Eingeweide und dissezieren Sie die Muskeln der hinteren Bauchwand. Um die ventrale Seite der Wirbelsäule freizulegen, finden Sie die kurze Rippe des letzten Rippenpaares und den benachbarten Wirbel T13, wo die vordere Wurzel von T13 das Knochengewebe verlässt. Entfernen Sie anschließend mithilfe feiner chirurgischer Pinzetten nacheinander bis zu drei Wirbel kranial von T13, um der vorderen Wurzel von T13 bis zu ihrem Eintrittspunkt und zur ventralen Seite des ventralen Rückenmarks zu folgen.Kennzeichnen Sie die Ventralkommissur mit einem permanenten Filzstift. Entfernen Sie anschließend die Wirbel, wie zuvor gezeigt, und markieren Sie L1 bis L6 sowie S1 mit Farbe, um ihre einfache Identifizierung zu ermöglichen. Zuletzt dissezieren Sie die Gewebeproben und bereiten Sie sie wie zuvor demonstriert für die Histologie vor. Während der histoenzymatischen Färbung auf Acetylcholinesterase sind die motorischen Endplatten des musculus trapezius acromialis, des musculus spinalis deltoideus und des musculus triceps brachii als weiße, gepunktete Flecken erkennbar, die eine durchgehende Linie bilden, welche die gesamte Breite des Muskels überquert, während die Muskel­fasern einen grünblauen Farbton annehmen.Nach der Einweichung und Behandlung mit Ammoniumsulfid färbten sich die motorischen Endplatten schwarz über den braunen Muskel­fasern. Anschließend wurde ein retrograder neuronaler Tracer entlang der gesamten Region der motorischen Endplatte am dreiköpfigen Muskel eines lebenden Mäuses injiziert. Wie erwartet markierte der Tracer motorische Neurone, die eine längs verlaufende Säule bildeten und sich über mehrere Segmente des Rückenmarks erstreckten, wobei ausschließlich ein Teilbereich der motorischen Endplattenregion angezielt wurde, wie hier durch die grünen, blauen oder roten Bereiche des Musculus triceps brachii gezeigt.Die motorische Endplattenregion des Musculus brachii führt zu einer verminderten Markierung der Motoneurone, wie durch die grünen, blauen oder roten motorischen Spalten gezeigt wird. Daher muss zur maximalen Aufnahme des Tracers in die versorgenden Motoneurone die gesamte Endplattenregion nach diesem Verfahren injiziert werden. Andere Methoden wie die Immunhistochemie oder die stereologische Zellzählung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zu Antigen-Antikörper-Reaktionen und zur Morphologie markierter Motoneurone nach deren Entwicklung.Diese Technik hat für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg geebnet, therapeutische Strategien wie die Gentherapie sowie ER-Rodentienmodelle neuromuskulärer Dysfunktionen zu entwickeln.

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Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

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Intramuskuläre Injektionen Entlang der motorischen Endplatten: eine minimal-invasive Ansatz zur Shuttle Tracers Direkt in Motoneuronen (Video) | JoVE Journal

Intramuskuläre Injektionen Entlang der motorischen Endplatten: eine minimal-invasive Ansatz zur Shuttle Tracers Direkt in Motoneuronen

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