Silencing

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Expression von B RCA zwei durch Transfektion mit SIR A zu unterdrücken. Dies wird erreicht, indem zunächst die SIR a-Transfektionsreagenz-Komplexe hergestellt werden. Anschließend wird eine erste Transfektionsrunde durchgeführt, bei der die Komplexe tropfenweise auf eine Zellmonolayer mit 80 % Konfluenz gegeben werden. Danach erfolgt eine zweite Runde der SIR a-Transfektion mit einem höheren Verhältnis von SIR A zu Transfektionsreagenz.

Schließlich werden die Zellmonolagen mit eiskaltem PBS gewaschen und die Zellen bei vier Grad Celsius mit einem auf Tensiden basierenden Lysepuffer lysiert. Abschließend wird mittels Western-Blot-Analyse die Stummschaltung von B RCA A zwei auf Proteinebene nachgewiesen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie eine effiziente Genstummschaltung sowie eine optimale Detektion von Proteinen mit hohem Molekulargewicht, wie dem Tumorsuppressor B RCA zwei, ermöglicht. Um zu beginnen, nachdem humane epitheliale Zellmonolagen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einer befeuchteten Kammer kultiviert wurden, entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen die Zellen mit PBS bei Raumtemperatur.

Um die Zellen von der Platte zu lösen, zwei Milliliter einer 0,25 %igen Trypsin-0,53 Millimolar-EDTA-Lösung hinzufügen und je nach Zelltyp drei bis fünf Minuten lang inkubieren. Die Trypsinwirkung durch Zugabe von zwei Milliliter komplettem Wachstumsmedium mit 10 % FBS neutralisieren, bevor die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt werden. Die Röhrchen in einen Schwenkkorbrotor geben und bei 320 bis 330 × g und vier Grad Celsius drei Minuten lang zentrifugieren.

Verwenden Sie fünf Milliliter antibiotikafreies Medium, um die Pellets aufzuschwemmen, bevor Sie mit einer Burker-Kammer oder einem automatisierten Zählverfahren die Zellen zählen. Säen Sie anschließend etwa 0,5 bis 1 × 10⁶ Zellen in zwei Milliliter antibiotikafreiem Medium pro Vertiefung in eine 6-Loch-Platte aus und inkubieren Sie 24 Stunden lang bis zu 80 % Konfluenz. Führen Sie danach eine erste Transfektionsrunde durch, indem Sie sechs Mikroliter lipidbasiertes, auf irna spezifisches Transfektionsreagenz in 130 Mikrolitern Medium mit reduziertem Serum verdünnen.

Verdünnen Sie drei Mikroliter eines 10-Mikromolar-S-irna in 130 Mikrolitern Medium mit reduziertem Serum. Kombinieren Sie die verdünnte irna mit einem verdünnten Transfektionsreagenz und inkubieren Sie fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur. Während der Inkubation entfernen Sie das Medium von den Zellen und geben zwei Milliliter frisches Medium ohne Antibiotika hinzu.

Vorwärmen bei 37 Grad Celsius. Anschließend 250 Mikroliter der siRNA-Transfektionsreagenz-Komplexe zu jeder Vertiefung mit Zellen in einer 6-Loch-Platte geben. Danach die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren.

Nach 24 Stunden verdünnen Sie fünf Mikroliter einer 10-Mikromolar-lRNA-Lösung in 130 Mikrolitern Medium mit reduziertem Serum und führen, wie gerade gezeigt, eine zweite Transfektionsrunde durch. Die hohe Konzentration an sarna in der zweiten Runde ist entscheidend, um eine hohe Effizienz der B rca. A-zwei-Silenzierung zu erzielen.

Inkubieren Sie die Zellen vor der Analyse einen bis zwei Tage bei 37 Grad Celsius, um das Zelllysat für die Immunoblot-Analyse vorzubereiten. Bereiten Sie frischen Lysepuffer gemäß dem hier gezeigten Rezept her. Entfernen Sie das Medium von den Zellen und geben Sie zwei Milliliter pro Vertiefung eiskalte PBS zu, um die Zellen zu waschen.

Entfernen Sie anschließend vollständig das PBS von der Platte und geben Sie 200 Mikroliter eiskalte Lysepuffer zu jedem Probengefäß hinzu. Drehen Sie die Platte vorsichtig, um den Lysepuffer gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem Rotator. Verwenden Sie dann einen Zellabstreifer.

Sammeln Sie das Zelllysat in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, zentrifugieren Sie bei 17.900 Gs und vier Grad Celsius für 25 Minuten und sammeln Sie das Überstand zur Durchführung der Immunblot-Analyse. Bereiten Sie den Laufpuffer durch Verdünnung von 50 Millilitern 20× Tris-Acetat-SDS-Laufpuffer mit 950 Millilitern destilliertem Wasser vor. Bereiten Sie die Probe wie folgt vor.

Fügen Sie 15 Mikrogramm Gesamtzelllysat hinzu. Fünf Mikroliter vierfachen Probenpuffer, der Lithium-ESAL-Sulfat pH 8,42, 2 Mikroliter 0,5-molarer DTT und Lysepuffer enthalten, auf ein Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern. Denaturieren Sie die Proben bei 55 Grad Celsius für 10 Minuten.

Es ist entscheidend, diese Temperatur zu verwenden, da das Protein b RCA zwei thermosensitiv ist. Richten Sie als Nächstes die elektrophoretische Kammer gemäß den Herstelleranweisungen ein. Laden Sie dann die Proben zusammen mit 10 Mikrolitern eines Proteinstandards mit hohem Molekulargewicht auf ein vorgefertigtes Gel auf und führen Sie den Lauf bei 120 Volt für etwa zwei Stunden durch.

Bereiten Sie derweil den Transferpuffer mit 50 Millilitern 20×-Transferpuffer, 100 Millilitern 100% Methanol und 850 Millilitern Wasser vor. Aktivieren Sie die PVDF-Membran, indem Sie sie fünf Minuten lang in 100% Methanol einweichen. Spülen Sie sie anschließend mit destilliertem Wasser und equilibrieren Sie sie mindestens fünf Minuten lang im Transferpuffer.

Die Schwämme der Transfervorrichtung bis zur Verwendung in Transferpuffer bei vier Grad Celsius einweichen. Den Lauf anhalten, bevor der 55-Kilodalton-blaue Marker das vorgefertigte Gel verlässt, und das Sandwich beginnend mit drei in Transferpuffer getränkten Schwämmen zusammenbauen. Danach ein drei mm dickes Papier, das in Transferpuffer gesättigt ist.

Fügen Sie anschließend das Gel hinzu, danach die aktivierte PVDF-Membran, gefolgt von einem mit Puffer getränkten 3M-Filterpapier und schließlich drei getränkten Schwämmen. Stellen Sie den Stapel in die Apparatur und übertragen Sie die Proteine bei 350 Milliampere für vier Stunden bei vier Grad Celsius oder bei 180 Milliampere und vier Grad Celsius über Nacht. Nach der Übertragung waschen Sie die Membran mit TBS und blockieren Sie sie eine Stunde lang mit TBST und 5 % fettfreier Trockenmilch.

Danach den Puffer durch neun Milliliter TBST-Milchpuffer ersetzen, der 30 Mikroliter Anti-BCA-2-Kaninchen-Polyklonaler Antikörper enthält, und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach dreimaligem Waschen der Membran mit TBST je zehn Minuten den Filter eine Stunde lang mit einem Mikroliter mit Meeresrauten-Peroxidase konjugiertem sekundärem Anti-Kaninchen-Antikörper, der in 10 Milliliter TBST-Milchpuffer verdünnt wurde, inkubieren. Nach dreimaligem Waschen der Membran die chemilumineszente Immunodetektion nach KEMMA gemäß den Herstelleranweisungen durchführen.

Die Banden auf hochauflösenden ECL-Filmen sichtbar machen, um die Spezifität der BRCA1-Silenzierung zu bestätigen. Eine scrambled RNA wurde parallel zu der BRCA1-RNA verwendet, wie hier gezeigt. Wie bereits erwähnt, ist es wichtig, eine zweite Runde der RNA-Transfektion mit einem hohen RNA-zu-Transfektions-Verhältnis durchzuführen, um eine hohe Effizienz der BRCA1-Silenzierung zu erzielen.

Die hier gezeigten Ergebnisse verdeutlichen den Unterschied in der Knockdown-Effizienz zwischen einer niedrigen und einer hohen siRNA-zu-Transfektions-Ratio, abhängig vom Zelltyp. Der optimale Mindestzeitpunkt für die stärkste Genstummschaltung nach der zweiten siRNA-Transfektion kann variieren; wie in dieser Abbildung dargestellt, sind beispielsweise 24 Stunden für NTHY-Schilddrüsenzellen ausreichend, während bis zu 48 Stunden für einen effizienten B RCA A zwei-Knockdown in PNT1A-Prostatazellen erforderlich sind. Die B RCA A zwei-Silenzierung bleibt bis zum siebten Tag nach der zweiten Transfektionsrunde recht stabil. Wie bereits erwähnt, führt das Denaturieren der Zelllysate bei einer Temperatur über 55 Grad Celsius zu einem Verlust von bis zu 50 % des B RCA A zwei-Proteins.

In diesem Experiment wurde die Empfindlichkeit von B RCA A zwei stillgelegten PNT ein A-Zellen gegenüber dem PARP-Inhibitor Rucaparib nach einer 24-stündigen Behandlung mit dem Wirkstoff untersucht. Ein zeitabhängiger Rückgang der Zellproliferation wurde in B RCA zwei-verarmten PNT ein A-Zellen im Vergleich zu Kontrollen beobachtet. Nach Anschauen dieses Videos sollte man ein gutes Verständnis dafür haben, wie man lange proteincodierende Gene mittels einer CRNA stilllegen und deren Proteinprodukt neben BRC zwei mithilfe eines optimierten Immuno-Blockierungsverfahrens effizient nachweisen kann.

Dieses Vorgehen kann auf viele andere anspruchsvolle große Proteine angewendet werden, insbesondere wenn sie in den Zellen in sehr geringen Mengen exprimiert werden.