Name: Silencing BRCA2 Zum Novel BRCA2-regulierten Biologische Funktionen in kultivierten menschlichen Zellen zu identifizieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Erfahren Sie die siRNA-vermittelte Gen-Silencing-Methode für BRCA2 in kultivierten menschlichen Zellen. Diese Technik ermöglicht effizientes Knockdown und optimale Detektion hochmolekularer Tumorsuppressorproteine mittels Western Blot.

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Diese Arbeit wurde durch FIRB-Merit-Zuschüsse RBNE08YFN3_005 und RBNE08HWLZ_012 und das italienische Ministerium für Wirtschaft und Finanzen an das CNR für das Projekt "FaReBio di Qualità" unterstützt.

1. Bereiten siRNA-Lösungen <ol><li> Resuspendieren 5 nmol von verschlüsselten (Strg) und 5 nmol BRCA2 siRNA getrockneten Pellets in 100 ul RNase-freies Wasser (final siRNA-Konzentration: 50 um). Dies ist die siRNA Lager und muss bei -20 ° C in 10 &amp; mgr; l Aliquots gelagert werden. </li><li> Einen aliquoten von 10 &amp; mgr; l von der siRNA Lager und fügen Sie 40 ul RNase-freies Wasser, das 10 uM siRNA Arbeitslösung zu erhalten. Diese Verdünnung ist bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. HINWEIS: Die siRNA Arbeitslösung sollte nicht unterzogen Einfrieren / Auftauen mehr als 3 mal. </li></ol> 2. Seeding der Menschen Epithelzelllinien <ol><li> Entfernen des Wachstumsmediums aus menschlichen epithelialen Zellinien wachsen als Zellmonoschichten in Gewebekulturplatten in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Die Zellen in der Platte einmal mit RT PBS (10 ml PBS für eine 100 mm-Platte) zu waschen. </li><li> Um die Zellen von der Platte zu trennen,2 ml 0,25% Trypsin / 0,53 mM EDTA-Lösung und Inkubation 3-5 min, je nach Zelltyp. </li><li> Vor dem Sammeln der abgelösten Zellen neutralisieren Trypsin durch Zugabe von 2 ml komplettem Wachstumsmedium enthaltend 10% fötales Rinderserum enthielt. </li><li> Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Tube. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 320-330 g für 3 Minuten bei 4ºC in einem Schwingbecher-Rotor. </li><li> Resuspendieren des Zellpellets in 5 ml von Antibiotika-freiem Medium. </li><li> Zähle die Zellen unter dem Mikroskop in einer Burker Kammer oder durch Verwendung eines automatischen Zählsystem nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Seed die Zellen in 6-Well-Platten auf etwa 80% konfluent nach 24 Stunden (0,5-1 x10 6 Zellen in 2 ml Medium für jede Vertiefung) sein. Optimale Zellennummer ausgesät werden können, abhängig von den spezifischen Zellen und der Wachstumsrate variieren. HINWEIS: Antibiotika im Medium Fügen Sie nicht an dieser Stelle, weil Antibiotika negativ mit der Effizienz der transfe störenction. Es ist sehr wichtig, dass die Zellen bei niedrigen Kulturpassagen (&lt;10), um einen hohen Wirkungsgrad der BRCA2 siRNA-Transfektion zu erzielen. </li></ol> 3. Transfektion von Zellen mit siRNA <ol><li> Vierundzwanzig Stunden nach der Plattierung der Zellen, fahren Sie mit der ersten Runde der Transfektion. <ol><li> Verdünnen 6 ul Lipidbasis 10 siRNA spezifischen Transfektionsreagenz in 130 &amp; mgr; l reduziert Serummedium. </li><li> Verdünnen 3 ul von 10 uM siRNA (30 pmol) in 130 &amp; mgr; l reduziert Serummedium. </li><li> Kombinieren Sie die verdünnten siRNA mit der verdünnten Transfektionsreagenz und Inkubation für 5-10 min bei RT. </li><li> Während der Inkubation, entfernen Sie das Medium aus den Zellen und 2 ml frischem Medium bei 37 ° C vorgewärmt (ohne Antibiotika). </li><li> Fügen Sie 250 ul der siRNA-Transfektionsreagenz Komplexe zu den Zellen (dieser Betrag ist für einen einzelnen Vertiefung einer 6-Well-Platte). </li><li> Inkubieren der Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 3776; C mit 5% CO 2. </li></ol></li><li> Nach 24 Stunden, weiter mit der zweiten Runde der Transfektion durch Wiederholung der Schritte 3.1.1-3.1.5 mit folgender Änderung für Schritt 3.1.2: verdünnen 5 ul von 10 uM siRNA (50 pmol) in 130 &amp; mgr; l reduziert Serummedium. <ol><li> Die Zellen für 1-2 Tage bei 37 ° C vor der Analyse. HINWEIS: Zwei Runden Transfektionen und Verwendung eines Hoch siRNA / Transfektionsreagenz Verhältnis in der zweiten Runde sind unerlässlich, um hohe Effizienz der BRCA2-Silencing zu bekommen. </li></ol></li></ol> 4. Lyse Zellen für Immunoblot-Analyse <ol><li> Ansetzen Lysepuffer mit PBS (pH 7,4), enthaltend 1% des nicht-ionischen, nicht-denaturierenden Detergens Octylphenoxypolyethoxyethanol, 5 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Natriumorthovanadat, 10 mM Natriumfluorid, 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 10 ug / ml Leupeptin, 10 ug / ml Aprotinin. Halten Sie es auf Eis. </li><li> Entfernen des Mediums von den Zellen und wAsche sie einmal mit kaltem PBS (2 ml / Vertiefung) in der Platte. Um jede PBS Verschleppung zu vermeiden, vollständig zu entfernen von der Platte. </li><li> Zugeben von 200 &amp; mgr; l Lysepuffer zu jedem Well. HINWEIS: Die Zellen müssen auch für andere Tests verwendet werden, trypsinize die Zellen wie in Schritt 2.1-2.6 beschrieben und Resuspendieren der Zellen in einem geeigneten Puffer / Medium gemäß der Anwendung eingesetzt werden. </li><li> Drehen Sie vorsichtig die Platte gleichmäßig zu verteilen das Lyse-Puffer und Inkubation für 15 min bei 4 ° C auf einem Rotator. </li><li> Sammeln des Zelllysats in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis mit einem Zellschaber. </li><li> Zentrifuge bei 17.900 xg für 25 min bei 4 ° C und Sammeln des Überstands in ein neues Röhrchen. </li><li> Messung der Proteinkonzentration unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Protein-Assay gemß den Herstelleranweisungen. </li></ol> 5. BRCA2 Immunoblotting-Analyse <ol><li> Bereiten Sie den Laufpuffer durch Verdünnung von 50 ml 20x Tris-Acetat SDS Lauf buffer (50 mM Tricin, 50 mM Tris-Base, 0,1% SDS, pH-Wert 8,24) mit 950 ml destilliertem Wasser. </li><li> Vorbereitung der Probe wie folgt: in 15 ug Gesamt-Zelllysat wurden 5 ul 4x Probenpuffer, Lithiumdodecylsulfat bei pH 8,4, 2 ul 10x Probe Reduktionsmittels (0,5 M DTT) und Lyse-Puffer auf ein Endvolumen von 20 ul. Hinweis: Dieses Protokoll ermöglicht den Nachweis von BRCA2 in normalen Zelllinien auch bei Verwendung einer geringeren Menge an Gesamtproteinen (bis auf 5 ug). </li><li> Denaturieren Proben bei 55 ° C für 10 min. Hinweis: Es ist wichtig, auf 55 ° C zu verwenden. Seit BRCA2-Protein ist thermo 11 führen höhere Denaturierung Temperaturen in Einklang Verlust der intakten voller Länge (390 kDa) BRCA2-Protein. </li><li> Die elektrophoretische Kammer gemäß den Anweisungen des Herstellers eingestellt. </li><li> Laden Sie die Proben und 10 ul mit hohem Molekulargewicht vorgefärbten Proteinstandard auf vorgefertigte Gel (Tris-Acetat 8.3%) und bei 120 V für ab laufenout 2 h 12. Stoppen Sie den Elektrophoreselauf bevor die 55 kDa blaue Markierung lässt die vorgefertigte Gel. </li><li> Bereiten Sie den Transferpuffer mit 50 ml 20x Transferpuffer, 100 ml 100% Methanol und 850 ml Wasser. </li><li> Aktivieren PVDF-Membran (0,45 um Porengrße) durch Einweichen in 100% Methanol für 5 min mit destilliertem Wasser gespült und in Transferpuffer äquilibriert für mindestens 5 min. Weichen Sie die Schwämme der Transfervorrichtung in Transferpuffer bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Wenn die Elektrophoreselauf vorbei ist, montieren Sie die Sandwich in der Transferstapel in der folgenden Reihenfolge (von unten nach oben): Drei Schwämme in Transferpuffer gesättigt, ein 3MM Grade Blatt Papier in Transferpuffer, Gels, aktiviert PVDF-Membran, einer gesättigten 3MM Grade Blatt Papier in Transferpuffer gesättigt, drei Schwämme in Transferpuffer 13,14 gesättigt. Platzieren des Stapels in die Vorrichtung und das Transferproteine ​​bei 350 mA für 4 Stunden bei 4 ° C oder bei 180 mA über Nacht bei 4 ° C. HINWEIS: Being BRCA2 ein sehr großes Protein ist, ist es von entscheidender Bedeutung, um die Übertragungszeit von 1 h bis 4 h erstrecken oder über Nacht (wie durch den Hersteller und die meisten Übertragungsprotokolle vorgeschlagen), um eine vollständige Übertragung der hochmolekularen Proteine ​​zu gewährleisten. Darüber hinaus aufgrund der langen Transferzeit ist es wichtig, die Blotting in einem Kühlraum bei 4 ° C durchzuführen, um eine Überhitzung zu minimieren und zu erleichtern Sandwich-Demontage. Halbtrockentransfersysteme sind nicht gut für die Übertragung von großen Proteinen. </li><li> Nach dem Transfer, waschen der Membran mit TBS, blockieren für 1 h bei RT in TBS-Tween 0,25% (TBS-T), das 5% fettfreie Trockenmilch und der Sonde über Nacht bei 4 ° C mit 30 &amp; mgr; l anti-BRCA2 polyklonaler Kaninchen-Antikörper ( 200 ug / ml) in 9 ml TBS-T + 5% fettfreier Trockenmilch verdünnt [1: 300 (v / v) Verdünnung]. </li><li> Dreimal (jeweils 10 Minuten) mit TBS-T Waschen der Membran dann Inkubieren der Filter für 1 h mit 1 &amp; mgr; l Meerrettichperoxidase-konjugiertem anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper in 10 ml TBS-T + 5% fettfreier Trockenmilch. Danach waschen Sie die Membran drei Mal (jeweils 10 Minuten) mit TBS-T. </li><li> Führen Immundetektion von ECL zu BRCA2-Proteins aufdecken Verwendung verstärkter Chemilumineszenz (ECL) Western Blotting Nachweisreagenz nach den Anweisungen des Herstellers. Visualisieren immunochemiluminescent Bands auf hochauflösende ECL-Filme. </li><li> Zuführen Immunodetektion mit einem Antikörper für ein Housekeeping-Gen, wie β-Tubulin (55 kDa), auf dem gleichen Filter als Ladekontrolle durch die Verwendung eines monoklonalen Antikörper gegen β-Tubulin einer Verdünnung von 1: 1000 (10 ul von Anti-Tubulin-Antikörper in 10 ml TBS-T + 5% fettfreie Trockenmilch) für 1 h bei RT. Waschen und Inkubieren sekundären Antikörper für BRCA2 (5,10-5,11) beschrieben, mit Ausnahme der Verwendung von Meerrettichperoxidase-konjugiertem Anti-Maus anstelle von Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper. </li><li> Erwerben Sie ein digitales Bild der mit immunochemiluminescent Bands beeindruckt Filme und die Bandenintensität von engagierten Bildanalyse-Software zu analysieren (zB., ImageJ). </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Da Keimbahnmutationen des BRCA2-Gen zu einem erhöhten Risiko für verschiedene Krebsarten, einschließlich der weiblichen und männlichen Brustkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Melanom und 3,4, eine Reihe von Studien durchgeführt, um die biologische Funktion zu verstehen, des BRCA2-Protein. Die meisten dieser Studien sind genetisch-basierte vor allem auf technische Schwierigkeiten bei der Analyse eines Riesenprotein wie BRCA2. Die zum Dämpfen und Analysieren BRCA2-Protein-E...

Der BRCA2 (Brustkrebsanfälligkeit Gen-2) Gen kodiert für ein Protein, das Tumorsuppressor eine entscheidende Rolle bei der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen durch die Regelung der Funktion des Rekombinaseenzym Rad51 1 spielt. BRCA2 ist auch in der Modulation der Transkription und an der Zellzyklussteuerung 2 in Verbindung gebracht. Keimbahnmutationen im BRCA2-Gen induzieren eine autosomal dominant Anfälligkeit für Brust- und Eierstockkrebs bei Frauen und Prostatakrebs bei Männern, als auch Veranlagung zu anderen Krebsarten 3,4. Trotz des erhöhten Risikos bei der Entwicklung von Krebs, BRCA2-Mutationen, die zu unterdrücken oder zu reduzieren BRCA2-Funktion können Krebszellen anfälliger für Chemotherapeutika, die DNA-Schäden verursachen 5-7 rendern. Sporadische Krebserkrankungen weisen eine niedrige Rate von BRCA2-Mutationen (&lt;3%), obwohl reduzierte Mengen an BRCA2-Protein wurden bei einigen Krebsarten festgestellt, was darauf hindeutet, dass die BRCA2-Proteinkann während der Tumorgenese in sporadische Krebserkrankungen durch nicht-Mutationsabhängige Mechanismen 7,8 verloren. Somit ist es wichtig, BRCA2 Funktionen im Zusammenhang mit der Krebsbiologie sowie in anderen biologischen Systemen vollständig verstehen. Ein leistungsfähiges Werkzeug, um neue Funktionen eines Gens in Säugetierzellen zu identifizieren, ist seine Expression unterdrücken. Als ein Beispiel hat Silencing BRCA2-Expression in einer Vielzahl von normalen Epithelzellen kürzlich zur Identifizierung eines neuartigen Funktion BRCA2 als Regulator der anoikis Beständigkeit ein wichtiger Schritt bei der Erfassung von Krebszell invasive und metastatische Fähigkeit 9 geführt. Gen-Silencing kann durch die Einführung in den Zellen entweder small interfering (si) RNA oder short hairpin (sh) RNA-Moleküle gezielt den spezifischen Gens erreicht werden. Die hohe Wirksamkeit der siRNA und seine Benutzerfreundlichkeit machen es die bevorzugte Werkzeug für Silencing-Experimente bei der Gewinnung neuer Erkenntnisse über kritische biologische Prozesse richtet einnd neue therapeutische Targets zu identifizieren. Jedoch kann effizient Zuschlags der Genexpression nicht für alle Gene leicht erreichbar sein und kann sehr unterschiedlich sein, je nach dem Zelltyp. Weil eine Abnahme der intrazellulären Proteinspiegel der relevanteste Phänotyp untersuchten, ist es wichtig, das Gen-Silencing durch Immunoblotting-Analyse des Genprodukts zu quantifizieren. In dieser Hinsicht stellt der BRCA2-Protein eine weitere Herausforderung: ein großes Protein (etwa 390 kDa), haben technische Schwierigkeiten bei herkömmlichen biochemischen Analyse, einschließlich Immunoblotting existieren. Wir berichten hier über ein Protokoll für die effiziente Silencing von BRCA2 in humanen epithelialen Zelllinien und für die schnelle und erfolgreiche Detektion von BRCA2-Protein durch Immunoblotting-Analyse Knockdown optimiert.

<table><tbody><tr><td>BRCA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003462-00</td><td>SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA</td></tr><tr><td>Ctrl siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>&nbsp; D-001810-10-05</td><td>ON-TARGETplus Non-Targeting</td></tr><tr><td>Pool Lipofectamine RNAiMAX Reagenz&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/13778075">13778075</a></td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I Reduziertes Serummedium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Medium für Transfektionsverfahren</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetat 3-8% 1,5 mm Gel</td><td>vorgefertigt Life Technologies</td><td>EA0378</td><td>Gel für die Proteinelektrophorese</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Puffer für die Probe&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Reagenz für die Proteinelektrophorese</td></tr><tr><td>NuPAGE Probenreduktionsmittel (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0004</td><td>Reagenz für die Proteinelektrophorese</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidans</td><td>Life Technologies</td><td>NP0005</td><td>Reagenz für die Proteinelektrophorese</td></tr><tr><td>HiMark Vorgefärbter Proteinstandard</td><td>Life Technologies</td><td>LC5699</td><td>Vorgefärbter Marker für Gel Elektrophorese</td></tr><tr><td>XCell SureLoc Mini-Zelle&nbsp; System</td><td>Life Technologies</td><td>EI0002</td><td>Ausrüstung für die Proteinelektrophorese/-übertragung</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetat SDS Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LA0041</td><td>Reagenz für Western Blotting</td></tr><tr><td>PVDF-Membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Reagenz für Western Blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0006-1</td><td>Reagenz für Western Blotting</td></tr><tr><td>BRCA2 H-300 polyklonaler Kaninchen-Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8326</td><td>1:300 Verdünnung</td></tr><tr><td>Beta-Tubulin monoklonaler Antikörper</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4026-100UL</td><td>1:1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Magermilchpulver</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70166</td><td>Reagenz für Western Blotting</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>Reagenz für Western Blotting</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico/Femto Chemilumineszenz-Substrat</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>34080/34096</td><td>Chemilumineszenz-System</td></tr><tr><td>PNT1A-Zellen</td><td>SIGMA Aldrich (für ECACC)</td><td>95012614</td><td>PNT1A menschliches, normales Prostata-Epithel immortalisiert mit SV40-Nthy-Zellen</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA Aldrich (für ECACC)</td><td>90011609</td><td>Nthy-ori 3-1 Zelllinie human, Follikel-Epithelzellen der Schilddrüse</td></tr><tr><td>Zellproliferation Kit I (MTT)</td><td>Roche</td><td>11465007001</td><td>Kit für Zellproliferations-Assays</td></tr></tbody></table>

silencing<em&gt; brca2</em&gt; zum novel brca2-regulierten biologische funktionen in kultivierten menschlichen zellen zu identifizieren

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Inaktivierung des Tumorsuppressor-Proteins BRCA2 und seine Erkennung durch herkömmliche biochemische Analysen stellen eine große technische Herausforderung auf Grund der Größe des menschlichen BRCA2-Protein (etwa 390 kDa). Wir berichten Modifikationen von Standard siRNA-Transfektion und Immunoblotting Protokolle menschlichen BRCA2 endogenen BRCA2-Protein, bzw. in humanen epithelialen Zellinien auszuschalten und zu detektieren. Die wichtigsten Schritte sind, um eine hohe siRNA Transfektionsreagenz Verhältnis und zwei weiteren Runden von siRNA-Transfektion in demselben Experiment. Mit diesen und anderen Modifikationen an dem Standardprotokoll wir mehr als 70% Inaktivierung des menschlichen BRCA2 konsistent zu erreichen, wie durch Immunoblotting mit anti-BRCA2-Antikörpern beurteilt. Zusätzlich Denaturierung der Zelllysate auf 55 ° C anstatt der üblichen 70-100 ° C und anderen technischen Optimierungen des Immunoblotting Verfahren den Nachweis von intakten BRCA2-Protein selbst when sehr geringe Mengen an Ausgangsmaterial zur Verfügung stehen oder wenn BRCA2 Proteinexpressionsniveaus sehr niedrig sind. Effiziente Silencing von BRCA2 in menschlichen Zellen bietet eine wertvolle Strategie zur BRCA2-Funktion in Zellen mit intakten BRCA2, einschließlich Tumorzellen unterbrechen, um neue molekulare Signalwege und zellulären Funktionen, die durch pathogene BRCA2-Mutationen in Tumoren betroffen sein können, zu prüfen. Anpassung dieses Protokoll für die effiziente Schalldämpfung und Analyse von anderen &quot;großen&quot; Proteine ​​wie BRCA2 sollte leicht erreichbar sein.

Bevor mit einer biologischen / biochemischen Test fortfahren, um die Wirkung der BRCA2-Unterdrückung auf Zellfunktionen zu untersuchen, ist der erste Schritt, um die Spezifität des Silencing unter Verwendung eines verschlüsselten siRNA (Non-Targeting-siRNA) Seite an Seite mit BRCA2 siRNA (1A bestätigen ). Es ist wichtig, eine zweite Runde von siRNA-Transfektion mit einem hohen siRNA / Transfektion Verhältnis durchzuführen, um einen hohen Wirkungsgrad der BRCA2-Silencing zu erhalten. In...

Gen-Silencing durch siRNA stellt eine geeignete experimentelle Strategie dar, um BRCA2-abhängige biologische Funktionen mit unmittelbaren Auswirkungen auf ein besseres Verständnis der Krebsbiologie zu analysieren. Eine Methode zur effizienten Stilllegung von BRCA2 sowie das experimentelle Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von Veränderungen der BRCA2-Proteinexpression durch Immunblotting in menschlichen Zelllinien werden vorgestellt.

Silencing<em&gt; BRCA2</em&gt; Zum Novel BRCA2-regulierten Biologische Funktionen in kultivierten menschlichen Zellen zu identifizieren

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Expression von B RCA zwei durch Transfektion mit SIR A zu unterdrücken. Dies wird erreicht, indem zunächst die SIR a-Transfektionsreagenz-Komplexe hergestellt werden. Anschließend wird eine erste Transfektionsrunde durchgeführt, bei der die Komplexe tropfenweise auf eine Zellmonolayer mit 80 % Konfluenz gegeben werden. Danach erfolgt eine zweite Runde der SIR a-Transfektion mit einem höheren Verhältnis von SIR A zu Transfektionsreagenz.Schließlich werden die Zellmonolagen mit eiskaltem PBS gewaschen und die Zellen bei vier Grad Celsius mit einem auf Tensiden basierenden Lysepuffer lysiert. Abschließend wird mittels Western-Blot-Analyse die Stummschaltung von B RCA A zwei auf Proteinebene nachgewiesen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie eine effiziente Genstummschaltung sowie eine optimale Detektion von Proteinen mit hohem Molekulargewicht, wie dem Tumorsuppressor B RCA zwei, ermöglicht. Um zu beginnen, nachdem humane epitheliale Zellmonolagen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einer befeuchteten Kammer kultiviert wurden, entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen die Zellen mit PBS bei Raumtemperatur.Um die Zellen von der Platte zu lösen, zwei Milliliter einer 0,25 %igen Trypsin-0,53 Millimolar-EDTA-Lösung hinzufügen und je nach Zelltyp drei bis fünf Minuten lang inkubieren. Die Trypsinwirkung durch Zugabe von zwei Milliliter komplettem Wachstumsmedium mit 10 % FBS neutralisieren, bevor die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt werden. Die Röhrchen in einen Schwenkkorbrotor geben und bei 320 bis 330 × g und vier Grad Celsius drei Minuten lang zentrifugieren.Verwenden Sie fünf Milliliter antibiotikafreies Medium, um die Pellets aufzuschwemmen, bevor Sie mit einer Burker-Kammer oder einem automatisierten Zählverfahren die Zellen zählen. Säen Sie anschließend etwa 0,5 bis 1 × 10⁶ Zellen in zwei Milliliter antibiotikafreiem Medium pro Vertiefung in eine 6-Loch-Platte aus und inkubieren Sie 24 Stunden lang bis zu 80 % Konfluenz. Führen Sie danach eine erste Transfektionsrunde durch, indem Sie sechs Mikroliter lipidbasiertes, auf irna spezifisches Transfektionsreagenz in 130 Mikrolitern Medium mit reduziertem Serum verdünnen.Verdünnen Sie drei Mikroliter eines 10-Mikromolar-S-irna in 130 Mikrolitern Medium mit reduziertem Serum. Kombinieren Sie die verdünnte irna mit einem verdünnten Transfektionsreagenz und inkubieren Sie fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur. Während der Inkubation entfernen Sie das Medium von den Zellen und geben zwei Milliliter frisches Medium ohne Antibiotika hinzu.Vorwärmen bei 37 Grad Celsius. Anschließend 250 Mikroliter der siRNA-Transfektionsreagenz-Komplexe zu jeder Vertiefung mit Zellen in einer 6-Loch-Platte geben. Danach die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren.Nach 24 Stunden verdünnen Sie fünf Mikroliter einer 10-Mikromolar-lRNA-Lösung in 130 Mikrolitern Medium mit reduziertem Serum und führen, wie gerade gezeigt, eine zweite Transfektionsrunde durch. Die hohe Konzentration an sarna in der zweiten Runde ist entscheidend, um eine hohe Effizienz der B rca. A-zwei-Silenzierung zu erzielen.Inkubieren Sie die Zellen vor der Analyse einen bis zwei Tage bei 37 Grad Celsius, um das Zelllysat für die Immunoblot-Analyse vorzubereiten. Bereiten Sie frischen Lysepuffer gemäß dem hier gezeigten Rezept her. Entfernen Sie das Medium von den Zellen und geben Sie zwei Milliliter pro Vertiefung eiskalte PBS zu, um die Zellen zu waschen.Entfernen Sie anschließend vollständig das PBS von der Platte und geben Sie 200 Mikroliter eiskalte Lysepuffer zu jedem Probengefäß hinzu. Drehen Sie die Platte vorsichtig, um den Lysepuffer gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem Rotator. Verwenden Sie dann einen Zellabstreifer.Sammeln Sie das Zelllysat in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, zentrifugieren Sie bei 17.900 Gs und vier Grad Celsius für 25 Minuten und sammeln Sie das Überstand zur Durchführung der Immunblot-Analyse. Bereiten Sie den Laufpuffer durch Verdünnung von 50 Millilitern 20× Tris-Acetat-SDS-Laufpuffer mit 950 Millilitern destilliertem Wasser vor. Bereiten Sie die Probe wie folgt vor.Fügen Sie 15 Mikrogramm Gesamtzelllysat hinzu. Fünf Mikroliter vierfachen Probenpuffer, der Lithium-ESAL-Sulfat pH 8,42, 2 Mikroliter 0,5-molarer DTT und Lysepuffer enthalten, auf ein Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern. Denaturieren Sie die Proben bei 55 Grad Celsius für 10 Minuten.Es ist entscheidend, diese Temperatur zu verwenden, da das Protein b RCA zwei thermosensitiv ist. Richten Sie als Nächstes die elektrophoretische Kammer gemäß den Herstelleranweisungen ein. Laden Sie dann die Proben zusammen mit 10 Mikrolitern eines Proteinstandards mit hohem Molekulargewicht auf ein vorgefertigtes Gel auf und führen Sie den Lauf bei 120 Volt für etwa zwei Stunden durch.Bereiten Sie derweil den Transferpuffer mit 50 Millilitern 20×-Transferpuffer, 100 Millilitern 100% Methanol und 850 Millilitern Wasser vor. Aktivieren Sie die PVDF-Membran, indem Sie sie fünf Minuten lang in 100% Methanol einweichen. Spülen Sie sie anschließend mit destilliertem Wasser und equilibrieren Sie sie mindestens fünf Minuten lang im Transferpuffer.Die Schwämme der Transfervorrichtung bis zur Verwendung in Transferpuffer bei vier Grad Celsius einweichen. Den Lauf anhalten, bevor der 55-Kilodalton-blaue Marker das vorgefertigte Gel verlässt, und das Sandwich beginnend mit drei in Transferpuffer getränkten Schwämmen zusammenbauen. Danach ein drei mm dickes Papier, das in Transferpuffer gesättigt ist.Fügen Sie anschließend das Gel hinzu, danach die aktivierte PVDF-Membran, gefolgt von einem mit Puffer getränkten 3M-Filterpapier und schließlich drei getränkten Schwämmen. Stellen Sie den Stapel in die Apparatur und übertragen Sie die Proteine bei 350 Milliampere für vier Stunden bei vier Grad Celsius oder bei 180 Milliampere und vier Grad Celsius über Nacht. Nach der Übertragung waschen Sie die Membran mit TBS und blockieren Sie sie eine Stunde lang mit TBST und 5 % fettfreier Trockenmilch.Danach den Puffer durch neun Milliliter TBST-Milchpuffer ersetzen, der 30 Mikroliter Anti-BCA-2-Kaninchen-Polyklonaler Antikörper enthält, und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach dreimaligem Waschen der Membran mit TBST je zehn Minuten den Filter eine Stunde lang mit einem Mikroliter mit Meeresrauten-Peroxidase konjugiertem sekundärem Anti-Kaninchen-Antikörper, der in 10 Milliliter TBST-Milchpuffer verdünnt wurde, inkubieren. Nach dreimaligem Waschen der Membran die chemilumineszente Immunodetektion nach KEMMA gemäß den Herstelleranweisungen durchführen.Die Banden auf hochauflösenden ECL-Filmen sichtbar machen, um die Spezifität der BRCA1-Silenzierung zu bestätigen. Eine scrambled RNA wurde parallel zu der BRCA1-RNA verwendet, wie hier gezeigt. Wie bereits erwähnt, ist es wichtig, eine zweite Runde der RNA-Transfektion mit einem hohen RNA-zu-Transfektions-Verhältnis durchzuführen, um eine hohe Effizienz der BRCA1-Silenzierung zu erzielen.Die hier gezeigten Ergebnisse verdeutlichen den Unterschied in der Knockdown-Effizienz zwischen einer niedrigen und einer hohen siRNA-zu-Transfektions-Ratio, abhängig vom Zelltyp. Der optimale Mindestzeitpunkt für die stärkste Genstummschaltung nach der zweiten siRNA-Transfektion kann variieren; wie in dieser Abbildung dargestellt, sind beispielsweise 24 Stunden für NTHY-Schilddrüsenzellen ausreichend, während bis zu 48 Stunden für einen effizienten B RCA A zwei-Knockdown in PNT1A-Prostatazellen erforderlich sind. Die B RCA A zwei-Silenzierung bleibt bis zum siebten Tag nach der zweiten Transfektionsrunde recht stabil. Wie bereits erwähnt, führt das Denaturieren der Zelllysate bei einer Temperatur über 55 Grad Celsius zu einem Verlust von bis zu 50 % des B RCA A zwei-Proteins.In diesem Experiment wurde die Empfindlichkeit von B RCA A zwei stillgelegten PNT ein A-Zellen gegenüber dem PARP-Inhibitor Rucaparib nach einer 24-stündigen Behandlung mit dem Wirkstoff untersucht. Ein zeitabhängiger Rückgang der Zellproliferation wurde in B RCA zwei-verarmten PNT ein A-Zellen im Vergleich zu Kontrollen beobachtet. Nach Anschauen dieses Videos sollte man ein gutes Verständnis dafür haben, wie man lange proteincodierende Gene mittels einer CRNA stilllegen und deren Proteinprodukt neben BRC zwei mithilfe eines optimierten Immuno-Blockierungsverfahrens effizient nachweisen kann.Dieses Vorgehen kann auf viele andere anspruchsvolle große Proteine angewendet werden, insbesondere wenn sie in den Zellen in sehr geringen Mengen exprimiert werden.

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Forschung

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Biology

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Ermittlung der Auswirkungen von BRCA1-Mutationen auf homologe Rekombination unter Verwendung von Zellen, die endogenes Wildtyp-BRCA1 Express

Molekulare Signal sowohl durch Östrogen und microRNAs sind entscheidend bei Brustkrebs Entwicklung und Wachstum. Östrogen aktiviert die Östrogen-Rezeptoren, die Transkriptionsfaktoren sind. Viele Transkriptionsfaktoren die Expression von microRNAs regulieren und Östrogen-regulierten microRNAs kann mit verschiedenen Groß Techniken profiliert werden.

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Hier wird die Echtzeitüberwachung des Tumorzellstoffwechsels, kombiniert mit einem in vivo Modell der Chorio-Allantoismembran (CAM) der Metastasierung von Hühnerembryonen, verwendet, um neuartige Anti-Krebs-Ziele/Wirkstoffe auf ihre Fähigkeit hin zu bewerten, Tumorzellen für DNA-schädigende Chemotherapeutika zu sensibilisieren.

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Menschen mit BRCA1-Mutationen haben ein höheres Risiko, an Krebs zu erkranken, was eine genaue Bewertung der Funktion von BRCA1-Varianten rechtfertigt. Hierin haben wir ein Protokoll zur funktionellen Bewertung von BRCA1-Varianten mit CRISPR-vermittelten Cytosin-Basiseditoren beschrieben, die eine gezielte Konvertierung von C:G in T:A in lebenden Zellen ermöglichen.

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Erfahren Sie die siRNA-vermittelte Gen-Silencing-Methode für BRCA2 in kultivierten menschlichen Zellen. Diese Technik ermöglicht effizientes Knockdown und optimale Detektion hochmolekularer Tumorsuppressorproteine mittels Western Blot.

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