Silencing BRCA2 Zum Novel BRCA2-regulierten Biologische Funktionen in kultivierten menschlichen Zellen zu identifizieren

Gen-Silencing durch siRNA stellt eine geeignete experimentelle Strategie dar, um BRCA2-abhängige biologische Funktionen mit unmittelbaren Auswirkungen auf ein besseres Verständnis der Krebsbiologie zu analysieren. Eine Methode zur effizienten Stilllegung von BRCA2 sowie das experimentelle Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von Veränderungen der BRCA2-Proteinexpression durch Immunblotting in menschlichen Zelllinien werden vorgestellt.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Expression von B RCA zwei durch Transfektion von SIR A zum Schweigen zu bringen. Dies wird erreicht, indem zuerst die Reagenzkomplexe der SIR a Transfektion hergestellt werden. Als nächstes wird eine erste Transfektionsrunde durchgeführt, indem Komplexe tropfenweise zu einer Monoschicht von Zellen hinzugefügt werden, die eine Co-Flüssigkeit von 80 % aufweisen. Dann wird eine zweite Runde von SIR, einer Transfektion, mit einem höheren Verhältnis von SIR, A zu Transfektionsreagenzien durchgeführt.

Zum Schluss werden die Zellmonoschichten mit eiskaltem PBS gewaschen und die Zellen bei vier Grad Celsius mit einem Lysepuffer auf Detergenzbasis lysiert. Letztendlich wird die Western-Blotting-Analyse verwendet, um B RCA A zwei Silencing auf Proteinebene zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sie ein effizientes Gen-Silencing sowie einen optimalen Nachweis von Proteinen mit hohem Molekulargewicht wie dem Tumorsuppressor B RCA zwei ermöglicht. Beginnen Sie mit der Züchtung menschlicher Epithelzell-Monoschichten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einer befeuchteten Kammer, entfernen Sie das Wachstumsmedium und verwenden Sie PBS bei Raumtemperatur, um die Zellen zu waschen.

Um die Zellen von der Platte zu lösen, fügen Sie zwei Milliliter 0,25%iges Trypsin 0,53 millimolare EDTA-Lösung hinzu und inkubieren Sie je nach Zelltyp drei bis fünf Minuten lang. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie zwei Milliliter vollständiges Wachstumsmedium mit 10 % FBS hinzufügen, bevor Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Legen Sie die Röhrchen in einen schwingenden Schaufelrotor und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei 320 bis 330 G und vier Grad Celsius.

Verwenden Sie fünf Milliliter antibiotikafreies Medium, um die Pellets zu resuspendieren, bevor Sie eine Burker-Kammer oder ein automatisiertes Zählsystem verwenden, um die Zellen zu zählen. Setzen Sie dann etwa 0,5 bis eins mal 10 bis die sechs Zellen in zwei Millilitern antibiotikafreiem Medium in jede Vertiefung von sechs Well-Platten und inkubieren Sie 24 Stunden lang bis zu 80 % con Fluenz. Fahren Sie nach der Inkubation mit einer ersten Transfektionsrunde fort, indem Sie sechs Mikroliter des lipidbasierten irna-spezifischen Transfektionsreagenzes in 130 Mikroliter reduziertem Serummedium verdünnen.

Verdünnen Sie drei Mikroliter 10 mikromolare S irna in 130 Mikrolitern reduziertem Serummedium. Kombinieren Sie die verdünnte Irna mit einem verdünnten Transfektionsreagenz und inkubieren Sie sie fünf bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie während der Inkubation das Medium aus den Zellen und fügen Sie zwei Milliliter frisches Medium ohne Antibiotika hinzu.

Bei 37 Grad Celsius vorwärmen. Anschließend werden 250 Mikroliter des siRNA-Transfektionsreagenzkomplexes in jede Vertiefung der Zellen in einer Sechs-Well-Platte gegeben. Anschließend werden die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubiert.

Nach 24 Stunden verdünnen Sie fünf Mikroliter 10 mikromolare Irna in 130 Mikrolitern reduziertem Serummedium und fahren Sie mit einer zweiten Transfektionsrunde fort, die gerade demonstriert wurde. Die hohe Konzentration von Sarna in der zweiten Runde ist unerlässlich, um eine hohe Effizienz von B rca zu erzielen. Ein zweimaliges Schweigen.

Inkubieren Sie die Zellen vor der Analyse ein bis zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius, um das Zelllysat für die Immunblotting-Analyse vorzubereiten. Bereiten Sie frischen Lysepuffer nach dem hier gezeigten Rezept vor. Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und fügen Sie zwei Milliliter eiskaltes PBS pro Vertiefung hinzu, um die Zellen zu waschen.

Nehmen Sie dann einmal das PBS vollständig von der Platte und fügen Sie jeweils 200 Mikroliter eiskalten Lysepuffer hinzu. Drehen Sie die Platte vorsichtig, um den Lysepuffer gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie auf einem Rotator bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Dann mit einem Zellschaber.

Sammeln Sie das Zelllysat in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf einer Eiszentrifuge bei 17.900 g und vier Grad Celsius für 25 Minuten und sammeln Sie das Supernat, um eine Immunblotting-Analyse durchzuführen. Bereiten Sie den Laufpuffer vor, indem Sie 50 Milliliter 20 x Trisacetat-SDS-Laufpuffer mit 950 Millilitern destilliertem Wasser verdünnen. Bereiten Sie die Probe wie folgt vor.

Fügen Sie 15 Mikrogramm Gesamtzelllysat hinzu. Fünf Mikroliter à vier x Probenpuffer mit Lithium, ESAL-Sulfat, pH 8,42 Mikroliter 0,5 molares DTT und Lysepuffer bis zu einem Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern. Denaturieren Sie die Proben bei 55 Grad Celsius für 10 Minuten.

Es ist wichtig, diese Temperatur zu verwenden, da b RCA zwei Protein thermoempfindlich ist. Richten Sie anschließend die elektrophoretische Kammer gemäß den Anweisungen des Herstellers ein. Laden Sie dann die Proben in 10 Mikroliter eines Restain-Proteinstandards mit hohem Molekulargewicht auf ein vorgefertigtes Gel und lassen Sie sie etwa zwei Stunden lang mit 120 Volt laufen.

In der Zwischenzeit den Transferpuffer mit 50 Millilitern 20 x Transferpuffer, 100 Millilitern 100%Methanol und 850 Millilitern Wasser vorbereiten. Aktivieren Sie die PVDF-Membran, indem Sie sie fünf Minuten lang in 100 % Methanol einweichen. Mit destilliertem Wasser spülen und mindestens fünf Minuten lang in Transferpuffer äquilibrieren.

Weichen Sie die Schwämme des Transfergeräts bis zum Gebrauch in Transferpuffer bei vier Grad Celsius ein. Stoppen Sie den Lauf, bevor der 55 Kilodalton große blaue Marker das Fertigteilgel verlässt, und montieren Sie das Sandwich, beginnend mit drei Schwämmen, die in Transferpuffer getränkt sind. Dann ein drei mm dickes Papier, das mit Transferpuffer getränkt ist.

Fügen Sie dann das Gel, dann die aktivierte PVDF-Membran hinzu, gefolgt von einem Puffer getränktem Papier der Güteklasse 3M und schließlich drei eingeweichten Schwämmen. Setzen Sie den Stack in die Apparatur ein und übertragen Sie die Proteine bei 350 Milliampere für vier Stunden und vier Grad Celsius oder bei 180 Milliampere und vier Grad Celsius über Nacht. Nach dem Transfer die Membran mit TBS waschen und eine Stunde lang mit TBST und 5 % fettfreier Trockenmilch blockieren.

Ersetzen Sie dann den Puffer durch neun Milliliter TBST-Milchpuffer, der 30 Mikroliter anti-BCA-zwei polyklonale Kaninchen-Antikörper enthält, und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Membran dreimal für jeweils 10 Minuten mit TBST gewaschen haben, inkubieren Sie den Filter eine Stunde lang mit einem Mikroliter Meerrettichperoxidase-konjugiertem Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, verdünnt in 10 Millilitern TBST-Milchpuffer. Nachdem Sie die Membran dreimal gewaschen haben, führen Sie die KEMMA-Lumineszenz-Immundetektion gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.

Visualisieren Sie die Banden auf hochauflösenden ECL-Filmen, um die Spezifität von B rca zu bestätigen. Ein zweimaliges Schweigen. Eine verschlüsselte Irna wurde Seite an Seite mit B RCA zwei Irna verwendet, wie hier gezeigt Wie bereits erwähnt, ist es wichtig, eine zweite Runde der Irna-Transfektion mit einem hohen Verhältnis von Irna zu Transfektion durchzuführen, um eine hohe Effizienz der B-RCA-A-Zwei-Stummschaltung zu erreichen.

Die Ergebnisse zeigen den Unterschied in der Knockdown-Effizienz zwischen der Verwendung eines niedrigen und eines hohen siRNA-Transfektions-Verhältnisses, abhängig vom Zelltyp. Die optimale Mindestzeit, um das höchste Maß an Gen-Silencing zu erreichen, kann nach der zweiten Runde der siRNA-Transfektion variieren, z. B. sind 24 Stunden für NTHY-Schilddrüsenzellen ausreichend, aber bis zu 48 Stunden werden für einen effizienten B RCA A zwei Knockdown in PNT eins A Prostatazellen b RCA zwei Silencing ist bis zum siebten Tag nach der zweiten Transfektionsrunde recht stabil. Wie bereits erwähnt, führt die Denaturierung der Zelllysate bei einer Temperatur über 55 Grad Celsius zu einem Verlust von bis zu 50% des Proteins B RCA A zwei.

In diesem Experiment wurde die Empfindlichkeit von B RCA A zwei stummgeschalteten PNT One A Zellen gegenüber dem PARP-Inhibitor Rucaparib nach einer 24-stündigen Behandlung mit dem Medikament untersucht. Eine zeitabhängige Abnahme der Zellproliferation wurde bei B, RCA, zwei depletierten PNT-Zellen und einer A-Zellen im Vergleich zu Kontrollen beobachtet. Nach dem Anschauen dieses Videos sollte es ein gutes Verständnis dafür haben, wie man lange Protein-kodierende Gene durch eine CRNA zum Schweigen bringt und wie man ihr Proteinprodukt durch ein optimiertes Immunblockin-Verfahren neben BRC zwei effizient nachweisen kann.

Diese Materie kann auf viele andere schwierige große Proteine angewendet werden, insbesondere wenn sie in den Zellen in sehr geringen Mengen exprimiert werden.