Name: Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening Coxiella burnetii Transposon-Mutanten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Generierung und das Screening von Coxiella burnetii-Transposon-Mutanten zur Analyse von Internalisierung, Replikation und Zytotoxizität. Diese Methode ermöglicht die großangelegte Identifizierung essenzieller Infektionsgene.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Avenir/ATIP-Stipendium an Matteo Bonazzi und ein Marie-Curie-CIG (N° 293731) an Eric Martinez. Die Autoren danken Dr. Robert Heinzen für die Bereitstellung von C. burnetii-Stämmen, Antikörpern und Werkzeugen, Virginie Georget und Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) für ihre technische Unterstützung und Datenanalyse.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die Studie von Wirt / Pathogen-Interaktionen hat sich als bemerkenswert Verfahren, um bakterielle Infektionen zu verstehen und zu entwickeln alternative Strategien zur Infektionskrankheiten entgegenzuwirken. Aufgrund der Vielfalt der Strategien durch verschiedene bakterielle Erreger ausgearbeitet, die Identifizierung und Charakterisierung von bakteriellen Virulenzfaktoren und des Host-Signalwege, die bei Infektionen abzielen stellen jedoch eine echte Herausforderung. Dies erfordert die Entwicklung neuer Konzepte für die Groß Identifizierung von Schlüssel Wirt / Pathogen-Interaktion Hubs. Die jüngste Entwicklung von innovativen, Hochdurchsatz-und High-Content-Screening-Verfahren stellt eine wertvolle Ressource, die sich dem Studium der intrazelluläre bakterielle Erreger 15 angepasst werden kann. Hier haben wir die zoonotische bakteriellen Erreger Coxiella burnetii als Modell verwendet werden, um Screening-Ansätze, die Transposon-Mutagenese und fluoreszenzbasierte Tests zu kombinieren zu entwickeln. Importantly ermöglicht diese Screening-Verfahren die gleichzeitige Überwachung mehrerer Schritte des Coxiella intrazellulären Zyklus und bietet eine globale Übersicht über die durch dieses Bakterium entwickelt zu erobern, zu replizieren und bleiben in infizierten Zellen Strategien. Der hier beschriebene Ansatz basiert auf zwei etablierte Techniken, Transposon-Mutagenese und fluoreszenzbasierte Tests, die erfolgreich auf das Studium der bakteriellen Erreger angewendet wurden basierend. Die Kombination dieser Techniken, die in Zusammenhang mit der Hochdurchsatz / High-Content-Bildschirme ermöglicht es, die Auswirkungen einer Anzahl von Bakterien Mutationen durch die Analyse einer sehr hohen Anzahl von Ereignissen (typischerweise 15.000 infizierten Zellen pro Bakterien Mutationen werden abgebildet und analysiert) auszuwerten. Dies stellt eine wichtige statistische Analyse der Ereignisse, wie bakterielle Invasion von Wirtszellen und die intrazelluläre Replikation, die sind von Natur aus mit hoher Variabilität. Es ist wichtig zu beachten, dass Zelllinien mit Ausnahme epithelial können für diese Art von Screening verwendet werden. Allerdings sind flach und große Epithelzellen optimal für die Bildanalyse als Wirtszellorganellen sind leichter zu erkennen. Da die Mehrzahl der automatisierten Mikroskopen automatisch verarbeiten eine Vielzahl von Platten, gibt es praktisch keine Grenzen für die Anzahl von Mutanten, die gleichzeitig untersucht werden können. Abhängig von dem Pathogen, kann der Benutzer Berechtigung der Verwendung eines Epifluoreszenz oder einem konfokalen Mikroskop. Die Zeit der Bildaufnahme wird überwiegend abhängig von der Empfindlichkeit der Mikroskopkamera, auf die Anzahl der Felder pro Vertiefung und der Anzahl der Kanäle pro Sichtfeld erfasst erworben. Der Benutzer kann entscheiden, wie diese Faktoren anpassen, um die Screening-Protokoll zu optimieren. Als ein Beispiel abgebildet wir eine Platte mit 96 Vertiefungen / h unter Verwendung der in Punkt 5.1 genannten Bedingungen. Bildanalyse hängt weitgehend von der verwendeten Maschine (oder Gruppe von Maschinen). Wir verwenden eine 12-Core (2 x 3.06 GHz 6-Core), 48 GB RAM Workstation. Diese Maschine erfordert Angleirungsweise 40 Minuten, um Bilder von einer Platte erworben zu analysieren. Ein wichtiger Aspekt in Betracht gezogen werden, bei der Entwicklung dieser Assays ist die Menge von neuen (oder die Optimierung von bestehenden) Protokollen, um die Manipulation und Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben ermöglicht. Ein typisches Beispiel ist die Entwicklung der einzelnen Primer Kolonie-PCR-Ansatz, der uns schnell verstärken und erlaubt Sequenz Coxiella DNA-Fragmente, die die Stelle der Insertion jedes Transposon, aus sehr kleinen Proben. Basierend auf unserer Erfahrung, hat die High-Fidelity-Polymerase an sorgfältig ausgewählte und um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten getestet werden. Die einzige Begrenzung dieses Ansatzes kann in der Beobachtung, daß in den meisten Fällen etwa 30% der verarbeiteten Proben sind nicht ausnutzbar verbergen, entweder aufgrund der PCR oder Sequenzierungsschritten. Berücksichtigt man jedoch, daß die Isolierung neuer Coxiella Transposon-Mutanten keine geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist, bedeutet dies nicht REPREschickte ein wichtiges Thema. In ähnlicher Weise die Entwicklung eines zuverlässigen Test zur Bestimmung des Bakterienkonzentration von mutierten Bestände quantifizieren war der Schlüssel für diesen Ansatz. Aufgrund der Tendenz von Coxiella zu aggregieren, wenn sie in Suspension, ist die Verwendung von Ablesungen der optischen Dichte nicht anwendbar, um die Konzentration von Coxiella Kulturen und der einzigen Alternative war quantitative PCR (qPCR) zu berechnen. Hierbei ist die Verwendung einer fluoreszenzmarkierten DNA interkalierende Mittel signifikant Bakterioplankton Quantifizierung beschleunigt. Dieser Ansatz kann auch die Vorteile der Verwendung von stabilen Zelllinien, die Fluoreszenzmarker für mehrere intrazelluläre Kompartimente in Abhängigkeit von dem Erreger eingesetzt. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Verwendung von Zellkulturmedien frei von Phenolrot. Wir beobachteten, dass dieser pH-Indikator hat eine natürliche Fluoreszenz überspannt den roten und grünen Spektrum, das die auf der automatisierten Fluoreszenzreader aufgezeichnete Signal sättigt. Ter hier vorgestellte Strategie beruht auf Zufalls Transposon-Mutagenese. Bei den Mutanten von Interesse, empfehlen wir die Validierung einzigartigen Trans (und Klonalität) mit Southern-Blot und PCR-Amplifikationen der Transposoninsertion Website. Neben der im Protokoll beschrieben Ausrüstung, Teams Interesse an der Nutzung der Screening-Ansatz hier präsentiert wird, werden große Vorteil in der Aufbau einer relationalen Datenbank für die Datensammlung, einem Server für die Datenspeicherung und einer Arbeitsstation für die schnelle Bildanalyse zu nehmen. Wichtig ist, dass die hier beschriebene Methode ist für die Untersuchung von anderen intrazellulären bakteriellen Pathogenen geeignet vorgesehen eine zufällige Mutagenese-Verfahren für den Erreger vorhanden ist, können Zelllinien durch das Pathogen infiziert sein und diese zeigt einen spezifischen Phänotyp während der Infektion.

Die Schwellen, endemische Bakterium Coxiella burnetii ist für große Ausbrüche von Q-Fieber, eine schwächende Grippe-ähnliche Zoonose mit schweren gesundheitlichen und wirtschaftlichen Auswirkungen 1 verantwortlich. Die wichtigsten Lagerstätten von Coxiella sind Haus- und Nutztieren, und es wird geschätzt, dass mehr als 90% der Milchviehhaltung in den USA durchzuführen C. burnetii 2. Der Mensch ist ein versehentliches Hosts, die durch Inhalation kontaminierter Aerosole infiziert sind. Menschen Q-Fieber manifestiert entweder als akute oder chronische Krankheit, die tödlichen Komplikationen mit einer Mortalitätsrate erreichte 65% 1,3 haben. Mit einer infektiösen Dosis von 1 - 10 Organismen ist Coxiella das infektiöse Pathogen bekannt und es hat sich als potentielle biologische Waffe 4 untersucht worden. Die jüngste explosive Ausbruch von Q-Fieber in den Niederlanden (2007 - 2010), mit Fällen Eskalation von 182 auf mehr als 2.000 pro Jahr, steht als Beispiel für die schwere Virulenz des Erregers5. Die bemerkenswerte Effizienz Coxiella Infektionen wird wahrscheinlich mit seiner Resistenz gegen Umweltstress, kombiniert mit seiner einzigartigen Anpassung an Wirtszellen verbunden. Tatsächlich ist Coxiella in der Umgebung, in der Form von metabolisch inaktiven kleinzelligem Varianten (SCV), das bemerkenswert beständig gegenüber mehreren harten Bedingungen (Austrocknung, Temperatur, etc.) vorhanden sind. SCVs werden von Fresszellen via α V β 3 Integrin 6 genommen, während Invasion nicht-Fresszellen wird durch die Coxiella Adhäsion / Invasion OmpA 7 und einer noch nicht identifizierten Rezeptor vermittelt. Im Anschluss an die Aufnahme, wohnt Coxiella in eng anliegenden Vakuolen, positiv für den frühen endosomalen Marker Rab5 und EEA1 8. Bakterien reagieren auf endosomalen Ansäuerung durch die Umstellung auf metabolisch aktiven großen Zellvarianten (leichte Nutzfahrzeuge) und Aktivieren eines Dot / Icm Sekretionssystem vom Typ 4 (T4SS) 9, Hoch homolog zu der Legionella pneumophila 10. Die Sekretion von Dot / Icm Effektoren ermöglichen Coxiella, um eine große, LAMP1-positive sauren Raum mit aktiven lysosomalen Enzymen in denen sich Bakterien gedeihen können und aktiv infizierte Zellen vor Apoptose 11 zu erzeugen. Daher wird die intrazelluläre Zyklus Coxiella vom Dot / Icm vermittelte bakterielle Translokation Effektoren 12 gesteuert werden jedoch die mikrobielle Faktoren in Wirtszellinvasion, bakterielle Replikation und Verbreitung der Infektion beteiligt sind heute noch weitgehend unbekannt. Kombinieren Transposon-Mutagenese und Fluoreszenz-basierte Assays, entwickeln wir unvoreingenommene Ansätze zur gleichzeitigen Identifizierung von bakteriellen Faktoren in den Hauptschritten des Coxiella Infektionen beteiligt: ​​1) Internalisierung in Wirtszellen, 2) die intrazelluläre Replikation, 3) Zelle-zu-Zell-Ausbreitung und 4) Ausdauer. Bis heute haben wir mehr als 1.000 m geschirmtutations in 500 Coxiella kodierenden Sequenzen, die uns mit noch nie da gewesenen Einblick in die Wirt-Pathogen-Interaktionen, die Coxiella Pathogenese 7 zu regulieren. Zu beachten ist, kann dieser Ansatz auf die Untersuchung von anderen intrazellulären Krankheitserreger, die Zellbiologie Funktionen mit Coxiella gemeinsam angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma</td><td>C0759-500G</td><td>ACCM-2 Mittelkomponente</td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Sigma</td><td>S4641-500G</td><td>ACCM-2 Mittelkomponente</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat</td><td>Sigma</td><td>60218-100G</td><td>ACCM-2 Mittelkomponente</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td>ACCM-2 Mittelkomponente</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td>ACCM-2 Mittelkomponente</td></tr><tr><td>Eisensulfat</td><td>Sigma</td><td>F8633-250G</td><td>ACCM-2 Mittelkomponente</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td></td><td>Sigma S9625-500G</td><td>ACCM-2 Mittelkomponente</td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma</td><td>C6852-25G</td><td>ACCM-2 Mittelkomponente</td></tr><tr><td>Bacto Neopepton</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>211681</td><td>ACCM-2 Mittelkomponente</td></tr><tr><td>Casaminosäuren</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>223050</td><td>ACCM-2 mittlere Komponente</td></tr><tr><td>Methyl-B-cyclodextrin</td><td>Sigma</td><td>C4555-10G</td><td>ACCM-2 mittlere Komponente</td></tr><tr><td>RPMI mit Glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>ACCM-2 mittlere Komponente</td></tr><tr><td>RPMI mit Glutamax, ohne Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td>Für Zellkultur und Infektion</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>GE </td><td>SH30071</td><td>für das Gesundheitswesen Für die Zellkultur</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0,25 %)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Für die Zellkultur</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td>Für die Immunfluoreszenzfärbung</td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td>Für die Immunfluoreszenzfärbung</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Für die Immunfluoreszenzfärbung</td></tr><tr><td>Elektroporationsküvette 0,1 cm</td><td>Eurogentec</td><td>ce0001-50</td><td>Für Coxiella Transformation</td></tr><tr><td>Trackmates Röhrchen mit Schraubverschluss und Verschlüssen</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741</td><td>2D-Schraubverschluss</td></tr><tr><td>96-Well-Mikroplatte mit schwarzem Sockel und schwarzem Boden</td><td>Greiner</td><td>655076</td><td>Flacher dunkler Boden, für dsDNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>96-Well-PCR-Mikroplatte</td><td>Biorad</td><td>2239441</td><td>DNAse/RNAse-freie</td></tr><tr><td>96-Well-Platte, Deepwell</td><td>Labcon</td><td>949481</td><td>Für Coxiella Mutanteninfektionen</td></tr><tr><td>PicoGreen</td><td>Life Technologies</td><td>P7581</td><td>Für dsDNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>Für dsDNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity-DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>Für Single Primer-Kolonie</td></tr><tr><td>PCR Celltracker Red CMTPX</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td>Für die Bildgebung</td></tr><tr><td>Anti-LAMP1-Antikörper</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>Für die Immunfluoreszenzfärbung</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>L1418</td><td>Für die Bildgebung</td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader Infinite 200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluoreszenz-Automatikmikroskop Cellomics</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation und multi-phänotypischen high-content-screening<em&gt; coxiella burnetii</em&gt; transposon-mutanten

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion und Kolonisierung von Wirtszellen, die durch bakterielle Pathogene, hängt von der Aktivität einer Vielzahl von prokaryotischen Proteinen, definiert als Virulenzfaktoren, die unterwandern und zu manipulieren Schlüsselaufnahmefunktionen. Die Studie von Wirt / Pathogen-Interaktionen ist daher äußerst wichtig, um bakterielle Infektionen zu verstehen und zu entwickeln alternative Strategien zur Infektionskrankheiten entgegenzuwirken. Dieser Ansatz erfordert jedoch die Entwicklung neuer Hochdurchsatz-Assays für die unvoreingenommene, automatisierte Identifizierung und Charakterisierung von bakteriellen Virulenzfaktoren. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung eines GFP-markierten Mutantenbibliothek durch Transposon-Mutagenese und der Entwicklung von High-Content-Screening-Ansätze für die gleichzeitige Identifizierung mehrerer Transposon-assoziierten Phänotypen. Unser Arbeitsmodell ist die intrazellulären bakteriellen Erreger Coxiella burnetii, der Erreger des Q-Fiebers Zoonose, die mit se verbunden istvere Ausbrüche mit einer daraus resultierenden gesundheitlichen und wirtschaftlichen Belastung. Die obligat intrazelluläre Natur des Erregers hat bis vor kurzem stark behindert die Identifizierung von bakteriellen Faktoren in Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen beteiligt, so dass von Coxiella das ideale Modell für die Umsetzung von Hochdurchsatz / High-Content-Ansätze.

Nach Isolierung der Transposon-Mutanten, ist Einzelprimer-Kolonie-PCR eine robuste, Hochdurchsatzverfahren, um die Website von Transposoninsertion für jede Mutante zu identifizieren. Dieser Ansatz beruht auf einem typischen nested PCR-Protokoll aber hier ein einzelner Primer hybridisiert spezifisch und / oder unspezifisch an der Matrizen-DNA in Abhängigkeit von der Stringenz der Glühtemperatur (1A). Die typischen PCR-Produkte bestehen aus mehreren DNA-Fragmenten, von denen die meisten spezifisch sind (1B). Die Verwendung eines unterschiedlichen Sequenzierungsprimer, die direkt stromaufwärts des Transposons ITR, und stromabwärts des durch den Amplifikationsprimer erkannte Sequenz annealt bietet Spezifität für die Sequenzierungsschritt (Figur 1C). Automatisierte Software für die Sequenzanalyse richtet die erhaltenen Sequenzen an die Coxiella Genom Bereitstellung der genaue Ort der Transposoninsertionen (Abbildung 1c). Alle Transposoninsertionen kann dann annauf der Coxiella Genom (1D) otated. Jedes Coxiella Mutante isoliert und axenisch in ACCM-2-Medium entweder vor der Lagerung oder Screening amplifiziert. 2 zeigt ein Beispiel eines 38-Transposon-Mutanten in 16 Punkten / ICM Coxiella Gene (2A). Um die Lebensfähigkeit von Coxiella Mutanten zu beurteilen, werden axenischen Wachstumskurven durch Abtasten Bakterienkulturen für 7 Tage nach der Inokulation und Anwenden des in 1.5 (Figurie 2B) beschriebenen Bakterienkonzentration Assay erhalten. Amplifizierten Mutanten werden dann mit Epithelzellen für 7 Tage inkubiert, in dreifacher Platten mit 96 Vertiefungen. Alle Coxiella Mutanten erzeugt, die GFP-markierten, intrazellulären Wachstumskurven werden durch Messung der Fluoreszenzintensität der GFP jeden gut, alle 24 Stunden, und Aufzeichnen der Messwerte als Funktion der Zeit (2C) erhalten. Intrazellulären Wachstumskurven stellen die quantitative Analyse der Phänotypen mit jedem Transposoninsertion im Coxiella Genom assoziiert. Um qualitative Informationen zu den gleichen Transposonmutanten hinzuzufügen, haben wir uns für die automatisierte Bildaufnahme und Analyse. Sieben Tage nach der Infektion, Platten befestigt sind, verarbeitet für Immunfluoreszenz, wie in 4 beschrieben und mit Hilfe eines automatisierten, Epifluoreszenzmikroskop wie in 5. Automatisierte Bildanalyse-Software beschrieben, wie CellProfiler (Broad Institute, analysiert <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) verarbeitet die erfassten Kanäle unabhängig und Segmente Objekten für eine vergleichende Analyse (Figur 3) identifiziert. Dies ermöglicht die Identifikation und morphologische Charakterisierung von Wirtszellkerne, Zellen Konturen, Lysosomen und Coxiella Kolonien (Abbildung 3 oberen Felder). Korrelieren Coxiella Kolonien mit Zellen und ermöglicht die Lysosomen Bestandtauf und spezifische morphologische Analyse von Coxiella enthaltenden Vakuolen (die LAMP1 positive, 3 unteren linken Bereich sind). Korrelieren Coxiella Kolonien mit Wirtszelle Konturen ermöglicht die Identifizierung und spezifische morphologische Analyse von infizierten Zellen (Abbildung 3 unten Mitte). Schließlich werden die 4 Kanäle zur Veranschaulichung und Qualitätskontrolle (Abbildung 3 unten rechts) zusammengeführt. Von der automatisierten Bildanalyse erhaltenen Daten können gegeneinander aufgetragen werden, um &quot;Mehr phänotypische Streudiagramme&quot; zu erhalten. Als ein Beispiel in Figur 4A die mittlere Fläche (in &amp; mgr; m 2) von Coxiella Kolonien gegen die Anzahl der Kolonien pro Zelle (4A) aufgetragen wird, um Veränderungen, die die intrazelluläre Replikation des Coxiella (Replikationsphenotyp) und / oder beeinflussen zu identifizieren die Fähigkeit von Bakterien an Wirtszellen eindringen (internasierung Phänotyp). Die statistische Analyse wurde verwendet, um Regionen in der resultierenden Streudiagramm entsprechend mild (-4 &lt;Z-Score ≤ -2) und schwere (Z-Score ≤ -4) Phänotypen zu definieren. Mutanten wurden in 3 Hauptcluster beobachtet: Mutationen, die zu einer fehlerhaften intrazelluläre Wachstum von Coxiella Folge wurden in der äußersten linken Teil der Handlung (4A, rosa und rote Punkte) gruppiert sind; Mutationen, die Coxiella Internalisierung in Zellen betroffen waren im unteren Teil des Grundstücks gruppiert (4A, helle und dunkle blaue Punkte) und schließlich grünen Punkten in der äußersten rechten Bereich des Grundstücks entsprechen Mutationen in nicht-signifikanten Phänotypen ( Z-Score&gt; -2). Wichtig ist, dass Mutanten, die zur Replikation ausfallen, aber noch in der Lage, um Wirtszellen eindringen, werden nach 7 Tagen der Infektion als einzelne Bakterien oder kleinen Kolonien, angrenzend an Zellkernen (4C, zweite Grafik) Wirt erkannt. Daher ist die Größe der Coxiella &quot;Colomen &quot;wird erheblich beeinflusst werden, aber die Anzahl der infizierten Zellen werden nicht im Vergleich zu WT Coxiella infizierten Zellen variieren. Im Gegenteil, Mutationen, die die Fähigkeit von Coxiella, Wirtszellen eindringen beeinflussen zu einer Abnahme in der Anzahl von Kolonien / Zelle. Wenn diese Zahl deutlich unterhalb von 1 ist, zeigt dies, dass, im Durchschnitt, gibt es eine Abnahme in der Gesamtzahl der infizierten Zellen. Alternativ kann die Durchschnittsfläche (in &amp; mgr; m 2) von Coxiella Kolonien gegen die Anzahl der Wirtszellen, die die Infektion (4B), aufgetragen werden, um Mutationen, die Zytotoxizität Coxiella (zytotoxische Phänotyp) verleihen identifizieren. Wie oben wurde die statistische Analyse verwendet, um Bereiche in der resultierenden Streudiagramm entsprechend mild (-4 &lt;Z-Score ≤ -2) und schwere (Z-Score ≤ -4) Phänotypen zu definieren. Die meisten Mutationen gescreent nicht signifikant auf das Überleben der Zelle, unabhängig von bakteriellen Replikations im WirtsZellen (3B grüne Punkte). 37 Mutationen leicht betroffen Wirtszelle Überleben (3B, leicht rote Punkte) und 7 Mutationen waren besonders schädlich für das Überleben der Zellen (3B, dunkle rote Punkte) hosten. Bitte beachten Sie, dass durch die automatisierte Bildanalyseverfahren erhalten zusätzliche Parameter können verwendet werden, um den übrigen Diagrammen abgeleitet werden, je nach experimentellen Anforderungen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Abb. 1: Die Sequenzierung und Annotation von Coxiella Transposon-Mutanten (A) Einzelprimer Kolonie-PCR wird verwendet, um DNA-Fragmente, die die Stelle der Transposon-Insertion zu verstärken. Amplifikationsprimer (Amp) sowohl als spezifische und unspezifische Primer in Abhängigkeit von der Stringenz der Glühtemperatur verwendet. (B) Typische Ergebnis der Einzelprimer-Kolonie-PCR. Jede Reactiauf produziert eine Anzahl von Fragmenten unterschiedlicher Größe, von denen einige das Transposon Insertionsstelle enthält; einige andere zufällig als Nebenprodukte der PCR-Zyklus niedriger Stringenz amplifiziert. (C) Die Verwendung eines Sequenzierungsprimer (Seq), der auf einem Transposon-Sequenz hybridisiert, kann die Sequenzierung der Fragmente von Interesse. (D) Die Sequenzanalyse-Software ermöglicht die automatische Annotation von Transposoninsertionen auf das bakterielle Genom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Abb. 2: Axenic und intrazelluläre Wachstum von Coxiella Transposon-Mutanten (A) In der Pilotschirm haben wir in 16 Kern g isoliert, sequenziert und abgeschirmt 38 Transposon-Mutantenenen der Coxiella dot / icm-Sekretionssystem (rot gekennzeichnet). (B) Um die Rentabilität der einzelnen Transposon-Mutante zu bewerten, das Wachstum je Isolat in axenischen Kulturmedium wird über 8 Tage mit einem fluoreszenzmarkierten DNA-Interkalationsmittel überwacht. (C) jede Mutante wird dann verwendet, um Epithelzellen zu infizieren. Wie das Transposon besitzt eine GFP Kassette wird intrazellulären Bakterienwachstum mehr als 7 Tage nach der Infektion, indem Sie die Variationen der GFP-Fluoreszenz mit Coxiella Replikation verbunden ist, unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader überwacht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Abbildung 3: Automatisierte Bildanalyse von Coxiella Infektionen Ein Auto.Zusammengesetzte Epifluoreszenzmikroskop wird zur Abbildung 21 Positionen pro Loch von dreifachen 96-Well-Platten. Die Bildanalyse-Software Segmente Objekten in jeder erworbenen Kanäle für die Quantifizierung und Analyse. In allen Fällen werden die Gegenstände berühren den Rand der Bilder ausgeschlossen. (A) Die Hoechst-Kanal wird verwendet, um Wirtszellkerne zu identifizieren (in grün markiert). (B) Diese werden als Keime verwendet werden, um Wirtszellkonturen im Cy3-Kanal zu identifizieren (die Position der Kerne blau eingekreist sind Zellkonturen in grün). (C) Das Cy5-Kanal wird verwendet, um LAMP1-positive Fächer zu identifizieren (in grün eingekreist); nur die in den zuvor identifizierten Zellkonturen (in rot) enthalten Objekte für die Bildanalyse erhalten. (D) Die GFP-Kanal wird verwendet, um Coxiella Kolonien zu identifizieren (in grün markiert). (E) Korrelieren Coxiella Kolonien mit LAMP1 positive Abteilen ermöglicht die Identifizierung von Coxiella </em&gt; Enthaltenden Vakuolen (CCV); nur die in den zuvor identifizierten Zellkonturen enthalten Objekte (in grün) für die Bildanalyse erhalten. (F) Korrelieren Coxiella Kolonien mit Zellkonturen ermöglicht die Identifizierung von infizierten Zellen (pseudocolored). (G) in den 4 Fluoreszenzkanälen erworbene Bilder (entsprechend Coxiella Kolonien (grün), Wirtszellkerne (blau), Wirtszellplasmamembran (grau), LAMP1-positive Fächer (rot)) werden zusammengeführt und für die Darstellung und Qualität verwendet Kontrolle. Maßstabsbalken 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Abbildung 4: Groß Identifizierung von Coxiella Faktoren in Wirts Mitmachen / Pathogen interagierenIonen. (A) Die durchschnittliche Fläche (in &amp; mgr; m 2) von Coxiella Kolonien gegen die relative Anzahl der Kolonien pro Zelle aufgetragen ist, um die Replikation und Internalisierung Phänotypen von Interesse zu identifizieren. Grüne Punkte stehen für Phänotypen, die von WT Coxiella durch einen Z-Score&gt; -2 (nicht signifikant) abweichen. Rosa und Hellblau Punkte stehen für die Replikation und Internalisierung Phänotypen jeweils mit einem Z-Score zwischen -2 und -4 (mild Phänotypen). Rot und dunkelblau Punkte stellen Phänotypen mit einem Z-Score ≤ 4 (starke Phänotypen). (B) Die mittlere Fläche (in &amp; mgr; m 2) von Coxiella Kolonien wurde an der Gesamtzahl von Zellen (infiziert und nicht infiziert), dass 7 Tage nach der Infektion auf die zytotoxische Wirkung von Transposoninsertionen resultierende Schätzung lebten aufgetragen. Grüne Punkte stehen für Phänotypen, die von WT Coxiella durch einen Z-Score&gt; -2 (nicht signifikant) abweichen. Rosa Punkte stellen zytotoxische phenotypes mit einem Z-Score zwischen -2 und -4 (mild Phänotypen). Rote Punkte stehen für zytotoxische Phänotypen mit einem Z-Score ≤ 4 (starke Phänotypen). Die Pfeile zeigen die Mutanten durch den entsprechenden Kleinbuchstaben in C (C) veranschaulicht repräsentative Bilder der Replikation, Internalisierung und zytotoxische Phänotypen. In allen Fällen sind Wirtszellkerne in rot, sind Coxiella Kolonien in grün. Maßstabsbalken 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Coxiella burnetii ist ein obligat intrazelluläre Gram-negative Bakterium für die Zoonose Q-Fieber verantwortlich. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Coxiella Fluoreszenz Transposon-Mutanten als auch die automatisierte Identifizierung und Analyse der resultierenden Internalisierung, Replikation und zytotoxische Phänotypen.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, im großen Maßstab die COE-Faktoren zu identifizieren, die an den entscheidenden Schritten des infektiösen Zyklus beteiligt sind, einschließlich des Eintritts in Wirtszellen, der Bildung einer bakteriellen Replikationsnische und der Persistenz. Dies wird erreicht, indem zunächst eine GF PT-Ko-Mutantenbibliothek mittels Transposon-Mutagenese erzeugt wird.Anschließend werden die Wirtszellen mit jedem isolierten Mutanten infiziert. Danach wird die intrazelluläre Replikation jedes Mutanten in Echtzeit mittels eines Mikroplattenlesegeräts verfolgt, um diejenigen Mutationen zu identifizieren, die für die Coxiella-Infektion am schädlichsten sind. Schließlich werden die mit Coxiella infizierten Zellen mittels automatisierter Mikroskopie analysiert.Schließlich ermöglicht die automatisierte Bildanalyse die morphologische Charakterisierung jedes erhaltenen Phänotyps, um jedes mutierte Gen mit einer vermuteten Funktion im infektiösen Zyklus von Coxiella in Verbindung zu bringen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu klären, beispielsweise die umfassende Identifizierung der essentiellen Gene eines bestimmten Pathogens, die erforderlich sind, um mit der gesamten Zelle zu interagieren und deren molekulare Maschinerie zum eigenen Vorteil zu übernehmen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da das Ausplattieren und die Isolierung von COE-Kolonien schwierig durchzuführen sind.Tatsächlich bildet COE sehr kleine Kolonien, die sorgfältig aus weichem ACCM zwei aro gewonnen werden müssen. Wie diese Methode Einblicke in kokkale Lab-Infektionen liefern kann. Sie kann außerdem auf andere intrazelluläre pathogene Bakterien wie Salmonella, Burel, Mycobacterium usw. angewandt werden.Nach der Transformation kompetenter Coxiella mit Transposon- und Transposase-beschichteten Plasmiden gemäß dem Textprotokoll, um einzelne Mutanten zu isolieren, bereiten Sie die untere Agaros vor, indem Sie 10 Milliliter geschmolzenes 0,5 %iges Agaros mit 10 Milliliter zweifach konzentriertem ACCM-2 in einem mikrobiologischen Sicherheitswerkbank (MSC) mischen und sofort die geeigneten Antibiotika hinzufügen, in eine Petrischale gießen, 30 Minuten offen abkühlen lassen und anschließend 20 Minuten lufttrocknen. Zur Herstellung der oberen Agaros mischen Sie 1,25 Milliliter zweifach konzentriertes ACCM-2 mit 0,75 Milliliter Wasser in einem 15-Milliliter-Polystyrolrohr. Geben Sie die geeigneten Antibiotika hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius.Dann ein bis 100 Mikroliter bakterielle Kultur hinzufügen und fünf Sekunden lang verwirbeln. Danach 0,5 Milliliter geschmolzene Aros-Mischung zugeben und diese sofort über den unteren Aros-Gel unterlauf geben. Die Platte 20 Minuten lang abkühlen lassen.Setzen Sie den Deckel auf und inkubieren Sie bei vier Grad Celsius für 20 Minuten, um die Festigung zu unterstützen. Entfernen Sie anschließend den Deckel und lassen Sie die Platte 20 Minuten lang an der Luft trocknen, bevor Sie sie in einen feuchten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 2,5 % Sauerstoff für sechs bis sieben Tage überführen. Sobald Kolonien sichtbar sind, sammeln Sie diese, indem Sie die Spitze einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze abschneiden und diese zum Isolieren von Plugs verwenden, die einzelne Kolonien enthalten.Danach in die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte überführen, die 1,5 Milliliter ACCM zwei enthält. Nach der Herstellung einer Standardkurve gemäß dem Textprotokoll jede Bakteriensuspension quantifizieren, indem fünf Mikroliter 10 % Triton X-100 pro Vertiefung zugegeben werden. In einer 96-Loch-Mikroplatte mit schwarzen Wänden und Boden 50 Mikroliter der Bakteriensuspensionen in jede Vertiefung geben und 10 Minuten auf einem Plattenrührer inkubieren.Verdünnen Sie bei Raumtemperatur das Reagenz zur Quantifizierung doppelsträngiger DNA im Verhältnis 1:200 mit einem XTE-Puffer und geben Sie 55 Mikroliter des verdünnten Reagenzes zu jeder Probe hinzu. Mischen Sie die Probe in der 96-Well-Mikroplatte gründlich mit einem Plattenrührer, inkubieren Sie sie anschließend zwei bis fünf Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur und messen Sie dann die Fluoreszenz der Proben mithilfe eines Fluoreszenz-Mikroplatten-Readers und Filtern für Standard-Fluorescein-Wellenlängen. Um die Konzentration der bakteriellen DNA zu ermitteln, tragen Sie die Fluoreszenzmesswerte in die zuvor erstellte Standardkurve ein, und dividieren Sie die ermittelte DNA-Konzentration durch die Masse des Coxiella-Genoms, um die bakterielle Konzentration zu erhalten.Geben Sie die Ergebnisse in Genomäquivalenten pro Milliliter an, nachdem eine Einzelprimer-Kolonien-PCR und DNA-Sequenzierung gemäß dem Textprotokoll durchgeführt wurden. Laden Sie mit Hilfe einer Sequenzanalysesoftware das vollständig annotierte Genom von Coxiella burnetii RSA 493 NM mit der Funktion „Align to Reference“, laden und alignieren Sie die Sequenzergebnisse mittels BlastN und bestimmen Sie die Stelle der Transposition. Nach der Herstellung einer Vero-Zellsuspension mit 10^5 Zellen pro Milliliter in RPMI-Medium gemäß Textprotokoll pipettieren Sie 100 Mikroliter der Suspension in jede Vertiefung einer schwarzen 96-Loch-Platte mit flachem, transparentem Boden, zentrifugieren die Platte bei 400 × g und Raumtemperatur für fünf Minuten und inkubieren sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.Am folgenden Tag fallen die bei Raumtemperatur stehenden 96-Loch-Platten mit den Coxiella-Mutanten an und verdünnen 150 Mikroliter Bakteriensuspensionen in 300 Mikroliter RPMI ohne Phenolrot und FBS in einer Tiefbrunnen-96-Loch-Platte. Entfernen Sie anschließend das Medium aus den Vero-Zellen und geben Sie 100 Mikroliter pro Loch der verdünnten Coxiella-Mutanten hinzu. Verwenden Sie das Loch A1 als negativen Kontrollansatz und die Löcher A2 und A3 als positive Kontrollen. Mit einem aerosoldichten Zentrifugenplattenhalter wird die Platte bei 400 × g und Raumtemperatur 10 Minuten lang zentrifugiert. Danach inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid. Ersetzen Sie anschließend das bakterienhaltige Medium durch jeweils 100 Mikroliter frisches, vollständiges RPMI-Medium pro Loch. Verwenden Sie einen Fluoreszenz-Mikroplattenreader mit Filtern für Fluorescein.Messen Sie die GFP-Fluoreszenz jeden Tag über sieben Tage. Am siebten Tag nach der Infektion entfernen Sie das Medium von der Platte und ersetzen es durch 50 Mikroliter frisches komplettes Medium pro Vertiefung, das eine 1:1000-Verdünnung eines zellpermeablen fluoreszierenden Farbstoffs enthält. Inkubieren Sie die Zellen 30 bis 60 Minuten lang; danach ersetzen Sie das Medium durch 50 Mikroliter pro Vertiefung 4 % PFA in PBS und inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Entfernen Sie anschließend den PFA-haltigen Puffer, bevor Sie die Vertiefungen dreimal mit PBS waschen. Nach dem Entfernen des letzten Waschschritts geben Sie 50 Mikroliter Blockierungslösung in jede Vertiefung und inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten.Danach die Blockierungslösung durch 40 Mikroliter pro Mulde frische Blockierungslösung und eine 1:500-Verdünnung des Anti-Lamp1-Antikörpers ersetzen. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur die Lösung entfernen und die Mulden mithilfe eines Plattenwäschers fünfmal mit jeweils 100 Mikrolitern pro Mulde PBS waschen. Anschließend 40 Mikroliter pro Mulde Blockierungslösung zugeben, die den geeigneten fluoreszierenden sekundären Antikörper und HOOK33258 in einer Konzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter enthält.Ansatz bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubieren. Die Proben fünfmal waschen und die letzte PBS-Waschung in den Vertiefungen belassen, um ein Austrocknen zu verhindern. Zur Durchführung der Bildaufnahme ein automatisiertes Epi-Fluoreszenzmikroskop mit einer 20x-Objektivlinse sowie 3 4 88 5 55 und sechs 15 Nanometer Kanälen verwenden.Erwerben Sie 21 unabhängige Felder pro Mulde, um mindestens 5.000 Zellen pro Probe abzubilden. Wenden Sie die automatische Fokussierung unter Verwendung des Kanals für die Wirtszellkerne als Referenz an. Schließlich verwenden Sie eine automatisierte Bildanalyse, um eine Reihe relevanter Merkmale aus den aufgenommenen Bildern zu extrapolieren.Diese Abbildung veranschaulicht 38 Transposon-Mutationen in 16 Punkt-ICM Coxe L bei Genen aen Wachstumskurven, die die Lebensfähigkeit der Mutanten beurteilen, wie hier gezeigt. Intrazelluläre Wachstumskurven von Coxiella-Mutanten, die mit epithelialen Zellen inkubiert wurden, ermöglichen eine quantitative Analyse der mit Transposon-Insertionen im Coxiella-Genom assoziierten Phänotypen. In dieser Abbildung wurde eine automatisierte Bildaufnahme durchgeführt, um Wirtszellkerne, Zellkonturen, Lysosomen und Coxiella-Kolonien zu identifizieren und zu charakterisieren.Die Korrelation von Coxiella-Kolonien mit Zellen und Lysosomen ermöglicht die morphologische Analyse von Coxiella-haltigen Vakuolen. Die Korrelation von Coxiella-Kolonien mit den Konturen der Wirtszellen ermöglicht die morphologische Analyse infizierter Zellen. Schließlich werden die vier Kanäle zusammengeführt.Die durchschnittliche Fläche von Coxiella-Kolonien wird gegen die Anzahl der Kolonien pro Zelle aufgetragen, um Mutationen zu identifizieren, die die intrazelluläre Replikation von Coxiella und/oder die Fähigkeit der Bakterien, Wirtszellen zu infizieren, beeinflussen. Mutationen wurden in drei Gruppen beobachtet: solche, die das intrazelluläre Wachstum von Coxiella beeinträchtigen, solche, die die Internalisierung von Coxiella in Zellen betreffen, sowie nicht-signifikante Phänotypen. Hier wird die durchschnittliche Fläche von Coxiella-Kolonien gegen die Anzahl der überlebenden Wirtszellen nach der Infektion aufgetragen, um Mutationen zu identifizieren, die Coxiella nach ihrer Entwicklung Zytotoxizität verleihen.Diese Technik ebnete den Weg dafür, dass Forscher im Bereich bakterieller Infektionen Wirt-Pathogen-Interaktionen im großen Maßstab untersuchen konnten, und identifizierte Wirt- und bakterielle Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Therapien zur Bekämpfung infektiöser Krankheiten.

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Eine grundlegende Aufgabe in der Zellbiologie ist es, die Mechanismen, die die Identität der Organellen, die eukaryotischen Zellen machen zu Grunde liegen zu definieren. Hier schlagen wir eine Methode, um die Gene verantwortlich für die morphologische und funktionelle Integrität der Anlage Organellen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Next-Generation-Sequencing-Tools zu identifizieren.

Fluoreszenz-Mikroskopie Screening und Next-Generation-Sequencing: Nützliche Tools für die Identifizierung von Genen in den Organellen Integrität beteiligt

Dieses Video zeigt eine Methode zur Beurteilung des intrazellulären Wachstums von GFP-markierten Coxiella-Mutanten in kultivierten Epithelzellen. Der mutierte Phänotyp wird mittels Immunfärbung und Epifluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht, was die Untersuchung der Wirkung der Mutation auf das intrazelluläre Wachstum ermöglicht.

Bewertung des intrazellulären Wachstums von Coxiella-Mutanten in eukaryotischen Zellen

Enterobacter sp. Ysu wächst in Glucose-Minimalsalzmedium. Auxotrophe werden durch Transformation mit einem transposome die zufällig fügt sich in das Wirtsgenom erzeugt. Mutanten werden durch Replika-Plattierung aus komplexen Medium, um Minimalmedium gefunden. Unterbrochen Gene durch Gen Rettungs- und Sequenzierung identifiziert.

Erzeugung Enterobacter Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

Stressresistenz ist eines der Markenzeichen für Langlebigkeit und ist bekannt, genetisch geregelt. Hier entwickelten wir eine unvoreingenommene Hochdurchsatzverfahren für Mutationen, die Stress-Resistenz verleihen in ES-Zellen, mit dem Maus-Modelle für Langlebigkeit Studien entwickeln zu screenen.

Vorwärts genetische Ansatz zur Stressresistenz-Gene in Mäuse Entdecken - Hochdurchsatz-Bildschirm in ES-Zellen

Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Erregern und ihren Wirten ist ein wichtiger Bereich der biologischen Forschung. Hier beschreiben wir die notwendigen Techniken Effektor - Translokation durch Coxiella burnetii während siRNA Gen - Silencing mit BlaM Substrat zu messen.

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Während siRNA Silencing

Hier stellen wir Protokolle für Anfänger Forscher um Phänotypisierung für die pharmakologisch wichtigen bakteriellen Gattung Streptomyceszu initiieren.

Visuelle und Mikroskopische Auswertung von Streptomyces Entwicklungsstörungen Mutanten

Wir beschreiben eine Methode zur Generierung von sättigungsverstärkenden Mutationsbibliotheken in gramnegativen Bakterien und der anschließenden Herstellung von DNA-Amplikonbibliotheken für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Als Beispiel konzentrieren wir uns auf den ESKAPE-Erreger Acinetobacter baumannii, aber dieses Protokoll ist für eine Vielzahl von Gram-negativen Organismen zugänglich.

Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Erfahren Sie die Generierung und das Screening von Coxiella burnetii-Transposon-Mutanten zur Analyse von Internalisierung, Replikation und Zytotoxizität. Diese Methode ermöglicht die großangelegte Identifizierung essenzieller Infektionsgene.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening

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