Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening Coxiella burnetii Transposon-Mutanten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Identifizierung in großem Maßstab. Die COE-Faktoren sind an den Schlüsselschritten des Infektionszyklus beteiligt, einschließlich des Eintritts in die Wirtszellen, der Bildung einer bakteriellen replikativen Nische und der Persistenz. Dies wird erreicht, indem zunächst eine GF PT Co-Mutantenbibliothek durch Transponierung auf Mutagenese erzeugt wird.

Anschließend werden die Wirtszellen mit jeder isolierten Mutante infiziert. Dann wird die intrazelluläre Replikation jeder Mutante in Echtzeit mit einem Mikroplatten-Reader verfolgt, um die Mutationen zu identifizieren, die für eine Coxiella-Infektion am schädlichsten sind. Abschließend werden die mit Coxiella infizierten Zellen mittels automatisierter Mikroskopie analysiert.

Letztendlich ermöglicht die automatisierte Bildanalyse die morphologische Charakterisierung jedes erhaltenen Phänotyps, um jedes mutierte Gen mit einer mutierten Funktion im Coxiella-Infektionszyklus zu verknüpfen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Wirt-Erreger-Interaktionen zu lösen, wie z. B. die groß angelegte Identifizierung der essentiellen Gene eines bestimmten Krankheitserregers, die erforderlich sind, um mit der gesamten Zelle zu interagieren und ihre molekularen Maschinerien zu ihrem Vorteil zu kapern. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Beschichtung und Isolierung von COE-Kolonien schwer zu erreichen ist.

In der Tat bildet COE sehr kleine Kolonien, die sorgfältig aus weichen ACCM zwei aro extrahiert werden müssen. Wie diese Methode Einblicke in die Infektion im Kokkenlabor geben kann. Es kann auch auf andere intrazelluläre pathogene Bakterien wie Salmonellen, Burel, Mycobacterium usw. angewendet werden.

Nach der Transformation kompetenter Coxiella mit Transposon- und Transposase-Beschichtungsplasmiden gemäß dem Textprotokoll zur Isolierung einzelner Mutanten bereiten Sie untere aros vor, indem Sie 10 Milliliter geschmolzene 0,5%aros mit 10 Millilitern von zwei X accm, zwei in einer mikrobiellen Sicherheitswerkbank oder MSC mischen und die entsprechenden Antibiotika hinzufügen, sofort in eine Petrischale gießen und unbedeckt 30 Minuten abkühlen lassen und dann 20 Minuten an der Luft trocknen lassen. Für die Zubereitung des Top Bag Aros 1,25 Milliliter von zwei x accm zwei mit 0,75 Millilitern Wasser in einem 15 Milliliter Styropor-Röhrchen mischen. Fügen Sie die entsprechenden Antibiotika hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius.

Dann einen auf 100 Mikroliter Bakterienkultur geben und fünf Sekunden lang vortexen. Als nächstes 0,5 Milliliter geschmolzene Aros-Mischung hinzufügen und sofort über den unteren Aros-Mix gießen. Den Teller 20 Minuten abkühlen lassen.

Setzen Sie den Deckel darauf und inkubieren Sie ihn 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius, damit er sich besser verfestigt. Nehmen Sie dann den Deckel ab und trocknen Sie die Platte 20 Minuten lang an der Luft, bevor Sie sie für sechs bis sieben Tage in einen 37 Grad Celsius feuchten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und 2,5 % Sauerstoff geben. Sobald Kolonien nachweisbar sind, sammeln Sie sie, indem Sie das Ende einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze abschneiden und damit Pfropfen isolieren, die einzelne Kolonien enthalten.

Dann werden sie in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 1,5 Millilitern accm two übertragen. Nach der Erstellung einer Standardkurve gemäß dem Textprotokoll quantifizieren Sie jede Bakteriensuspension, indem Sie fünf Mikroliter 10 % Triton X 100 pro Vertiefung abgeben. In einer 96-Well-Mikroplatte mit schwarzen Wänden und schwarzem Boden 50 Mikroliter der Bakteriensuspensionen in jede Vertiefung geben und 10 Minuten auf einem Plattenschüttler inkubieren.

Verwenden Sie bei Raumtemperatur einen XTE-Puffer, um das doppelsträngige DNA-Quantifizierungsreagenz eins auf 200 zu verdünnen, und fügen Sie jeder Probe 55 Mikroliter des verdünnten Reagenzes hinzu. Messen Sie in der 96-Well-Mikroplatte mit einem Plattenschüttler gut gemischt, bevor Sie zwei bis fünf Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert werden, die Fluoreszenz der Proben mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader und Filtern für Standard-Fluoreszein-Wellenlängen. Um das Diagramm der bakteriellen DNA-Konzentration zu erhalten, dividieren die Fluoreszenzmesswerte in der zuvor erstellten Standardkurve die DNA-Konzentration durch die Masse des Coxiella-Genoms, um die Bakterienkonzentration zu erhalten.

Geben Sie die Ergebnisse in Genomäquivalenten pro Milliliter aus, nachdem Sie eine Einzelprimer-Kolonie-PCR und DNA-Sequenzierung gemäß dem Textprotokoll durchgeführt haben. Laden Sie mit Hilfe einer Sequenzanalysesoftware das vollständige annotierte Genom von Coxiella Burnett I 4 93 NM one mit der Funktion "Align to Reference", laden Sie die Sequenzergebnisse und richten Sie sie mit blast N aus und bestimmen Sie den Ort der Transposition. Nach der Herstellung einer Vero-Zellsuspension von 10 bis fünf Zellen pro Milliliter in RPMI-Medium gemäß dem Textprotokoll geben Sie 100 Mikroliter der Suspension in jede Vertiefung einer schwarzen 96-Well-Platte mit flachem, transparentem Boden ab, zentrifugieren die Platte bei 400 mal G und räumen sie fünf Minuten lang und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Am folgenden Tag werden 96-Well-Platten, die die Coxiella-Mutanten enthalten, bei Raumtemperatur niederfallen und 150 Mikroliter bakterielle Suspensionen in 300 Mikrolitern RPMI ohne Phenolrot und FBS in einer 96-Well-Deep-Well-Platte verdünnt, anschließend das Medium aus den Vero-Zellen entfernt und 100 Mikroliter verdünnte Coxiella-Mutanten pro Vertiefung abgegeben. Verwenden Sie die Vertiefung A eins als Negativkontrolle und die Vertiefungen a zwei und drei als Positivkontrollen, indem Sie einen aerosoldichten Zentrifugenplattenhalter verwenden, zentrifugieren Sie die Platte bei 400 mal G und Raumtemperatur für 10 Minuten. Nachdem Sie die Platte zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid inkubiert haben, ersetzen Sie das bakterienhaltige Medium durch 100 Mikroliter pro Vertiefung frisches vollständiges RPMI-Medium durch einen Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader und Filter für Fluorescein.

Messen Sie die GFP-Fluoreszenz sieben Tage lang jeden Tag Am siebten Tag nach der Infektion, nehmen Sie das Medium von der Platte und ersetzen Sie es durch 50 Mikroliter pro Vertiefung frisches vollständiges Medium, das eine Verdünnung des zellpermeablen Fluoreszenzfarbstoffs von 1 bis 1000 Grad enthält. Inkubieren Sie die Zellen nach der Inkubation 30 bis 60 Minuten lang, ersetzen Sie das Medium durch 50 Mikroliter pro Well 4%PFA in PBS und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann den PFA-haltigen Puffer, bevor Sie PBS verwenden, um die Vertiefungen dreimal zu waschen. Geben Sie nach dem Entfernen der letzten Wäsche 50 Mikroliter Blockierungslösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Ersetzen Sie dann die Blockierungslösung durch 40 Mikroliter pro Vertiefung, eine frische Blockierungslösung und eine Verdünnung von 1 bis 500 Anti-Lampe-Antikörper. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur entfernen Sie die Lösung und waschen Sie die Vertiefungen mit einer Plattenwaschmaschine fünfmal, indem Sie 100 Mikroliter PBS pro Vertiefung auftragen. Dann fügen Sie 40 Mikroliter Blockierungslösung pro Vertiefung hinzu, die den entsprechenden fluoreszierenden Sekundärantikörper enthält, und haken 3 3 2 5 8 mit fünf Mikrogramm pro Milliliter ein.

30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Proben fünfmal und lassen Sie die letzte PBS-Wäsche in den Vertiefungen, damit sie nicht austrocknen. Für die Bildaufnahme wird ein automatisiertes Epi-Fluoreszenzmikroskop verwendet, das mit einem 20-fach-Objektiv und 3 4 88 5 55 sowie sechs 15-Nanometer-Kanälen ausgestattet ist.

Erfassen Sie 21 unabhängige Felder pro Well, um mindestens 5.000 Zellen pro Probe abzubilden. Wenden Sie den Autofokus an, indem Sie den Kernkanal der Wirtszelle als Referenz verwenden. Verwenden Sie schließlich die automatisierte Bildanalyse, um eine Reihe relevanter Merkmale aus den aufgenommenen Bildern zu extrapolieren.

Diese Abbildung zeigt 38 Transponierungen auf Mutanten in 16 Punkt ICM Coxe L bei Genen und Wachstumskurven, die die Lebensfähigkeit von Mutanten bewerten. Hier. Intrazelluläre Wachstumskurven für Coxiella-Mutanten, die mit Epithelzellen inkubiert wurden, ermöglichen eine quantitative Analyse der Phänotypen, die mit der Transponierung von Insertionen im Coxiella-Genom assoziiert sind. In dieser Abbildung wurde eine automatisierte Bildaufnahme durchgeführt, um Wirtszellkerne, Zellkonturen, Lysosomen und Coxiella-Kolonien zu identifizieren und zu charakterisieren.

Die Korrelation von Coxiella-Kolonien mit Zellen und Lysosomen ermöglicht die morphologische Analyse von Coxiella-haltigen Vakuolen. Die Korrelation von Coxiella-Kolonien mit den Konturen der Wirtszelle ermöglicht die morphologische Analyse infizierter Zellen. Abschließend werden die vier Kanäle zusammengeführt.

Die durchschnittliche Fläche der Coxiella-Kolonien wird gegen die Anzahl der Kolonien pro Zelle aufgetragen, um Mutationen zu identifizieren, die die intrazelluläre Replikation von Coxiella und/oder die Fähigkeit von Bakterien, in Wirtszellen einzudringen, beeinflussen. Mutanten wurden in drei Clustern beobachtet: Mutationen, die das intrazelluläre Wachstum von Coxiella, Coxiella-Internalisierung in Zellen und nicht signifikante Phänotypen beeinflussten. Hier wird die durchschnittliche Fläche der Coxiella-Kolonien gegen die Anzahl der Wirtszellen aufgetragen, die die Infektion überleben, um Mutationen zu identifizieren, die Coxiella nach seiner Entwicklung Zytotoxizität verleihen.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der bakteriellen Infektionen den Weg, um die Wechselwirkungen zwischen Wirtserregern in großem Maßstab zu erforschen, und identifizierte die Ziele des Wirts und der Bakterien für die Entwicklung neuer Therapien zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten.