Name: Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme Coxiella burnetii Transposon Mutantlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Öğrenin, Coxiella burnetii transposon mutantlarının üretimi ve çok fenotipik yüksek içerikli taraması için otomatik mikroskopi ve gerçek zamanlı izleme yöntemlerini. Bu teknik, patojen enfeksiyon döngüsündeki temel genleri belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Matteo Bonazzi'ye Avenir/ATIP hibesi ve Eric Martinez'e Marie Curie CIG (N° 293731) ile desteklenmiştir. Yazarlar, C. burnetii suşlarını, antikorlarını ve araçlarını paylaştığı için Dr. Robert Heinzen'e, teknik yardımları ve veri analizleri için Virginie Georget ve Sylvain DeRossi'ye (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) teşekkür eder.

<ol><li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li>
<li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples%2C+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li>
<li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coxiella+burnetii.+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li>
<li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+fever%3A+a+biological+weapon+in+your+backyard%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li>
<li>Der Hoek, W. V. an, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li>
<li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.%3A+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), Baltimore, Md. 6078-6085 (1999).</li>
<li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+OmpA%2C+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion%2C+by+multi-phenotypic+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013(2014).</li>
<li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Berón, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+microbiology%22%5BJournal%5D)">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li>
<li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a, Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot%2FIcm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566(2013).</li>
<li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+a+tiger+into+a+house+cat%3A+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii.%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii.</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li>
<li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li>
<li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dot%2FIcm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li>
<li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li>
<li>Beare, P. a, Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97(2011).</li>
<li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+screening+in+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Ev sahibi / patojen etkileşimlerinin araştırılması bakteriyel enfeksiyonların anlamak ve bulaşıcı hastalıkların karşı alternatif stratejiler geliştirmek için dikkate değer bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, farklı bakteriyel patojenler tarafından hazırlanan stratejilerin çeşitliliği, bakteriyel virülans faktörleri ve enfeksiyonlar sırasında hedeflenen sinyal yollarının host kimlik ve karakterizasyonu gerçek bir meydan okuma temsil etmektedir. Bu anahtar konak / patojen etkileşimi göbeklerinin büyük ölçekli tanımlama için yeni yaklaşımların geliştirilmesi için çağrıda bulunmaktadır. yenilikçi, yüksek verimlilik ve yüksek içerik tarama tekniklerinin son gelişme hücre içi bakteriyel patojenler 15 çalışmaya adapte edilebilir paha biçilmez bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, transpozon mutagenezi ve floresan bazlı tahliller kombine bir tarama yaklaşımların geliştirilmesi için bir model olarak zoonotik bakteriyel patojen Coxiella burnetii&#39;ye kullandık. Importantly, bu tarama yöntemi, işgal çoğaltmak ve enfekte hücreler içinde devam için bu bakterinin tarafından geliştirilen stratejilerin küresel bakış sağlayan, Coxiella içi döngüsünün birden adımların eşzamanlı olarak izlenmesine olanak verir. Burada tarif edilen yaklaşım, bakteriyel patojenlerin çalışma uygulanmış iki iyi bilinen tekniklerle, transpozon mutagenezi ve floresan bazlı deneylerde, dayanmaktadır. Yüksek verimli / yüksek içerik ekranlarında bağlamında bu tekniklerin birleştiren bize olayların çok yüksek sayıda (bakteriyel mutasyon başına tipik 15.000 enfekte olan hücreleri görüntülü ve analiz edilir) analiz ederek bakteriyel mutasyon sayısının yüksek etkilerini değerlendirmek için izin verir. Bu tür, doğası gereği, yüksek değişkenliğe tabidir konak hücreleri ve hücre içi çoğaltma, bakteriyel işgali gibi olaylar önemli bir istatistiksel analiz sağlar. Bu ep dışındaki bu hücre hatları dikkat etmek önemlidirithelial tarama bu tür için kullanılabilir. Konakçı hücre organelleri tespit etmek daha kolay Ancak, düz ve büyük epitel hücreleri görüntü analizi için uygun olan. Otomatik mikroskoplar çoğunluğu otomatik plakaların sayıda işleyebilir, çünkü aynı anda elenebilir mutantların sayısı neredeyse hiçbir sınırı vardır. Patojenin bağlı olarak, kullanıcı teneke ayrıcalık, bir Epifloresans veya konfokal mikroskop kullanımı. görüntü elde etme zamanı çoğunlukla kuyu başına ve görüş alanı başına elde edilen kanalların sayısı edinilen alanların sayısı, mikroskop kameranın duyarlılığına bağlıdır. Kullanıcı tarama protokolü optimize etmek için bu faktörleri nasıl ayarlanacağı karar verebilirsiniz. Bir örnek olarak, bu noktada 5.1 de belirtilen koşullar kullanılarak, bir 96-çukurlu plaka / saat görüntülenmiş. Görüntü analizi büyük ölçüde kullanılan makine (veya makinelerin küme) bağlıdır. Biz 12 çekirdekli (2 x 3.06 GHz 6 Çekirdekli), 48 GB RAM iş istasyonu kullanın. Bu makine approxi gerektiriryaklaşık 40 dakika bir plaka elde edilen görüntüleri analiz etmek. Bu analizleri uygularken, gelişmekte olan yeni resim kadar (veya mevcut optimizasyonu) numune çok sayıda manipülasyon ve işlenmesini sağlamak için protokolleri olduğunda önemli bir yönü dikkate alınacak. Tipik bir örnek bize hızla yükseltmek ve izin tek primer koloni PCR yaklaşımı, gelişimi çok küçük örneklerden, her transpozonun ekleme siteyi içeren dizisi Coxiella DNA fragmanları. Bizim deneyime dayalı, yüksek kalitede polimeraz özenle seçilmiş ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için test edilmelidir. Bu yaklaşımın tek sınırlama, vakaların çoğunda, işlenmiş örneklerin yaklaşık% 30&#39;u yararlanılamaz değil, gözlem PCR veya sıralama adımlar nedeniyle ya gizleyebilirsiniz. Bununla birlikte, yeni Coxiella transpozon mutantların izolasyonu, bir oran-sınırlayıcı aşama olmadığını dikkate alınarak, bu repre etmezönemli bir sorun gönderdi. Benzer şekilde, mutant stokların bakteri konsantrasyonunu ölçmek için güvenilir bir tahlil gelişimi bu yaklaşım için anahtar olmuştur. Süspansiyon içinde toplamak için Coxiella eğilimi nedeniyle, optik yoğunluk okumaları kullanılmasıydı Coxiella kültürler ve sadece mevcut alternatif konsantrasyonunu kantitatif PCR (qPCR) hesaplamak için geçerli değildir. Burada, bir floresan etiketli DNA interkalasyon maddesinin kullanımının önemli ölçüde bakteri kantitatif hızlandırdı. Bu yaklaşım, aynı zamanda kullanılan patojene bağlı olarak birkaç hücre içi fluoresan işaretleri ekspres eden stabil hücre çizgilerinin kullanımının avantajını sunar. Bir başka önemli yönü, fenol kırmızısı içermeyen hücre kültür ortamının kullanılmasıdır. Biz bu pH indikatör otomatik floresan okuyucu kaydedilen sinyali doyurur kırmızı ve yeşil spektrum kapsayan doğal bir floresan sahip olduğu görülmektedir. TBurada sunulan strateji rastgele transpozon mutajenezi dayanır. Ilgi mutantlar için, Güney leke ve transpozon ekleme sitenin PCR amplifikasyonlar kullanarak benzersiz transpozisyonlar doğrulama (ve klonalite) tavsiye ederim. Protokol bölümünde açıklanan ekipman yanı sıra, burada sunulan tarama yaklaşımı kullanılarak ilgilenen ekipler, veri toplama, veri depolama için bir sunucu ve hızlı görüntü analizi için bir iş istasyonu için bir ilişkisel veritabanı set up büyük bir avantaj alacak. Önemli bir şekilde, burada, diğer hücre içi bakteriyel patojenlerin çalışma için uygundur tarif edilen yöntem, bir rastgele mutagenez yöntemi patojenin mevcut mesafede, hücre çizgileri patojen ile enfekte olabilir ve bu bir enfeksiyon sırasında, belirli bir fenotip göstermektedir.

gelişmekte olan, endemik bakteri Coxiella burnetii Q ateş, şiddetli sağlık ve ekonomik etkisi 1 ile zayıflatıcı grip benzeri zoonoz büyük salgınlar sorumludur. Coxiella ana rezervuar iç ve çiftlik hayvanları, ve ABD&#39;de süt sığırı% 90&#39;dan fazla C taşıdıkları tahmin ediliyor 2 burnetii. İnsanlar kirlenmiş aerosollerin solunması yoluyla bulaşmış yanlışlıkla ana vardır. İnsan Q humması tezahür ya% 65 1,3 ulaşan mortalite oranı ile ölümcül komplikasyonların olabileceğini akut veya kronik hastalığı gibi. 1 bir enfeksiyon dozu ile - 10 organizmalar, Coxiella bilinen en bulaşıcı patojen ve potansiyel bir biyo silah 4 olarak araştırılmıştır. Hollanda (2007 - 2010) Q ateşi son patlayıcı salgını vakası yılda fazla 2,000 182 tırmanan ile, bu patojenin ciddi virulans bir örnek olarak duruyor5. Coxiella enfeksiyonlarının dikkate değer bir verimi büyük olasılıkla konakçı hücreler için eşsiz uyum ile birlikte çevresel strese karşı direnci ile ilişkilidir. Gerçekten de, Coxiella çok sert koşullar (kuruma, sıcaklık, vs.) önemli ölçüde dirençli olan metabolik olarak aktif olmayan küçük hücreli varyantları (SCV) şeklinde bir ortamda bulunmaktadır. Fagositik olmayan hücreleri istila Coxiella yapışması / istila OmpA 7 ve henüz tanımlanmamış reseptörün aracılık ederken SCVs kadar 3 integrinler 6 β α V ile fagositik hücreler tarafından alınır. Alımı takiben, Coxiella Rab5 ve EEA1 8 erken endozomal belirteçleri için pozitif dar vakuollerin, yaşıyor. Bakteriler Dot / Icm tip 4 salgı sistemini (T4SS) 9 metabolik olarak aktif büyük hücreli çeşitleri (LCVs) dönüştürme ve aktive ederek endozomal asitlenme cevapLegionella pneumophila 10&#39;dakine yüksek ölçüde homolog. Nokta / ICM efektör salgılanması Coxiella bakteri gelişirler ve aktif apoptozis 11 enfekte hücreleri korumak aktif lızozomal enzimleri ihtiva eden büyük bir LAMP1 pozitif asidik bir bölme oluşturmak için izin verir. Bu nedenle, Coxiella hücre içi döngüsü bakteriyel efektörlerinin 12 Nokta / Icm-aracılı translokasyonu ile kontrol edilir, ancak konakçı hücre istilası, bakteriyel replikasyonu ve enfeksiyonunun yayılması yer mikrobiyal faktörler büyük ölçüde bilinmemektedir. Ev sahibi hücre içinde 1) içselleştirme, 2) hücre içi çoğaltma, 3) hücreden hucreye yayılma: transposon mutagenez ve floresans-esaslı tahliller birleştirerek, Coxiella enfeksiyonlarının ana adımları yer bakteriyel faktörlerinin eş zamanlı olarak tanımlanması için tarafsız yaklaşımlar geliştirmektedir ve 4) sebat. Bugüne kadar, 1000 m üzerinde ekranlıCoxiella patogenezi 7 düzenleyen konak-patojen etkileşimleri içine görülmemiş anlayışlar bize sağlanan 500 Coxiella kodlama dizilerinde utations. Dikkat çekici bir şekilde, bu yaklaşım Coxiella hücre biyolojisi özellikleri paylaşan diğer hücre içi patojen çalışmaya uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Sitrik asit</td><td>Sigma</td><td>C0759-500G</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>Sodyum sitrat</td><td>Sigma</td><td>S4641-500G</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat</td><td>Sigma</td><td>60218-100G</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>Demir sülfat</td><td>Sigma</td><td>F8633-250G</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>S9625-500G</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>L-sistein</td><td>Sigma</td><td>C6852-25G</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>Bacto Neopeptone</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>211681</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>Kaamino asitler</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>223050</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>Metil-B-siklodekstrin</td><td>Sigma</td><td>C4555-10G</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>RPMI, glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>ACCM-2 orta bileşenli</td></tr><tr><td>RPMI, glutamax ile, fenol kırmızısı içermez</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td>Hücre kültürü ve enfeksiyon için</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>GE sağlık</td><td>SH30071</td><td>Hücre kültürü için</td></tr><tr><td>Tripsin EDTA (% 0.25)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25200-056</td><td>Hücre kültürü için</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td>İmmünofloresan boyama için</td></tr><tr><td>Amonyum klorür</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td>İmmünofloresan boyama için</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>İmmünofloresan boyama için</td></tr><tr><td>Elektroporasyon küveti 0,1 cm</td><td>Eurogentec</td><td>ce0001-50</td><td>Coxiella dönüşümü için</td></tr><tr><td>Trackmates kapaklı vidalı üst borular</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741</td><td>2D barkodlu vidalı kapak</td></tr><tr><td>Siyah duvarlı ve tabanlı 96 oyuklu mikroplaka</td><td>Greiner</td><td>655076</td><td>dsDNA kantitasyonu için düz koyu alt</td></tr><tr><td>96 oyuklu PCR mikroplaka</td><td>Biorad</td><td>2239441</td><td>DNAse/RNAse içermeyen</td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka, derin kuyu</td><td>Labcon</td><td>949481</td><td>Coxiella mutant enfeksiyonları için</td></tr><tr><td>DsDNA kantitasyonu için</td><td>PicoGreen</td><td>Life Technologies</td><td>P7581</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>dsDNA kantitasyonu için</td></tr><tr><td>Phusion yüksek kaliteli DNA polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td> Tek <td>için primer koloni PCR</td></tr><tr><td>Celltracker Kırmızı CMTPX</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>C34552</td><td>Görüntüleme için</td></tr><tr><td>Anti-LAMP1 antikoru</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>İmmünofloresan boyama için</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>L1418</td><td>Görüntüleme için</td></tr><tr><td>Floresan mikroplaka okuyucu Sonsuz 200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifloresan otomatik mikroskop Cellomics</td><td>Termo Bilimsel</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Üretim ve Çok fenotipik yüksek içerik eleme<em&gt; coxiella burnetii</em&gt; transposon mutantlar

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion ve bakteriyel patojenlerin konakçı hücrelerin kolonizasyonunun bozmak ve temel bir konak işlevlerini manipüle virülans faktörü olarak tanımlanan prokaryotik proteinleri, çok sayıda, aktivitesine bağlıdır. Ev sahibi / patojen etkileşimlerinin araştırılması bakteriyel enfeksiyonların anlamak ve bulaşıcı hastalıkların karşı alternatif stratejiler geliştirmek için bu nedenle son derece önemlidir. Bu yaklaşım, ancak bakteriyel virülans belirleyicileri tarafsız, otomatik tanımlama ve karakterizasyonu için yeni yüksek verimli tahlillerin geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, transpozon mutagenezi ile GFP etiketli mutant kütüphanesi oluşturulması için bir yöntem tarif ve yüksek içerik tarama gelişimi çok sayıda transpozon ilişkili fenotip eşzamanlı belirlenmesi için yaklaşımlar. Bizim çalışma modeli se ile ilişkili hücre içi bakteri patojen Coxiella burnetii, zoonoz Q ateşi etiyolojik ajandırvere bir sonucu sağlık ve ekonomik yük ile salgınlar. Bu patojenin zorunlu hücre içi doğası, son zamanlara kadar, ciddi Coxiella yüksek verimlilik / yüksek içeriği yaklaşımların uygulanması için ideal bir model haline ana patojen etkileşimlerinde karıştığına bakteriyel faktörlerin tanımlanmasını engellemiştir.

Transposon mutantların izolasyonu üzerine, tek primer koloni PCR her mutant için transpozon yerleştirme siteyi belirlemek için sağlam, yüksek verim yöntemidir. Bu yaklaşım, tipik bir iç içe PCR protokolü türeyen, ancak burada tek bir primer tavlama sıcaklığı (Şekil 1A) sıkılığına bağlı olarak, şablon DNA spesifik ve / veya non-spesifik olarak melezleşir. Tipik bir PCR ürünleri özgü çoğu birden fazla DNA fragmanları (Şekil 1B) oluşur. Sağ transpozon ITR yukan ve büyütme primeri tarafından tanınan sekansının alt baş tavlanan farklı dizileme primeri kullanımı dizileme aşama (Şekil 1C) BY için spesifisite sağlamaktadır. Dizi analizi için otomatik bir yazılım transpozon eklemeler (Şekil 1C) tam yeri sağlayan bir Coxiella genomuna edilen sekansları hizalanır. Tüm transposon eklemeleri sonra ann olabilirCoxiella genomu (Şekil 1D) üzerine otated. Her Coxiella mutantı izole edilmiş ve depolama ya da ayıklama öncesinde ACCM-2 ortamı içinde aksenik biçimde yükseltilir. 2 16 nokta / ICM Coxiella genleri (Şekil 2A), 38 transpozon mutantlarının bir örneğini göstermektedir, Şekil. Coxiella mutantlarının uygulanabilirliğini değerlendirmek için, aksenik büyüme eğrileri 1.5 (Figurie 2B) &#39;de tarif edilen bakteri konsantrasyonu tahlili Aşılama sonrası 7 gün bakteri kültürleri numune alma ve uygulanması ile elde edilir. Amplifiye mutantlar daha sonra, 7 gün için üçlü 96-yuvalı plakalar içinde, epitel hücreleri ile inkübe edilir. Üretilen tüm Coxiella mutantlar GFP etiketli hücre içi büyüme eğrileri de, her 24 saatte, her GFP floresans yoğunluğunu ölçülmesi ve zamanın bir fonksiyonu (Şekil 2C) olarak ölçülen değerlerin konulması sureti ile elde edilir edilir. Intracellular büyüme eğrileri Coxiella genomunda her transpozon ekleme ile ilişkili fenotipleri kantitatif analiz sağlar. Aynı transposon mutantlar hakkında nitel bilgiler eklemek için, otomatik görüntü toplama ve analiz için seçti. Yedi gün plakalar 4 açıklanmıştır ve bu CellProfiler (geniş Enstitüsü, 5. Otomatik görüntü analizi yazılımı tarif edildiği gibi otomatik bir, Epifloresans mikroskop kullanılarak analiz edildiği immünofloresans için işleme, sabittir, enfeksiyondan <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> alınan kanal işlem) bağımsız ve segmentler karşılaştırmalı analizi (Şekil 3) için nesneleri tespit. Bu konak hücre çekirdekleri, hücre konturları, lizozomlar ve Coxiella koloniler (Şekil 3 üst paneller) tanımlanması ve morfolojik karakterizasyonu sağlar. Hücreler ve lizozomlar ile Coxiella koloniler ilişkilendirilmesi identificati sağlarve (pozitif LAMP1, Şekil 3 sol alt panel vardır) Coxiella ihtiva-eden vakuollerin özgü morfolojik analizi. Konak hücre konturları ile Coxiella koloniler ilişkilendirilmesi kimlik ve enfekte olmuş hücrelerin spesifik morfolojik analizi (Şekil 3 orta alt panel) izin verir. Son olarak, 4 kanal illüstrasyon ve kalite kontrol amaçlı (Şekil 3 sağ alt panel) için birleştirilir. Otomatik görüntü analizinden elde edilen veriler &quot;çok fenotipik dağılım araziler&quot; elde etmek için birbirlerine karşı çizilebilir. Bir örnek olarak, Coxiella kolonilerinin Şekil 4A (um 2) ortalama alan olarak Coxiella (çoğaltma fenotip) ve / veya hücre içi çoğaltma etkileyen mutasyonları tespit etmek için, hücre (Şekil 4A), ortalama koloni sayısı karşı çizilir Ev sahibi hücreleri istila bakterilerin kapasitesi (internakatmanlara ayrılmasına fenotip). İstatistiksel analiz hafif (-4 &lt;Z-skoru ≤ -2) ve şiddetli (Z-skoru ≤ -4) fenotipleri karşılık ortaya çıkan dağılım arsa bölgeleri tanımlamak için kullanıldı. Mutantlar 3 ana kümelerde gözlendi: Coxiella bir kusurlu hücre içi büyüme sonuçlandı mutasyonlar arsa (Şekil 4A, pembe ve kırmızı noktalar) en sol kısmında gruplandırıldı; hücrelerde Coxiella içselleştirilmesi etkilenen mutasyonlar arsa alt kısmında gruplandırıldı (Şekil 4A, açık ve koyu mavi nokta) ve son olarak, arsa sağ çoğu bölgede yeşil noktalar (anlamlı olmayan fenotipleri sonuçlanan mutasyonlar karşılık Z-skoru&gt; -2). Önemli olarak, çoğaltma için başarısız ama yine de konakçı hücreleri istila mümkün olan mutantlar, hücre çekirdekleri (Şekil 4C, ikinci panel) barındırmak için bitişik tek bakteri ya da küçük koloniler, enfeksiyon 7 gün sonra tespit edilir. Bu nedenle, Coxiella boyutu &quot;ColoNies &quot;önemli ölçüde etkilenecek, ama enfekte olmuş hücrelerin sayısı WT Coxiella ile enfekte olan hücreler ile karşılaştırıldığında farklı olmayacaktır. Aksine, konak hücreleri işgal etmek Coxiella kapasitesini etkileyen mutasyonlar koloni / hücre sayısında bir azalmaya neden olur. Bu sayısı önemli ölçüde 1 &#39;in altında olduğu zaman, bu ortalama, enfekte olmuş hücrelerin toplam sayısında bir azalma olduğunu işaret etmektedir. Seçenek olarak ise, Coxiella kolonileri (um 2) ortalama alan Coxiella (sitotoksik fenotip) sitotoksiteye kazandıran mutasyonlar tespit etmek enfeksiyonu (Şekil 4B) hayatta konakçı hücreler, sayısına karşı çizilmiştir edilebilir. Yukarıdaki gibi, istatistiksel analiz hafif (-4 &lt;Z-skoru ≤ -2) ve şiddetli (Z-skoru ≤ -4) fenotipleri karşılık ortaya çıkan dağılım arsa bölgeleri tanımlamak için kullanıldı. En mutasyonlar önemli ölçüde konak içinde bakteriyel çoğalma olursa olsun, hücre yaşamını etkilemedi ekranlıhücreleri (Şekil 3B yeşil noktalar). 37 mutasyon hafif etkilenen konak hücre sağkalım (Şekil 3B, açık kırmızı noktalar) ve 7 mutasyonlar hücre sağkalım (Şekil 3B, koyu kırmızı noktalar) barındırmak için özellikle zararlı idi. Deneysel ihtiyaçlarına göre, otomatik bir görüntü analizi prosedürü ile elde edilen ek parametreler, diğer grafikleri elde etmek için kullanılabilir olduğunu not edin. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Şekil 1:. Sıralama ve Coxiella transpozon mutantlar açıklama (a) Tek primeri koloni PCR transpozon ekleme bölgesi içeren DNA fragmanlarının büyütülmesi için kullanılmıştır. Bir yükseltme primeri (Amp), tavlama sıcaklığının sıkılık bağlı olarak spesifik ve spesifik olmayan primer olarak hem de kullanılır. (B) tek primer koloni PCR tipik sonucudur. Her Reactiilgili transpozon ekleme yeri içeren bazıları değişken boyutta fragmanlar, bir dizi üretir; bazıları rastgele yan ürünlerin düşük sıkılık PCR döngüsünün olarak güçlendirilir. (C), transpozon sekansına hibridize olan bir dizileme primeri (Sekans no) kullanımı ilgi parçalarının sekanslanmasını sağlar. (D) Sıra analiz yazılımı bakteri genomu üzerinde transposon eklemeleri otomatik şerhi verir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Şekil 2:. Aksenik ve Coxiella transpozon mutantlar hücre içi büyüme (A) Pilot ekranında, biz 16 çekirdekli g 38 transposon mutantlar sıralı, izole ve ekranlı varCoxiella nokta / icm salgısı sistemi enes (kırmızı gösterilir). Her bir transpozon mutantının yaşayabilirliği belirlemek üzere (B), her biri bir büyüme aksenik kültür ortamı içinde izole bir floresan DNA interkalasyon temin edici madde etiketli kullanılarak 8 gün boyunca izlenir. (C) Her bir mutant daha sonra epitel hücrelerini enfekte etmek için kullanılır. Transpozon bir GFP kaset sahip olarak, hücre içi bakteri üremesi bir mikroplaka okuyucu kullanarak, Coxiella çoğaltma ile ilişkili GFP floresan varyasyonları takip ederek enfeksiyon üzerinde 7 gün izlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Şekil 3: Coxiella enfeksiyonlarının Otomatik görüntü analizi Bir ​​otomatik.çiftleşmiş epifluorışıma mikroskop görüntü üç kopya 96 oyuklu plakalar, oyuk başına 21 pozisyonları kullanılır. Görüntü analiz yazılımı segmentleri ölçümü ve analizi için her edinilen kanallarda nesneleri. Tüm durumlarda, görüntü sınır temas nesneler hariçtir. (A), Hoechst kanalı (yeşil çember), konakçı hücre çekirdekleri tanımlamak için kullanılır. (B) Bu Cy3 kanalında konak hücre konturları tanımlamak için tohum olarak kullanılmaktadır (çekirdeklerin pozisyonu mavi çember, hücre konturları yeşil vardır). (C) Cy5 kanalı LAMP1 pozitif bölmeler tanımlamak için kullanılır (yeşil daire); Sadece (kırmızı) daha önce tanımlanmış olan, hücre hatlarına dahil nesnelerin görüntü analizi için muhafaza edilir. (D), GFP kanalı (yeşil çember) Coxiella kolonilerini teşhis etmek için kullanılır. (E) LAMP1 pozitif bölmeleri ile Coxiella kolonileri ilişkilendirilmesi Coxiella belirlenmesini sağlar </em&gt; Ihtiva-eden vakuoller (CCVS); Sadece (yeşil) daha önce tanımlanmış olan, hücre hatlarına dahil nesnelerin görüntü analizi için muhafaza edilir. Hücre konturları ile Coxiella koloniler ilişkilendirilmesi (F) enfekte olmuş hücrelerin (yalancı) belirlenmesini sağlar. 4 floresan kanal edilen (G) resim (Coxiella koloniler (yeşil), konakçı hücre çekirdekleri (mavi), konakçı hücre, plazma membranı (gri), LAMP1 pozitif bölmeleri (kırmızı) karşılık gelen) birleştirilir ve gösterim ve kalite için kullanılan Kontrol. Ölçek 10 mikron barlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Şekil 4: ev sahibi yer Coxiella faktörlerin büyük ölçekli tanımlama / patojen etkileşimiyonları (A). Coxiella kolonilerin (um 2) hücre başına koloni nispi sayısı karşı çizilen ortalama alan, ilgi konusu çoğaltma ve içselleştirme fenotipleri tespit etmek. Yeşil noktalar Z-skoru&gt; -2 (önemli değil) tarafından WT Coxiella sapan fenotipleri temsil etmektedir. Pembe ve açık mavi noktalar -2 ve -4 (hafif fenotip) arasında bir Z-skoru sırasıyla çoğaltma ve içselleştirme fenotipleri temsil etmektedir. Kırmızı ve koyu mavi noktalar Z-skoru ≤ -4 (güçlü fenotipleri) ile fenotipleri temsil etmektedir. Coxiella kolonileri (B) (mikron 2) ortalama alan transpozon eklemeleri kaynaklanan sitotoksik etkisini tahmin etmek için enfeksiyon 7 gün hayatta hücreleri (enfekte ve enfekte olmayan) toplam sayısı karşısında çizilmiştir. Yeşil noktalar Z-skoru&gt; -2 (önemli değil) tarafından WT Coxiella sapan fenotipleri temsil etmektedir. Pembe noktalar sitotoksik ph temsil-2 ve -4 (hafif fenotip) arasında bir Z-skoru enotypes. Kırmızı noktalar Z-skoru ≤ -4 (güçlü fenotipleri) ile sitotoksik fenotipleri temsil etmektedir. Oklar C (C) karşılık gelen küçük harf ile gösterilen mutantlar çoğaltma, içselleştirme ve sitotoksik fenotipleri Temsilcisi görüntüleri gösterir. Her durumda, konakçı hücre çekirdekleri kırmızı olan Coxiella koloniler yeşil içindedir. Ölçek, 50 mikron barlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Coxiella burnetii zoonotik hastalık Q ateşi sorumlu zorunlu hücre içi Gram-negatif bir bakteridir. Burada Coxiella flüoresan transpozon mutantlarının üretimi yanı sıra otomatik tanımlama ve elde edilen içselleştirme, çoğaltma ve sitotoksik fenotipleri analizi için yöntemleri tarif eder.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Bu prosedürün genel amacı, konak hücrelere giriş, bakteriyel replikatif niş oluşturma ve kalıcılık dahil olmak üzere enfeksiyon döngüsünün temel adımlarında rol oynayan COE faktörlerini geniş ölçekte tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle transposon mutajenezi yoluyla bir GF PT ko mutant kütüphanesi oluşturularak gerçekleştirilir.Ardından, konak hücreler izole edilen her bir mutant ile enfekte edilir. Daha sonra, Coxiella enfeksiyonu için en zararlı olan mutasyonları belirlemek amacıyla, her bir mutantın hücre içi replikasyonu bir mikroplaka okuyucu kullanılarak gerçek zamanlı olarak takip edilir. Son olarak, Coxiella ile enfekte edilmiş hücreler otomatik mikroskopi ile analiz edilir.Nihayetinde, otomatik görüntü analizi, her bir mutasyona uğramış genin Coxiella enfeksiyon döngüsündeki olası bir işleve ilişkilendirilmesi için elde edilen her fenotipin morfolojik karakterizasyonuna olanak tanır. Bu yöntem, belirli bir patojenin tüm hücreyle etkileşime girmesi ve hücrenin moleküler mekanizmalarını kendi lehine kullanması için gerekli olan temel genlerin geniş ölçekli tanımlanması gibi, konakçı-patojen etkileşimleri alanındaki temel sorunların çözülmesine yardımcı olabilir. COE kolonilerinin ekimi ve izolasyonunun gerçekleştirilmesinin zor olması nedeniyle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.Nitekim, COE çok küçük koloniler oluşturur ve bunların yumuşak ACCM agar üzerinden dikkatle ekstrakte edilmesi gerekir. Bu yöntem, koksal laboratuvar enfeksiyonu hakkında içgörü sağlayabilir. Ayrıca salmonella, brucella, mycobacterium ve benzeri diğer hücre içi patojenik bakterilere de uygulanabilir.Yazılı protokole uygun olarak yetkin coxiella'yı transpozon ve transpozaz kaplı plazmidlerle transforme ettikten sonra, bireysel mutantları izole etmek için, bir mikrobiyal güvenlik kabini veya MSC içinde 10 mililitre eritilmiş %0,5 agar ile 10 mililitre iki X accm iki'yi karıştırarak alt agarları hazırlayın ve uygun antibiyotikleri ekleyin; hemen bir Petri kabına dökün, kapağı açık şekilde 30 dakika boyunca soğumaya bırakın ve ardından 20 dakika boyunca havada kurutun. Üst agar hazırlamak için, 15 mililitrelik bir polistiren tüp içinde 1,25 mililitre iki x accm iki'yi 0,75 mililitre su ile karıştırın. Uygun antibiyotikleri ekleyin ve 37 °C'de inkübe edin.Ardından 1 ila 100 µL bakteri kültürü ekleyin ve beş saniye boyunca vorteksleyin. Sonra, 0,5 mL eritilmiş aros karışımı ekleyin ve derhal alt aros tabakasının üzerine dökün. Plakanın 20 dakika boyunca soğumasını bekleyin.Katılaşmaya yardımcı olmak için kapağı kapatın ve 20 dakika boyunca 4 °C'de inkübe edin. Ardından kapağı çıkarın ve plakayı 20 dakika boyunca havada kurutun; sonrasında plakayı %5 karbondioksit ve %2,5 oksijen içeren, 37 °C'lik nemlendirilmiş bir inkübatöre aktararak altı ila yedi gün bekletin. Koloniler tespit edilebilir hale geldiğinde, bir mililitrelik bir pipet ucunun ucunu keserek ve bunu tekil koloniler içeren plug'lar izole etmek için kullanarak kolonileri toplayın.Ardından bunları, 1,5 milliliters accm two içeren 24 kuyucuklu bir plakadaki kuyucuklara aktarın. Metin protokolüne uygun olarak bir standart eğri hazırladıktan sonra, her kuyucuğa beş microliters %10 Triton X 100 ekleyerek her bir bakteriyel süspansiyonu kantite edin. Siyah duvarlı ve tabanlı 96 kuyucuklu bir mikroplakada, her kuyucuğa 50 microliters bakteriyel süspansiyon ekleyin ve bir plak sarsıcıda 10 dakika boyunca inkübe edin.Oda sıcaklığında, çift zincirli DNA miktar tayini reaktifini 1:200 oranında seyreltmek için bir XTE tamponu kullanın ve her örneğe seyreltilmiş reaktiften 55 µL ekleyin. Bir plak çalkalayıcı ile donatılmış 96 kuyucuklu mikroplakada, oda sıcaklığında karanlıkta iki ila beş dakika inkübe etmeden önce iyice karıştırın; ardından standart floresein dalga boyları için filtreler içeren bir floresan mikroplaka okuyucu kullanarak örneklerin floresansını ölçün. Bakteriyel DNA konsantrasyon grafiğini elde etmek için, daha önce hazırlanmış standart eğrideki floresans okumalarını kullanın ve bakteriyel konsantrasyonu belirlemek için DNA konsantrasyonunu coxiella genom kütlesine bölün.Metin protokolüne uygun olarak tek primer koloni PCR ve DNA sekanslama işlemlerini gerçekleştirdikten sonra sonuçları mililitre başına genom eşdeğeri cinsinden ifade edin. Sekans analiz yazılımını kullanarak, Coxiella Burnett I 4 93 NM'nin tamamı açıklanmış genomunu referansla hizalama (align to reference) fonksiyonu ile yükleyin, sekans sonuçlarını blast N kullanarak yükleyip hizalayın ve transpozisyon bölgesini belirleyin. Metin protokolüne uygun olarak RPMI ortamında mililitre başına 10⁵ hücre içeren bir Vero hücresi süspansiyonu hazırladıktan sonra, süspansiyondan 100 µL'yi düz ve şeffaf tabanlı siyah 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna dağıtın, plakayı oda sıcaklığında 400 ×g'de beş dakika santrifüj edin ve 37 °C'de %5 karbon dioksit altında gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, oda sıcaklığında bekletilen ve Coxiella mutantlarını içeren 96 kuyucuklu plakları alın ve bakteri süspansiyonlarının 150 µL'sini, fenol kırmızısı ve FBS içermeyen RPMI içinde, derin kuyucuklu 96 kuyucuklu bir plakta 300 µL'ye seyreltin; ardından, Vero hücrelerindeki medyumu uzaklaştırın ve her kuyucuğa 100 µL seyreltilmiş Coxiella mutantı dağıtın. A1 kuyucuğunu negatif kontrol, A2 ve A3 kuyucuklarını ise pozitif kontrol olarak kullanın; aerosol sızdırmaz bir santrifüj plaka tutucu kullanarak plakayı oda sıcaklığında, 400 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, plakayı %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de iki saat boyunca inkübe ettikten sonra, bakteri içeren medyumu her kuyucuk için 100 µL taze komplet RPMI medyum ile değiştirin ve floresein filtrelerine sahip bir floresan mikroplaka okuyucu kullanın.Yedi gün boyunca her gün GFP floresansını ölçün. Enfeksiyon sonrası yedinci günde, plakadaki medyumun tamamını uzaklaştırın ve yerine, hücre geçirgen floresan boyanın 1:1000 seyreltmesini içeren taze komple medyumdan her kuyucuğa 50 µL ekleyin. Hücreleri 30 ila 60 dakika inkübe edin; inkübasyonun ardından medyumla, PBS içinde %4 PFA'dan her kuyucuğa 50 µL ekleyerek değiştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Ardından, kuyucukları PBS ile üç kez yıkamadan önce PFA içeren tamponu uzaklaştırın. Son yıkama işleminin ardından, her kuyucuğa 50 µL bloklama solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.Ardından, bloklama solüsyonunu kuyuk başına 40 µL taze bloklama solüsyonu ve 1/500 dilüsyonundaki anti lamp one antikor ile değiştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ettikten sonra solüsyonu uzaklaştırın ve bir plaka yıkayıcı kullanarak kuyukları kuyuk başına 100 µL PBS uygulayarak beş kez yıkayın. Daha sonra kuyuk başına, uygun floresan ikincil antikor ve 5 µg/mL konsantrasyonunda hooked 3 3 2 5 8 içeren 40 µL bloklama solüsyonu ekleyin.Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Örnekleri beş kez yıkayın ve kurumasını önlemek için kuyucuklarda son PBS yıkama çözeltisini bırakın. Görüntüleme işlemini gerçekleştirmek için, 20 x objektif ile 3 4 88 5 55 ve altı 15 nanometre kanallarla donatılmış bir epi floresan otomatik mikroskop kullanın.Örnek başına minimum 5.000 hücreyi görüntülemek amacıyla kuyuk başına 21 bağımsız alan edinin. Konak hücre çekirdekleri kanalını referans alarak otomatik odaklama uygulayın. Son olarak, elde edilen görüntülerden ilgili bir dizi özelliği ekstrapole etmek için otomatik görüntü analizini kullanın.Bu şekil, 16 nokta ICM Coxe L genlerindeki mutantlar üzerinde 38 transpozonu göstermektedir; burada mutantların canlılığını değerlendiren büyüme eğrileri sunulmuştur. Epitel hücrelerle inkübe edilen Coxiella mutantları için oluşturulan hücre içi büyüme eğrileri, Coxiella genomundaki transpozon eklemeleriyle ilişkili fenotiplerin kantitatif analizini sağlar. Bu şekilde, konak hücre çekirdeklerini, hücre konturlarını, lizozomları ve Coxiella kolonilerini tanımlamak ve karakterize etmek için otomatik görüntüleme gerçekleştirilmiştir.Coxiella kolonilerinin hücreler ve lizozomlarla ilişkilendirilmesi, coxiella içeren vakuollerin morfolojik analizine olanak tanır. Coxiella kolonilerinin konak hücre konturlarıyla ilişkilendirilmesi ise enfekte hücrelerin morfolojik analizine olanak sağlar. Son olarak, dört kanal birleştirilir.Coxiella kolonilerinin ortalama alanı, Coxiella'nın hücre içi replikasyonunu ve/veya bakterilerin konak hücrelere girme kapasitesini etkileyen mutasyonları belirlemek amacıyla hücre başına düşen koloni sayısına karşı grafiğe dökülmüştür. Mutantlar üç kümede gözlemlenmiştir: Coxiella'nın hücre içi büyümesini etkileyen mutasyonlar, hücrelerde Coxiella internalizasyonunu etkileyen mutasyonlar ve anlamlı olmayan fenotipler. Burada, Coxiella'nın gelişimi sonrası ona sitotoksisite kazandıran mutasyonları belirlemek amacıyla, Coxiella kolonilerinin ortalama alanı, enfeksiyondan sağ kurtulan konak hücre sayısına karşı grafiğe dökülmüştür.Bu teknik, bakteriyel enfeksiyonlar alanındaki araştırmacıların konakçı-patojen etkileşimlerini geniş ölçekte keşfetmelerinin yolunu açmış ve enfeksiyon hastalıklarıyla mücadele edecek yeni tedavilerin geliştirilmesi için konakçı ve bakteriyel hedeflerin belirlenmesini sağlamıştır.

generation-multi-phenotypic-high-content-screening-coxiella-burnetii

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Sıvı tabanlı kültür ve dağıtımı için bir...

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem...

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

İleri genetik, moleküler düzeyde nasıl aydınlatmak için güçlü bir...

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

Hücre biyolojisinde temel bir arayış ökaryotik hücrelerin yapmak organellerin kimliği altında yatan mekanizmaları belirlemektir. Burada floresan mikroskobu ve yeni nesil dizileme araçlarını kullanarak bitki organel morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğü sorumlu genleri tanımlamak için bir yöntem öneriyoruz.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

Bu video, kültürlenmiş epitel hücreleri içinde GFP etiketli Coxiella mutantlarının hücre içi büyümesini değerlendirmek için bir yöntem göstermektedir. Mutant fenotip, immünoboyama ve epifloresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir ve mutasyonun hücre içi büyüme üzerindeki etkisinin incelenmesine izin verir.

Coxiella Mutantlarının Ökaryotik Hücrelerde Hücre İçi Büyümesinin Değerlendirilmesi

Enterobacter sp. YSU glukoz az tuz ortamında büyür. Oksotroflan rastgele bir konakçı genom içine kendisini ekleyen bir transposome ile dönüştürülmesiyle oluşturulur. Mutantlar minimal orta karmaşık ortamdan replika plaka tarafından bulundu. Kesilen gen, kurtarma ve dizileme ile tespit edilir.

Üretilmesi Enterobacter Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Stres direnci uzun ömürlü özelliklerinden biridir ve genetik yönetilmeye bilinmektedir. Burada, uzun ömürlü çalışmaları için fare modelleri geliştirmek için hangi ES hücreleri stres direnci kazandıran mutasyonlar taranması için tarafsız bir yüksek verimli bir yöntem geliştirdi.

İleri Genetik Yaklaşım Farelerde Stres Direnci Genler ortaya çıkarmak için - ES Hücrelerde bir Yüksek verim Ekranı

bakteriyel patojenler ve ev sahipleri arasındaki etkileşimleri araştıran biyolojik araştırmaların önemli bir alandır. Burada, Blam substrat kullanılarak siRNA gen susturma sırasında Coxiella burnetii'nin efektör translokasyonu ölçmek için gerekli teknikleri tarif eder.

Uygulanması Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) tarafından Efektör Translokasyon Verimliliği incelemek için<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; SiRNA susturma sırasında

Burada acemi protokollerde araştırmacılar için farmakolojik önemli bakteriyel cinsi Streptomycesfenotipleme başlatmak için mevcut.

Streptomyces gelişimsel mutantlar görsel ve mikroskobik değerlendirilmesi

Gram-negatif bakterilerde doymak üzere transpozon mutant kütüphaneleri oluşturmak ve daha sonra yüksek işlemli sıralama için DNA amplicon kütüphanelerinin hazırlanmasını tanımlayan bir yöntem. Örnek olarak, biz ESKAPE patojen, Acinetobacter baumanniiodaklanmak , ama bu protokol Gram-negatif organizmaların geniş bir yelpazede için münasip olduğunu.

Yüksek İşlem Likör Sıralaması Için Gram-Negatif Bakterilerde Transposon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma

Öğrenin, Coxiella burnetii transposon mutantlarının üretimi ve çok fenotipik yüksek içerikli taraması için otomatik mikroskopi ve gerçek zamanlı izleme yöntemlerini. Bu teknik, patojen enfeksiyon döngüsündeki temel genleri belirlemeye yardımcı olur.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme

Daha fazla video keşfet