Gleichzeitig Ex vivo Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von In vivo Elektroretinogramm-System

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Funktion von Zellen aus einer isolierten Mausnetzhaut unter Verwendung eines kommerziellen in vivo-, Elektroretinogramm- oder ERG-Systems zusammen mit einem ex vivo-Adapter zu beurteilen. Dazu wird zunächst die Netzhaut von beiden Augen einer Maus präpariert. Der zweite Schritt besteht darin, die Photorezeptorseite der Netzhaut mit der Seite nach oben in einen Probenhalter zu montieren.

Anschließend wird der Probenhalter auf eine Heizplatte im in vivo ERG-System gelegt und mit der schwerkraftgesteuerten Perfusion verbunden. Der letzte Schritt besteht darin, die Elektroden des Probenhalters an einen Verstärker anzuschließen und die Netzhaut mit Licht zu stimulieren, um ERG-Antworten zu erhalten. Letztendlich wird die ex vivo ERG verwendet, um zu zeigen, wie Stäbchen- und Zapfen-vermittelte Signalwege mithilfe von Pharmakologie und speziellen Lichtstimulationsprotokollen seziert werden können.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden, wie z. B. in vivo, ERGs oder Einzelzellaufzeichnungen, besteht darin, dass sie ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis, längere und stabilere Aufzeichnungen sowie die Möglichkeit für einfache und quantitative pharmakologische Manipulationen bietet. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um die Wirksamkeit und Sicherheit von Medikamenten zur Behandlung von Netzhauterkrankungen bei Primaten und menschlichen Spendernetzhäuten zu überprüfen. Ändern Sie mindestens einen Tag im Voraus den unteren Teil des Probenhalters, indem Sie etwas schwarzgraues Filterpapier auf die Oberseite der Kuppeln kleben. Verwenden Sie zwei Komponenten Fünf-Minuten-Epoxidharz entlang der Ränder der Kuppeln und verwenden Sie bei Bedarf ein Seziermikroskop. Nachdem der Kleber getrocknet ist, drücken Sie das Filterpapier flach auf die Kuppel.

Es wird für etwa einen Monat der Aufnahme reichen. Entfernen Sie dann das Papier und reinigen Sie die Kuppel mit 70% Ethanol. Um nun zuerst die Elektrode vorzubereiten, füllen Sie die Elektrodenkanäle mit Elektrodenlösung.

Versuchen Sie, das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden. Schrauben Sie dann Pelletelektroden in die Elektrodenkanäle. Verbinden Sie das Ober- und Unterteil des Probenhalters mit vier Schrauben und füllen Sie die Perfusionsleitungen mit Elektrodenlösung.

Messen Sie als Nächstes den Widerstand und die Spannung zwischen den Leitungen der Elektrodenpaare. Der Widerstand sollte unter 100 Kiloohm und die Spannung unter 10 Millivolt liegen. Wenn die Kanäle blasenfrei und die Elektroden in gutem Zustand sind, gießen Sie nun 400 bis 700 Milliliter Perfusionsmedium in eine Glasflasche für die Probenperfusion

Gießen Sie außerdem 300 Milliliter für die Dissektion aus und bewahren Sie es im Kühlschrank auf. Führen Sie dann den Perfusionsschlauch durch den Wärmetauscherblock und legen Sie den vorgewärmten Block auf die Heizplatte. Umschließen Sie nun die Flasche mit einem Verschluss, der einen Gaseinlass und einen Einlass für den Perfusionsschlauch hat.

Der Gaseinlass sollte an einem Ausströmer befestigt werden. Stellen Sie die vorgewärmte Flasche an einen Ort, an dem das Perfusionsmedium bei 37 Grad Celsius gehalten wird. Bereiten Sie dann die Perfusionslinien vor, indem Sie sie mit Perfusionsmedien füllen, um die durch die Schwerkraft angetriebene Strömung in einem Ocus-Wissenschaftssystem zu initiieren.

Platzieren Sie die Flasche in den Faradayschen Käfig, um das Geräuschpegel zu minimieren, und verwenden Sie lange Perfusionsausgangsleitungen vom Probenhalter. Weit unterhalb des Niveaus des Probenhalters und der Perfusionsflasche positioniert, schirmen diese Ausgangsleitungen ab und verbinden die Abschirmung durch den Faradayschen Käfig mit der Masse des Verstärkers. Um eine Kopplung des elektromagnetischen Rauschens an das ERG-Signal zu verhindern, befestigen Sie den Temperaturfühler an der Heizstufe.

Stellen Sie nun mit Hilfe von Reglern den Lösungsfluss auf drei bis fünf Milliliter pro Minute ein. Geben Sie schließlich bei Bedarf Auto und Gas in die Lösung und stellen Sie den Regler so ein, dass ein stetiger Strom von Blasen aus dem Ausströmen entsteht. Beginnen Sie damit, etwa 200 Milliliter Kaltperfusionslösung in eine große Petrischale zu gießen, so dass der gesamte untere Teil des Probenhalters vollständig eingetaucht werden kann.

Euthanasieren Sie ein Tier, das unter einem 12-, 12-stündigen Dunkellichtzyklus aufgezogen wurde und dann sechs bis 12 Stunden vor den Aufnahmen an die Dunkelheit angepasst wurde. Alle folgenden Verfahren müssen unter schwachem rotem oder infrarotem Licht durchgeführt werden. Nachdem Sie jedes Auge isoliert haben, legen Sie es in das Augenmedium.

Übertragen Sie dann ein Auge auf ein kleines Stück Filterpapier auf dem Papier. Fasse ihn mit einer Pinzette an und schneide einen Schlitz hinein, der ungefähr auf der gleichen Höhe wie die Aura-Serrata aus dem Schlitz ist. Schneiden Sie entlang der Aura Serrata oder näher am Äquator, um die Hornhaut und die Linse zu entfernen.

Entfernen Sie dann die Hornhaut und die Linsenenden und übertragen Sie die Augenmuschel wieder auf das kalte Medium. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang mit dem anderen Auge. Arbeiten Sie nun mit einer Augenmuschel und machen Sie einen kleinen Schnitt von oben in Richtung des Sehnervs.

Halten Sie die Schere zwischen Netzhaut und Sklera, damit die Netzhaut so intakt wie möglich bleibt. Fassen Sie als Nächstes die Sklera auf beiden Seiten des Schnitts mit zwei Pinzetten und ziehen Sie das Gewebe auseinander, um die Netzhaut zu lösen. Um die Netzhaut zu isolieren, durchtrennen Sie den Sehnerv und entfernen Sie die Netzhaut mit minimalem Kontakt zu ihrer distalen Oberfläche.

Montieren Sie nun die isolierten Netzhäute auf den Kuppeln des Probenhalters. Tauchen Sie zunächst den unteren Teil des Probenhalters mit den präparierten Netzhäuten in die Petrischale. Nächste Folie.

Der Photorezeptor der Netzhaut oder die konvexe Seite nach oben über der Kuppel. Heben Sie dann den Probenhalter vorsichtig an, so dass die Netzhaut am Filterpapier ansetzt. Wiederholen Sie dann den Vorgang für die andere Netzhaut.

Trocknen Sie nun die Halterplatte vorsichtig ab, um Übersprechgeräusche und Signalverschiebungen zu vermeiden. Schrauben Sie nach dem Trocknen des Halters den oberen Teil auf und füllen Sie die Perfusionskanäle mit einer Nadel mit Perfusionslösung aus einer Spritze. Platzieren Sie den Probenhalter neben dem Wärmetauscherblock.

Verbinden Sie dann die Eingangs- und Ausgangsperfusionsleitungen. Schließen Sie die Einrichtung ab, indem Sie die Elektroden an den ERG-Verstärker anschließen und die Stimulator-Steuereinheit am Probenhalter anbringen. Verwendung eines Adapters Um große und wiederverwendbare Reaktionen zu erhalten, ist es wichtig, die Netzhaut sorgfältig zu dissektionieren und zu befestigen sowie eine stabile und blasenfreie Perfusion über den Netzhäuten aufrechtzuerhalten, bevor Daten gesammelt werden.

Warten Sie 10 bis 20 Minuten, damit die Temperatur und Funktion der Netzhaut die Blitzreaktionen stabilisieren und von dunkel angepassten Wildtyp C 57 schwarz sechs Netzhäuten unter Verwendung verschiedener Standard-Profusion-Lösungen aufgezeichnet wurden. Die Wellenformen und die Kinetik der Reaktion schienen in Ames-Medien und in Locks-Medien ähnlich zu sein. Die Empfindlichkeit der Photorezeptoren der Stäbchen war ebenfalls ähnlich.

Auf der anderen Seite waren die Amplituden in gepufferter Ringerlösung ohne Bikarbonat- oder Carbogen-Reaktion signifikant kleiner. Auch die BWA-Stabilität wurde im Heap-Ringer oft beeinträchtigt. Durch die Zugabe von 40 Mikromolaren A PB wurde die positive B-Welle effizient entfernt.

Dabei zeigte sich eine große, langsame negative Welle, die auf die Aktivität der Mueller-Zellen zurückgeführt wurde, wobei 100 Mikromolar Barium abgeschafft. Diese Komponente zeigt die Photorezeptorantwort des ex vivo ERG-Signals. Diese Methode kann mit anderen Instrumenten wie Pharmakologie und Genetik kombiniert werden, um Fragen zu den molekularen Mechanismen der retinalen Signalübertragung und Erblindungskrankheiten bei Säugetieren, einschließlich menschlicher Netzhaut, zu beantworten.