Name: Gleichzeitig Ex vivo Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von In vivo Elektroretinogramm-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Erfahren Sie die Ex-vivo-ERG-Methode zur Funktionsprüfung isolierter Mäusenetz-häute. Diese Technik ermöglicht die Analyse von Stäbchen- und Zapfen-Signalwegen mittels Pharmakologie und Lichtstimulation für die Netzhautforschung.

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Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse EY019312 und EY021126 (VJK), EY002687 an die Augenklinik und Visual Sciences an der Washington University unterstützt und von der Forschung zur Verhütung Blindheit.

Alle Versuchsprotokolle wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Institutional Animal Studies Committee an der Washington Universität zugelassen. 1. Einrichten der Perfusion und Probenständer <ol><li> Bereiten Lösung für Netzhautblutung frisch am Tag des Experiments. Verwenden Sie destilliertes und deionisiertes Wasser. Verwenden Sie eine der folgenden drei Lösungen. <ol><li> Bereiten bicarbonathaltige Ames-Lösung (1 l): 1 Flasche Ames &#39;Medien und 1,9 g NaHCO 3, </li><li> Vorbereitung Locke-Lösung (in mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1,2 CaCl 2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO 3, 3,0 Na-Succinat, 0,5 Na Glutamat, 0,02 EDTA und 10,0 Glucose, 0,1% MEM-Vitamine und Aminosäuren Säuren </li><li> Vorbereitung HEPES-gepufferter Ringer-Lösung (in mM): 133,3 NaCl, 3,3 KCl, 2,0 MgCl 2, 1,0 CaCl 2, 10,0 Glucose, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHeingestellt auf 7,5 ~ 5,8 ml 1 M NaOH, fügen 0,72 g / L Kulturmedium Leibovitz L-15. Verwenden Sie 20 bis 50 &amp; mgr; M DL-AP4 und 50 bis 100 &amp; mgr; M BaCl 2, um den Photorezeptor Antwort mit jeder Perfusion Medien zu isolieren. </li></ol></li><li> Vorbereitung Lösung für Elektroden 28 (in mM): 140,0 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl 2, 1,2 CaCl 2, 3 HEPES, 0,01 EDTA und pH-Wert auf 7,4 bis 7,5 mit NaOH. Elektrodenlösung kann bei Raumtemperatur mehrere Monate gelagert werden. </li><li> Bereiten Sie und testen Sie den Probenhalter. <ol><li> Kleben Sie schwarz / grau Filterpapier auf der Oberseite der Kuppeln der untere Teil des Probenhalters (siehe Abbildung 1A). Verteilt zweikomponentigen 5 min Epoxidkleber vorsichtig um die Kanten der flachen Oberseiten der Dome. Wenn nötig, machen Sie es unter Dissektionsmikroskop. </li><li> Warten Sie, bis der Leim ist fast trocken (ca. 4 min) und drücken Sie die Filterpapier auf den Kuppeln unter Verwendung einer Flachs Artikel. Kleber Filterpapier mindestens einen Tag vor dem Experiment. DieFilterpapier kann mehrfach verwendet werden, sollten aber nach einem Monat der Aufnahmen ersetzt. Verwenden Sie 70% Ethanol zum Kuppeln sorgfältig von jedem Kleberrückstand reinigen vor der Installation der Ersatzpapier. </li><li> Füllen Sie die Elektrode Kanäle mit Elektrodenlösung versucht, alle Luftblasen zu vermeiden, und schrauben Pelletelektroden mit einem Gewindeadapter in die Elektrodenkanäle eingeschlossen (siehe 1A und B). Verbinden Sie die oberen und unteren Teile des Probenhalters mit vier Schrauben und füllen Sie die Perfusion Linien mit Elektrodenlösung. </li><li> Den Widerstand und die Spannung zwischen den Leitungen jedes Elektrodenpaar mit einem Multimeter (1B). Widerstand sollte unter 100 &amp; omega; k und die Spannung unter 10 mV, wenn die Kanäle sind blasenfrei und die Elektroden in einem guten Zustand sind sein. </li></ol></li><li> Gießen Sie 400-700 ml Perfusion Medien in der Glasflasche. Getrennte und weitere 300 ml in der Präparation der Netzhaut und s verwendet werdenriss es in einem Kühlschrank. Stellen Sie den Infusionsschlauch in den Wärmetauscher-Block und setzen Sie den vorgeheizten Block auf der Heizplatte (siehe Abbildung 1D). </li><li> Schließen Sie die Flasche mit einer Kappe, die hat Verbindungen zu 2 / O 2 Gas Co (wenn Ames &#39;oder Lockes verwendet wird) und für Infusionsschlauch (siehe Abbildung 1D). Heizen Sie die Flasche mit den Medien, um 37 o C und auf der Heizplatte oder auf der Oberseite des Lichtstimulationseinheit in einem Wasserbad auf 37 festgelegt - 39 o C 17. <ol><li> Prime die Perfusion Linien durch Perfusion mit Medium füllen sie das schwerkraftgetriebenen Strömung zu initiieren. <ol><li> Im LKC-System, stellen Sie die Flasche auf der Oberseite des Stimulators Einheit 17, um eine signifikante Gravitationsfluss, wird dann durch Durchflussregler, ohne durch die Senkung Ebene der Perfusionslösung in der Flasche während des Experiments beeinflusst angepasst werden. </li><li> In Ocuscience System, legen Sie die perfusion Flasche innerhalb des Faradayschen Käfigs, um das Rauschen zu minimieren und legen lange Perfusion Ausgangsleitungen von dem Probenhalter (siehe Schritt 2.8) und unterhalb des Niveaus des Probenhalters (und die Perfusion Flasche) zur Schwer Antrieb der Lösung zu erhöhen. Schirmen diese Ausgangsleitungen und die Abschirmung auf Masse des Verstärkers, um die Kopplung des elektromagnetischen Störungen auf das ERG-Signal zu vermeiden. </li></ol></li></ol></li><li> Stellen Sie die Durchblutung und zum 3 - 5 ml / min unter Verwendung von Durchflussreglern. Schließen Sie 5% CO 2/95% O 2 Gas aus einem Zylinder mit der richtigen Regler und stellen Sie die Durchflussrate zu stabilen Blasenbildung der Medien in der Flasche durch einen Luftstein zu gewährleisten. </li></ol> 2. Probenvorbereitung <ol><li> Montieren Sie sauber und scharf Dissektionsinstrumente einschließlich gerader Blattmikroschere, eine oder zwei 45 o Pinzette, Rasierklinge und ein rechteckiges Stück Filterpapier. </li><li> Pour etwa 200 ml kaltem Perfusion Lösung in eine große Petrischale, so dass der gesamte untere Teil des Probenhalters (einschließlich der Hauben) können in die Lösung eingetaucht werden. Dieser Schritt wird wichtig, wenn die Montage der Netzhaut auf den Kuppeln (siehe Schritt 2.6). Obwohl einige Lösungen wurden entwickelt, um mit Carbogen (5% CO 2/95% O 2) gesättigt werden, ist dies nicht wesentlich für die Zwecke Dissektion und war nicht in der hier beschriebenen Experimente durchgeführt. </li><li> Für ein typisches Experiment, halten Tiere in 12/12 Stunden hell / dunkel-Zyklus und dunkel passen sie für 6-12 Stunden vor den Aufnahmen. Euthanize das Tier durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte unter dim rotes Licht und alles tun, die folgenden Verfahren, in dim rot oder IR-Licht (Verwendung zB Rotfilter vor dem Mikroskoplichtquelle). <ol><li> Ziehen Sie die Augen, die von mit einer Pinzette und setzen Sie sie in den Medien. Platzieren Sie ein Auge in einer Zeit auf einem kleinen Stück Papier (zB einige regelmäßige Filterpapier) und machen soleuchtet etwa auf dem Niveau der Ora serrata, während das Auge mit einer Pinzette (dies ist außerhalb der Lösung hier getan) hält. </li></ol></li><li> Schneiden Sie entlang der Ora serrata (oder näher am Äquator des Auges) mit Mikroschere und entfernen Sie die Hornhaut und die Linse. Setzen Sie die Augenmuschel in der kalten Medien im großen Petrischale und wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Auge. </li><li> Schneiden Sie einen kleinen Schnitt von der Spitze der Augenmuschel zum Sehnerv hin, indem sie die Schere zwischen der Netzhaut und Lederhaut, um die Netzhaut so intakt wie möglich zu halten. Fassen Sie die Lederhaut von beiden Seiten des Einschnitts durch Verwendung von zwei Pinzetten und die Pinzette ziehen voneinander entfernt, um die Netzhaut zu lösen. <ol><li> Schneiden Sie den Sehnerv und versuchen, die Netzhaut mit einem Minimum an physischen Kontakt mit dem distalen Oberfläche zu isolieren. RPE wird meist automatisch lösen sich von der Netzhaut während der Präparation Prozess. Es ist wichtiger, um mechanische Störungen der Netzhaut, als die Vorform zu vermeidendissection schnell, in der Regel die Netzhaut kann mindestens 30 min in der Lösung inkubiert werden, ohne signifikante Auswirkungen auf die Antworteigenschaften. </li></ol></li><li> Montieren Sie die Netzhaut auf die Kuppeln des Probenhalters (Abbildung 1c). Tauchen Sie den unteren Teil des Probenhalters in der Petrischale mit den Netzhäute präpariert. Gleiten die Retina, Photorezeptorseite (die konvexe Oberfläche des isolierten Netzhaut) nach oben, oberhalb der Kuppel und heben Sie den Probenhalter, so dass der Netzhaut legt auf dem Filterpapier. Wiederholen Sie den Vorgang für die anderen Netzhaut. </li><li> Trocknen Sie die Halteplatte vorsichtig, um elektrische Übersprechen zwischen der Netzhaut sowie Rausch- und Signal Rangieren zu verhindern. Probenhalter ist mit O-Ringen um den unteren Teil Kuppeln verschüttet wird zwischen der unteren und oberen Teile des Halters zu verhindern als auch die elektrische Isolierung der Photorezeptor und die Ganglienzellseiten der einzelnen Netzhaut zu helfen. Befestigen Sie den oberen Teil der Halterung mit den vier Schrauben (siehe Abbildung 1B) und füllen Sie die Perfusion Kanäle mit Perfusionslösung unter Verwendung einer Spritze und eine Nadel. </li><li> Übertragen der Probenhalter neben dem Wärmetauscherblock und Verbinden der Eingangs- und Ausgangs Perfusionsleitungen zur Probenhalterung (Figur 1D). Die Elektroden an der ERG-Verstärker (oberen Elektroden zu verbinden, um den Boden / Minus-Pin in den Verstärker) und befestigen Sie den Stimulator / Steuereinheit auf dem Probenhalter, indem Sie einen Adapter oder schieben Sie das Heizkissen in den Stimulatoreinheit je nachdem, welche in vivo ERG System verwendet wird. </li></ol> 3. Recordings <ol><li> Konfigurieren Sie die Verstärker und Reiz von Einstellungen mithilfe von Software der in vivo-System. Stellen Sie den Akquisitionsfrequenz auf einen Wert zwischen 1 und 10 kHz und eine Tiefpaßfilterung bis 300 Hz. Verwenden Sie keine Hochpassfilterung. Verwenden Sie 60 Hz (oder 50 Hz in Europa) Notch-Filter, falls erforderlich. </li><li> Nehmen Sie Grundlinie ohne Lichtstimulation und Witzh dim Stimulation (z. B. grünes Licht von -35 dB oder 0,3 mCd sm -2), die für eine gute elektrische Verbindung zwischen den Elektroden und der Netzhaut Probe zu testen. Warten Sie 10 bis 20 Minuten vor dem Beginn der Datenerfassung, so dass Netzhauttemperatur und Funktion zu erreichen einen stabilen Zustand. <ol><li> Wählen Reizparameter nach einem bestimmten Experiment und starten Sie die Datenerfassung. ZB verwenden grünes Licht von -40 bis 0 dB oder 0,1 bis zu 1.000 mCd sm -2 für eine scotopic Reaktion Familie. Verwenden Sie etwa 2 bis 3 log-Einheiten heller Blitze in photopischen Aufzeichnungen, wo Stangen müssen von Hintergrundlicht unterdrückt werden (3-30 Cdm -2) oder eine Sonde Flash (etwa 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, siehe Abbildung 3). </li><li> Beachten Sie jedoch, dass die exakte Lichtintensitätswerte könnten etwas abhängig von Ihrem System-Kalibrierung und experimentellen Bedingungen sein. Als Faustregel gilt, Stufenstärken aufgeschlüsselt nach 5-10-fache im Vergleich zu in vivo </em&gt; Aufnahmen bei der Verwendung von grünem Licht 17. Eine schwarze Abdeckung mit Öffnungen oberhalb der Netzhaut (im Gewerbeadaptersystem im Lieferumfang enthalten) kann verwendet werden, um die Lichtstreuung in den Probenhalter zu reduzieren und eine homogene und gleich Stimulation beider Netzhäute von der Ganzfeld Sphäre der kommerziellen in vivo Systeme werden. HINWEIS: Bei sich von dunkeladaptierten Retina, die Intensitäten der Testwallungen bei einem typischen Experiment Bleich nur ein vernachlässigbarer Anteil des Pigments verwendet wird, so dass das Fehlen von RPE getriebenen Regeneration kein Thema ist. Darüber hinaus hat es sich bereits gezeigt, dass Konus Pigment Regeneration noch Platz in der isolierten Netzhaut über den Müller Zelle visuellen Zyklus 20 zu nehmen. </li></ol></li><li> Wie Versuche dauern typischerweise 30 min bis zu mehreren Stunden, überwacht die Basisliniendrift, Geräuschpegel und Reaktionsstabilität während des Versuchs als Änderungen könnten diese technischen Probleme anzugeben. HINWEIS: Erhöhter Schall oder Abnahmed Antwortamplituden kann darauf hindeuten, Luftblasen in den Perfusion oder Elektrodenkanäle, zu niedrige oder hohe Temperatur, Lösung Leck / Spill oder Verschiebung der Netzhaut. </li></ol> 4. Reinigung <ol><li> Nehmen Sie den Probenhalter aus den Perfusion Linien, öffnen Sie sie und spülen Sie die Netzhaut von dem Filterpapier. Entfernen Sie die Elektroden und spülen Sie sie mit destilliertem Wasser (nicht mit Ethanol). Reinigen Sie den Probenhalter (einschließlich der Perfusions-Kanäle) mit Ethanol und / oder destilliertes Wasser. Flush Infusionsschlauch vorsichtig mit&gt; 70% Ethanol. </li><li> Spülen Sie die Durchblutung Flasche mit destilliertem Wasser (keine Reinigungsmittel). Ethanol kann auch verwendet werden, um die Flasche zu reinigen. </li></ol>

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</ol>

Washington University in St. Louis hat einen Lizenzvertrag mit Xenotec, Inc. und können eine Lizenzgebühren aus dem Verkauf der ex vivo-Adapter zu erhalten.

<html> Wir zeigen hier die entscheidenden Schritte zur gleichzeitigen Gewinnung hochwertiger ex vivo ERG Aufnahmen aus zwei isolierten Maus Netzhaut durch die Verwendung in vivo ERG Systemkomponenten zusammen mit einem Ex-vivo-ERG-Adapter. In dieser Studie haben wir die beiden perfundiert Retinae von dem Tier mit der gleichen Lösung (entweder Ames, Locke oder Ringer), aber es ist auch möglich, jeden Netzhaut mit einer anderen Lösung, zB perfundieren, Drogentestzwecke. Die wichtigsten S...

Elektroretinogramm (ERG) ist eine gut etablierte Technik, die verwendet werden können, um die elektrische Aktivität der Netzhaut durch Licht ausgelöst aufzuzeichnen. Die ERG-Signal wird hauptsächlich durch Spannungsänderungen durch radiale Ströme verursacht (entlang der Achse der Photorezeptoren und bipolare Zellen) in der Widerstands Extrazellularraum der Retina fließenden Strom erzeugt wird. Das erste Signal ERG wurde 1865 von Holmgren von der Oberfläche eines Fischauge 1 aufgezeichnet. Einthoven und Jolly 1908 2 unterteilt den ERG Reaktion auf das Auftreten von Licht in drei verschiedenen Wellen, a- genannt, B- und C-Wellen, die jetzt bekannt sind, um im Wesentlichen die Aktivität von Photorezeptoren widerspiegeln, ON bipolaren Zellen und Pigmentepithel Zellen, die jeweils 3-8. ERG aus den Augen der narkotisierten Tieren oder Menschen (in vivo) mit Mikroelektroden aufgezeichnet werden, aus isolierten Augen Vorbereitung 9, in isolierten intakten Netzhaut (ex vivo) 3,10-15 oder über bestimmte Netzhautschichten (lokaleERG) 4,16. Von diesen ist die in vivo ERG derzeit die am häufigsten verwendete Methode, um die Funktion der Retina zu bewerten. Es ist eine nicht-invasive Technik, die für diagnostische Zwecke verwendet werden kann oder um das Fortschreiten von Netzhauterkrankungen bei Tieren oder Patienten zu folgen. , In-vivo-ERG-Aufnahmen erzeugen jedoch eine komplizierte Signal mit mehreren überlappenden Komponenten, die oft von äußeren Augen physiologische Geräusche (zB Atmung und Herztätigkeit) kontaminiert. Lokale ERG kann verwendet werden, um das Signal über bestimmte Schichten der Netzhaut aufzuzeichnen, aber es ist die invasive und hat die niedrigste Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Vergleich zu den anderen ERG Aufzeichnungskonfigurationen. Lokale ERG ist auch technisch anspruchsvoll und erfordert teure Ausrüstung (zB Mikroskop und Mikromanipulatoren). Transretinal ERG von der intakten, isolierten Netzhaut (ex vivo ERG) bietet einen Kompromiss zwischen in vivo und lokale ERG Methoden, die stabil und high SNR Aufnahmen von intakter Netzhaut von Tieren oder Menschen 17. Vor kurzem wurde diese Methode erfolgreich eingesetzt, um Stäbchen und Zapfen Photorezeptorfunktion in Säugetieren, Primaten und menschliche Netzhaut 18-20 studieren. Darüber hinaus aufgrund der Abwesenheit von Pigment-Epithel in der ex vivo Retina, die positive C-Wellenkomponente des ERG-Signal entfernt wird und ein bekannter negativer langsamen PIII-Komponente ist in den ex vivo-Aufnahmen zeigte. Die langsame Komponente PIII wurde gezeigt, dass aus den von Müller Gliazellen in der Retina 21-23 stammen. Somit könnte ex vivo ERG Verfahren auch verwendet werden, um Müller-Zellen im intakten Netzhaut zu untersuchen. Mehrere Studien haben auch gezeigt, dass ex vivo ERG-Aufnahmen verwendet werden könnten, um die Konzentration von pharmakologischen Mitteln auf der Netzhaut 24 zu messen und testen Sie die Sicherheit und Wirksamkeit von Arzneimitteln 25-27 werden. Mehrere Handels in vivo-Systemen zur Verfügung stehen undin vielen Laboratorien, die nicht unbedingt über umfangreiche Elektrophysiologie Hintergrund verwendet. Im Gegensatz dazu wurden ex vivo-Geräte nicht bis vor kurzem 17 und als Folge nur wenige Labors werden derzeit nutzen diese leistungsfähige Technik zur Verfügung. Es wäre von Vorteil, um unser Wissen über Netzhaut Physiologie und Pathologie voranzubringen und neue Therapien für Krankheiten zu entwickeln blend ex vivo ERG-Aufnahmen zur Verfügung, um weitere Labors zu machen. Wir zeigen hier eine einfache und erschwingliche ex vivo ERG Vorrichtung 17 und zeigen, wie sie in Verbindung mit mehreren im Handel erhältlichen in vivo ERG-Systeme verwendet werden, um Stab- und Kegel-vermittelten Signal aufzuzeichnen (a- und b-Wellen) und die Funktion Müller-Zellen (langsam PIII) aus intakten Wildtyp-Maus Netzhaut.

<table><tbody><tr><td>In vivo ERG-System</td><td>OcuScience</td><td>HMsERG</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/id77.html">www.ocuscience.us/id77.html</a></td></tr><tr><td>In vivo ERG-System</td><td>LKC Technologies</td><td>UTAS-E 3000</td><td><a href="http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html">www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html</a></td></tr><tr><td>Ex vivo Adapter</td><td>OcuScience</td><td>Ex VIVO ERG adapter</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/id107.html">www.ocuscience.us/id107.html</a>Dissektionsmikroskop</td></tr> <tr><td></td><td>North Central Instruments</td><td>Leica M80</td><td><a href="http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp; idCategory=27">Kann jede Marke</a></td></tr><tr><td>IR-Emitter</td><td>Opto Diode Corp. verwenden.</td><td>OD-50L</td><td><a href="http://www.optodiode.com/">www.optodiode.com</a></td></tr><tr><td>Prowler Nachtsichtgeräte</td><td>B.E. Meyers Electro Optics</td><td>D4300-I</td><td>Produkt in Militärqualität.</td></tr><tr><td>Rotfilter</td><td>Rosco Laboratories</td><td>Roscolux #27 Medium Rot</td><td>Kann anstelle des IR-Systems verwendet werden</td></tr><tr><td>Roter Scheinwerfer</td><td>OcuScience</td><td>ERGX011</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html">www.ocuscience.us/catalog/i29.html</a></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>WPI, Inc.</td><td>500086</td><td><a href="http://www.wpiinc.com/">www.wpiinc.com/</a></td></tr><tr><td>Dumont Pinzette #5</td><td>WPI, Inc.</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Wissenschaften 72000</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com</a></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Metler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Kann jede Marke verwenden</a>pH-Messgerät</td></tr> <tr><td>und Elektrode</td><td>Beckman Coulter</td><td>pHI 350</td><td>Kann jede Marke verwenden</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653<</td><td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Kann jede Marke verwenden</a></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60129</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Kann jede Marke verwenden</a></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63020</td><td>1.0 M Lösung</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>1.0 M Lösung</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td>Kann jede Marke</td></tr><tr><td>verwenden HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Kann jede Marke</td></tr> verwenden <tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>Kann jede Marke</td></tr><tr><td>verwenden Ames Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td>Kann jede Marke</td></tr><tr><td>verwenden BaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0750</td><td>Kann verwenden jede Marke</td></tr><tr><td>DL-AP4</td><td>Tocris Bioscience</td><td>101</td><td>Kann jede Marke</td></tr> verwenden <tr><td>Bernsteinsäure Dinatriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224731</td><td>Kann jede Marke</td></tr><tr><td>verwenden L-Glutaminsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2834</td><td>Kann jede Marke</td></tr><tr><td>verwenden D-(+)-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>Kann jede Marke</td></tr><tr><td>verwenden Leibovitz Kulturmedium L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td>Kann jede Marke verwenden</td></tr><tr><td>MEM-Vitamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminosäuren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN3156</td><td>5% CO2</td></tr></tbody></table>

gleichzeitig<em&gt; ex vivo</em&gt; funktionsprüfung von zwei netzhäute von<em&gt; in vivo</em&gt; elektroretinogramm-system

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ein In-vivo-Elektroretinogramm (ERG)-Signal setzt sich aus mehreren überlappenden Komponenten zusammen, die von verschiedenen retinalen Zelltypen stammen, sowie aus Rauschen von extra-retinalen Quellen. Ex vivo ERG bietet eine effiziente Methode, um die Funktion von Netzhautzellen direkt aus einer intakten isolierten Netzhaut von Tieren oder Spenderaugen zu präparieren. Darüber hinaus kann ex vivo ERG verwendet werden, um die Wirksamkeit und Sicherheit potenzieller Therapeutika an Netzhautgewebe von Tieren oder Menschen zu testen. Wir zeigen hier, wie kommerziell erhältliche in vivo ERG-Systeme verwendet werden können, um ex vivo ERG-Aufzeichnungen von isolierten Mausnetzhäuten durchzuführen. Wir kombinieren die Lichtstimulations-, Elektronik- und Heizeinheiten eines Standard-In-vivo-Systems mit einem speziell entwickelten Probenhalter, einem schwerkraftgesteuerten Perfusionssystem und einer Abschirmung gegen elektromagnetisches Rauschen, um rauscharme Ex-vivo-ERG-Signale gleichzeitig von zwei Netzhäuten mit der im kommerziellen In-vivo-Markt enthaltenen Erfassungssoftware aufzuzeichnen Systeme. Darüber hinaus zeigen wir, wie diese Methode in Kombination mit pharmakologischen Behandlungen eingesetzt werden kann, bei denen bestimmte ERG-Komponenten entfernt werden, um die Funktion bestimmter retinaler Zelltypen zu entschlüsseln.

Wir nahmen Flash Antworten von dunkeladaptierten Wildtyp (WT) C57BL / 6-Maus Netzhaut, indem Sie die oben beschriebenen und durch die Verwendung verschiedener Standard Perfusionslösungen (Abbildung 2) in Abbildung 1 veranschaulicht experimentelle Protokolle. Die Antwortwellenformen und Kinetik sowie Empfindlichkeit der Stäbchen-Photorezeptoren erschien ähnlich in Ames &#39;und Lockes Medien (2A und B). Auf der anderen Seite, unter HEPES gepufferte Ringe...

Ex vivo ERG kann verwendet werden, um die elektrische Aktivität von Netzhautzellen direkt von isolierten intakten Netzhäuten von Tieren oder Menschen aufzuzeichnen. Wir zeigen hier, wie gängige in vivo ERG-Systeme für ex vivo ERG-Aufzeichnungen adaptiert werden können, um die elektrische Aktivität von Netzhautzellen zu zerlegen.

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Funktion von Zellen aus einer isolierten Mausretina mithilfe eines kommerziellen In-vivo-Elektroretinogramm- oder ERG-Systems in Kombination mit einem Ex-vivo-Adapter zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst die Netzhäute aus beiden Augen einer Maus präpariert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Netzhäute mit der Photorezeptorseite nach oben in einen Probenträger einzusetzen.Anschließend wird der Probenträger auf eine Heizplatte im in-vivo-ERG-System gestellt und mit der gravitationsgesteuerten Perfusion verbunden. Der letzte Schritt besteht darin, die Elektroden des Probenträgers mit einem Verstärker zu verbinden und die Netzhäute mit Licht zu stimulieren, um ERG-Antworten zu erhalten. Letztendlich dient das ex-vivo-ERG dazu zu zeigen, wie sich die von Stäbchen und Zapfen vermittelten Signalwege mithilfe von Pharmakologie und speziellen Lichtstimulationsprotokollen aufgliedern lassen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden, wie in vivo-ERGs oder Einzelzell-Ableitungen, liegt darin, dass sie eine höhere Signal-Rausch-Relation sowie längere und stabilere Ableitungen ermöglicht und zudem eine einfache und quantitative pharmakologische Beeinflussung erlaubt. Außerdem kann diese Methode verwendet werden, um die Wirksamkeit und Sicherheit von Wirkstoffen, die zur Behandlung von Netzhauterkrankungen an primaten- und humanen Spender-Netzhäuten entwickelt wurden, zu untersuchen. Mindestens einen Tag im Voraus modifizieren Sie den unteren Teil des Präparathalters, indem Sie ein schwarzes graues Filterpapier auf die Oberseite der Kuppeln kleben. Verwenden Sie entlang der Kanten der Kuppeln einen zweikomponentigen Fünf-Minuten-Kleber und gegebenenfalls ein Zerlegungsmikroskop. Nachdem der Kleber getrocknet ist, drücken Sie das Filterpapier flach auf die Kuppel. Es ist für etwa einen Monat Aufzeichnung geeignet. Danach entfernen Sie das Papier und reinigen die Kuppel mit 70 % Ethanol. Füllen Sie nun zunächst die Elektrodenkanäle mit Elektrolytlösung, um die Elektrode vorzubereiten.Vermeiden Sie es, Luftblasen einzuführen. Schrauben Sie dann die Pelletelektroden in die Elektrodenkanäle ein. Verbinden Sie die obere und untere Hälfte des Probenträgers mit vier Schrauben und füllen Sie die Perfusionsleitungen mit Elektrolytlösung. Messen Sie anschließend den Widerstand und die Spannung zwischen den Leitungen der Elektrodenpaare. Der Widerstand sollte unter 100 Kiloohm und die Spannung unter 10 Millivolt liegen. Wenn die Kanäle blasenfrei sind und sich die Elektroden in gutem Zustand befinden, füllen Sie 400 bis 700 Milliliter Perfusionsmedium in eine Glasflasche für die Probenperfusion.Geben Sie außerdem 300 Milliliter für die Dissektion aus und lagern Sie sie im Kühlschrank. Führen Sie anschließend die Perfusionsleitung durch den Wärmetauscherblock und stellen Sie den vorgewärmten Block auf die Heizplatte. Verschließen Sie die Flasche nun mit einem Deckel, der einen Gaszulauf und einen Perfusionsleitungsanschluss aufweist.Der Gaszulauf sollte an einen Luftsstein angeschlossen werden. Stellen Sie die vorgewärmte Flasche dort auf, wo das Perfusionsmedium bei 37 Grad Celsius gehalten wird. Anschließend spülen Sie die Perfusionsleitungen, indem Sie diese mit Perfusionsmedium füllen, um den gravitationsgetriebenen Fluss in einem Ocus-Science-System zu initiieren.Stellen Sie die Flasche in die Faradaysche Käfig, um Störungen zu minimieren, und verwenden Sie lange Perfusionsausgangsleitungen vom Präparathalter. Positionieren Sie diese Ausgangsleitungen deutlich unterhalb des Niveaus des Präparathalters und der Perfusionsflasche, schirmen Sie sie ab und verbinden Sie die Abschirmung über den Faradayschen Käfig mit der Masse des Verstärkers. Um eine Kopplung elektromagnetischer Störungen in das ERG-Signal zu verhindern, befestigen Sie die Temperatursonde an der Heizplatte.Stellen Sie nun mithilfe der Regler den Lösungsdurchfluss auf drei bis fünf Milliliter pro Minute ein. Falls erforderlich, leiten Sie anschließend Luft und Gas in die Lösung ein und stellen den Regler so ein, dass eine gleichmäßige Blasenströmung vom Airstone ausgeht. Beginnen Sie damit, etwa 200 Milliliter kalte Perfusionslösung in eine große Petrischale zu geben, sodass der gesamte untere Teil des Präparathalters vollständig eingetaucht werden kann.Töten Sie ein Tier, das unter einem 12-Stunden-Licht-12-Stunden-Dunkel-Zyklus aufgezogen wurde und vor der Aufzeichnung sechs bis zwölf Stunden im Dunkeln adaptiert wurde. Alle folgenden Schritte müssen unter schwachem rotem Licht oder Infrarotlicht durchgeführt werden. Nach der Isolierung jedes Auges werden diese in das Augenmedium gegeben.Übertragen Sie dann ein Auge auf ein kleines Stück Filterpapier auf dem Papier. Halten Sie es mit einer Pinzette fest und schneiden Sie einen Schlitz in das Auge, der ungefähr auf Höhe der ora serrata vom Schlitz beginnt. Schneiden Sie entlang der ora serrata oder etwas näher zum Äquator, um die Hornhaut und die Linse zu entfernen.Entfernen Sie dann die Hornhaut und die Linsenenden und überführen Sie die Augenschale zurück in das kalte Medium. Wiederholen Sie denselben Vorgang mit dem anderen Auge. Arbeiten Sie nun mit einer Augenschale und führen Sie einen kleinen Schnitt von der Oberseite in Richtung zum Sehnerv durch.Halten Sie die Schere zwischen Netzhaut und Sklera, damit die Netzhaut so intakt wie möglich bleibt. Greifen Sie anschließend die Sklera auf beiden Seiten des Einschnitts mit zwei Pinzetten und ziehen Sie das Gewebe auseinander, um die Netzhaut zu lösen. Um die Netzhaut zu isolieren, durchtrennen Sie den Sehnerv und entfernen Sie die Netzhaut mit minimalem Kontakt zu ihrer distalen Oberfläche.Bringen Sie nun die isolierten Netzhäute auf den Kuppeln des Präparathalters an. Tauchen Sie zuerst den unteren Teil des Präparathalters in die Petrischale mit den präparierten Netzhäuten. Nächster Schritt.Die Netzhautphotorezeptoren oder die konvexe Seite nach oben über die Kuppel legen. Dann den Präparathalter vorsichtig anheben, sodass die Netzhaut an dem Filterpapier haftet. Danach den Vorgang für die andere Netzhaut wiederholen.Trocknen Sie die Halteplatte nun vorsichtig, um Übersprechen und Signalverlust zu vermeiden. Nach dem Trocknen schrauben Sie das obere Teil auf und füllen die Perfusionskanäle mit Perfusionslösung aus einer Spritze unter Verwendung einer Nadel. Stellen Sie den Probenträger neben den Wärmetauscherblock.Verbinden Sie anschließend die Ein- und Ausgangsperfusionsleitungen. Vervollständigen Sie den Aufbau, indem Sie die Elektroden mit dem ERG-Verstärker verbinden und die Stimulatorsteuereinheit am Probenträger befestigen. Mithilfe eines Adapters. Um große und wiederverwendbare Antworten zu erhalten, ist es wichtig, eine sorgfältige Dissektion und Montage der Netzhäute durchzuführen sowie eine stabile, blasenfreie Perfusionsflüssigkeit über den Netzhäuten aufrechtzuerhalten, bevor Daten gesammelt werden.Warten Sie 10 bis 20 Minuten, damit sich Temperatur und Funktion der Netzhaut stabilisieren. Lichtblitzantworten wurden von dunkeladaptierten Wildtyp-C57BlackSix-Netzhäuten mit verschiedenen Standard-Perfusionslösungen aufgezeichnet. Die Antwort-Wellenformen und -Kinetik zeigten sich in Ames-Medium und in Locke-Medium ähnlich. Auch die Empfindlichkeit der Stäbchenphotorezeptoren war vergleichbar.Andererseits waren die Amplituden in gehäufter Ringer-Lösung ohne Bicarbonat oder Carbogen-Zusatz deutlich geringer. Die BWA-Stabilität war ebenfalls häufig in der gehäuften Ringer-Lösung beeinträchtigt. Durch Zugabe von 40 Mikromolar A PB wurde die positive B-Welle effizient entfernt.Dadurch wurde eine große, langsame negative Welle sichtbar, die auf die Aktivität der Müller-Zellen zurückgeführt wird; die Zugabe von 100 µM Barium beseitigte diesen Bestandteil und machte so die Photorezeptorantwort im ex vivo-ERG-Signal sichtbar. Diese Methode kann mit anderen Werkzeugen wie der Pharmakologie und Genetik kombiniert werden, um Fragen zu den molekularen Mechanismen der Netzhautsignalisierung und zu erblindenden Erkrankungen in der Netzhaut von Säugetieren, einschließlich der menschlichen Netzhaut, zu beantworten.

simultaneous-ex-vivo-functional-testing-two-retinas-vivo

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Entwicklung der multifokalen Elektroretinogramm (mfERG) ist ein wichtiger Fortschritt in der Diagnose und Charakterisierung von Retinopathie. Multifocal Elektroretinogramme sind eine mathematische Durchschnitt der eine Annäherung an eine b-Welle. Software-Programme können daraus ERGs von mehr als hundert Netzhautstellen in ein paar Minuten pro Auge. Skotome und retinalen Dysfunktion kann abgebildet und quantifiziert werden.

Multifocal Elektroretinogramme

Wir beschreiben eine relativ einfache Methode der transretinal Elektroretinogramm (ERG) Aufnahmen für den Erhalt von Stäbchen und Zapfen Photomorphosen aus intakten Maus Netzhaut. Dieser Ansatz nutzt die Block der synaptischen Übertragung von Photorezeptoren ihre Lichtantworten isolieren und speichert sie über das Feld über den Elektroden isoliert flachen montiert Netzhaut zu liegen.

Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen

Dieser Artikel zeigt die Aufzeichnung der einzelnen Zellen aus fluoreszenzmarkierten neuronaler Populationen im intakten Maus Netzhaut. Durch die Verwendung von Zwei-Photonen-Anregung Infrarot transgenetically markierten Zellen wurden für Patch-Clamp-Aufzeichnung gezielt ihr Licht Antworten rezeptiven Feld Eigenschaften und Morphologie zu studieren.

Elektrophysiologische Charakterisierung von GFP-exprimierenden Zellpopulationen in der intakte Retina

Dieses Video zeigt, wie man das Elektroretinogramm (ERG) und das visuell evozierte Potenzial (VEP) bei einer bewussten Ratte aufzeichnet. Die Ratte wird zunächst mit chirurgisch implantierten Elektroden dunkeladaptiert. Nach dem Auftragen von dilatierenden Tropfen wird das Tier in eine Fesselung gelegt und in eine Ganzfeld-Schüssel gelegt. Anschließend werden die ERG- und VEP-Signale aufgezeichnet.

Aufnahme des Elektroretinogramms und des visuell evozierten Potentials bei einer Ratte

Das Elektroretinogramm (ERG) ist ein elektrisches Potential, das von der Netzhaut als Reaktion auf Licht erzeugt wird. In dieser Arbeit wird beschrieben, wie das ERG zur Beurteilung der Netzhautfunktion bei dunkeladaptierten Ratten verwendet werden kann und wie es zur Beurteilung einer neuroprotektiven Intervention, im vorliegenden Fall der ischämischen Fernpräkonditionierung, verwendet werden kann.

Verwenden der Funktion zur Elektroretinogramm im Nager Retina und die schützende Wirkung des Fern Limb ischämischen Präkonditionierung bewerten

Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige Messung von Elektroretinogramm und visuell evozierten Potentialen bei anästhesierten Ratten.

Gleichzeitige Aufnahme von Elektroretinographie und visuell evozierten Potentialen in narkotisierten Ratten

Hier stellen wir eine Methode zur Aufzeichnung lichtevokierter elektrischer Reaktionen des retinalen Pigmentepithels (RPE) bei Mäusen vor, die eine Technik verwendet, die als DC-ERGs bekannt ist und von Marmorstein, Peachey und Kollegen in den frühen 2000er Jahren beschrieben wurde.

Direktgekoppeltes Elektroretinogramm (DC-ERG) zur Aufzeichnung der lichtbeschworenen elektrischen Reaktionen des retinalen Pigmentepithels der Maus

Die Einhaltung internationaler Standards und die Aufrechterhaltung der retinalen dunklen Anpassung sind entscheidend, um gültige Vollfeld-Elektroretinogramm-Antworten bei der Diagnose und Behandlung von vererbten Netzhauterkrankungen zu erhalten. Ein praktisches Protokoll mit einer tragbaren Dunkelkammer wird zur Verfügung gestellt, um Einfeld-Elektroretinogramm für Säuglinge und Kinder unter Sedierung oder Vollnarkose im Operationssaal zu erhalten.

Electroretinogram Recording für Säuglinge und Kinder unter Anästhesie, um optimale dunkle Anpassung und internationale Standards zu erreichen

In-vivo-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Biologie in Gesundheit und Krankheit. Dieses Protokoll beschreibt die transpupille Bildgebung der Netzhaut der Maus mit einem Standard-Zwei-Photonen-Mikroskop. Es zeigt auch verschiedene In-vivoimaging-Methoden, um mehrere zelluläre Kohorten der Netzhaut fluoreszierend zu markieren.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

Die Modifikation bestehender Multielektroden-Array- oder Patch-Clamp-Geräte  macht das Ex-vivo-Elektroretinogramm breiter zugänglich. Verbesserte Methoden zur Aufzeichnung und Aufrechterhaltung von Ex-vivo-Lichtantworten erleichtern die Untersuchung der Photorezeptor- und ON-bipolaren Zellfunktion in der gesunden Netzhaut, Tiermodellen von Augenkrankheiten und menschlichen Spendernetzhaut.

Optimierung des Aufbaus und der Bedingungen für das Ex-vivo-Elektroretinogramm zur Untersuchung der Netzhautfunktion bei kleinen und großen Augen

Dieses Protokoll stellt und beschreibt Schritte zur Isolierung, Dissektion, Kultivierung und Färbung von Netzhautexplantaten, die aus einer erwachsenen Maus gewonnen wurden. Diese Methode ist als Ex-vivo-Modell für die Untersuchung verschiedener neurovaskulärer Netzhauterkrankungen wie der diabetischen Retinopathie von Vorteil.

Netzhautexplantat der adulten Mausnetzhaut als Ex-vivo-Modell zur Untersuchung neurovaskulärer Netzhauterkrankungen

Erfahren Sie die Ex-vivo-ERG-Methode zur Funktionsprüfung isolierter Mäusenetz-häute. Diese Technik ermöglicht die Analyse von Stäbchen- und Zapfen-Signalwegen mittels Pharmakologie und Lichtstimulation für die Netzhautforschung.

Gleichzeitig

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