Name: Iridium (III) Lumineszierende Sonde zum Nachweis von Malaria-Protein Biomarker Histidin Rich Protein-II (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Erfahren Sie die Synthese einer phosphoreszierenden Iridium-Sonde zur spezifischen Detektion des Malaria-Biomarkers Histidin-reiches Protein-II. Diese Methode ermöglicht robuste Lumineszenzdetektion in Lösung und auf festen Trägern.

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Unterstützung für diese Arbeit wurde von der Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop technologies that allow Assessment of multiple conditions and pathogens at point-of-care bereitgestellt. K.M.D. wurde durch ein NSF Graduate Research Fellowship (2012095464) unterstützt.

1. Synthese von Iridium (III) Complex <ol><li> Man wiegt 53,6 mg (50 umol) [Ir (ppy) 2 Cl] 2 und in 5 ml Methylenchlorid zu lösen. Fügen Sie diese Lösung auf eine 50 ml-Erlenmeyerkolben mit einem Rührstab ausgestattet. </li><li> Man wiegt 26,2 mg (100 umol) AgOTf und in 5 ml Methanol aufzulösen. </li><li> Fügen Sie den gelösten AgOTf in die [Ir (ppy) 2 Cl] 2 Lösung und rühren Sie 1 Stunde. Hinweis: Eine cremefarbene Aufschlämmung sollte zur Folge haben. </li><li> Nach 1 Stunde filtriert man das Aufschlämmung durch Silicagel in ein 25 x 95 mm-Dram Phiole und abzudampfen restliche Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer (5-10 min). </li><li> Nachdem das meiste Lösungsmittel entfernt wird, prüfen Sie, ob eine ölige gelbe Rückstand in der Ampulle verbleibt. Zu diesem Rückstand, fügen Sie 1 ml Methanol wieder aufzulösen, um ein Produkt zu lyophilisieren und 1-2 Tage, um den gelben festen Produkts zu ergeben. </li><li> Charakterisieren die Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 + Produkt (Ir1) von H &lt;sup&gt; 1 NMR (in CDCl 3), ESI und UV-Vis wie zuvor beschrieben. 23 </li></ol> 2. Wechselwirkungen von Ir1 mit verschiedene Aminosäuren <ol><li> Vorbereitung einer 2 mM Lösung von Ir1 in Methanol (MG 537,10 g / mol). Wirbel um eine vollständige Auflösung des Feststoffes zu gewährleisten. </li><li> Vorzubereiten 100 uM Lösungen der folgenden Aminosäuren und Biomolekülen in HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS, 100 mM HEPES, 137 mM NaCl, pH 7,4), Ala, Asp, Cys, His, Ile, Lys, Ser, Versuchen, Val. </li><li> Je 100 &amp; mgr; l jeder Aminosäure in einer schwarzen 96-Well-Platte. 100 l HBS auf die Platte als eine leere dienen. </li><li> In 2,5 ul der 2 mM Ir1 Lösung zu jeder Probe und schütteln Sie die Platte auf einem Plattenschüttler für 10 min. </li><li> Nach 10 Minuten erhalten die Emissionsspektren der Proben unter Verwendung eines 96-Well-Platten-Lesegerät (365 ex / em 400-700). <ol><li> Die Platte wird in der Instrumentenplatte und öffnen Sie die Reader-Software, um die Einrichtung eines neuen Experiments. </li><li> Stellen Sie die neue experiment einen Fluoreszenz-Scan mit einer Anregungswellenlänge von 365 nm und einer Spaltbreite von 9 nm mit der Optik in der obersten Position zu lesen. </li><li> Lesen der Emission von 300 bis 700 nm mit einer Schrittweite von 5 nm. </li><li> Exportieren Sie die Daten für die Datenanalyse. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Proben auf eine klare Platte mit 96 Vertiefungen und Bild die Emission mit einem UV-Transilluminator. </li></ol> 3. Titration von Ir1 mit BNT-II <ol><li> Bereiten Sie eine 1 mM Stammlösung von BNT-II (MW 8233,6 g / mol) in HBS sowie eine 2 mM Lösung von Ir1 in Methanol. </li><li> Von der Stammlösung, bereiten 1 ml von 100 uM BNT-II in HBS. Mischen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen, um sicherzustellen, die Probe wird gemischt. </li><li> Seriell verdünnt das 100 uM BNT-II um die Hälfte in HBS auf eine Endkonzentration von 1,56 &amp; mgr; M BNT-II. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l jeder Verdünnung in dreifacher Ausfertigung mit HBS, die als eine leere, in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Zu jeder Probe, fügen 2,5 ul 2 mM Ir1. </li><li> Shake die Platte für 10 Minuten auf einem Plattenschüttler. </li><li> Nach dem Schütteln, lesen Sie die Emissionsintensität bei 510 nm (Anregung bei 365 nm) unter Verwendung einer 96-Well-Platten-Lesegerät. <ol><li> Die Platte wird in der Instrumentenplatte und öffnen Sie die Reader-Software, um die Einrichtung eines neuen Experiments. </li><li> Den neuen Versuch, einen Fluoreszenz Endpunkt mit einer Anregungswellenlänge von 365 nm und Emissionswellenlänge von 510 nm gelesen. Stellen Sie die Schlitzbreite für beide Wellenlängen zu 9 nm, mit der Optik an der Spitzenposition. </li><li> Lesen Sie die Platte und exportieren Sie die Daten für die Analyse. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Proben auf eine klare Platte mit 96 Vertiefungen und Bild die Titration mit einem UV-Transilluminator. </li></ol> 4. Echtzeit-kinetische Analyse der Ir1 / BNT-II System mit Bioschicht Interferometry <ol><li> Fügen Sie 200 ul der kinetischen Puffer (KB; 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,02% Tween-20) bis 8 Vertiefungen in der ersten Spalte einer schwarzen 96-Well-Platte und legen Sie die Platte in das KunststoffsensorHalter. Sorgfältig übertragen 8 Ni (II) NTA Biosensoren auf die erste Spalte in der Kunststoffhalter, so dass die Spitzen in die Vertiefungen der Puffer suspendiert. Setzen Sie die Kunststoffhalterung in der linken Seite der Interferometrie Instrument. </li><li> Bereiten Sie eine 2 ml einer 0,5 &amp; mgr; M Lösung von BNT-II in KB. </li><li> Bereiten Sie 500 ul einer 10 &amp; mgr; M Lösung von Ir1 in KB, und seriell um die Hälfte zu verdünnen bis 0,156 &amp; mgr; M in KB. </li><li> Auf eine neue schwarze Platte mit 96 Vertiefungen, Pipette 200 ul KB für alle 8 Wells in Spalte A und C. </li><li> In der gleichen Platte, Pipette 200 ul des 0,5 uM BNT-II-Lösung in die Vertiefungen in Spalte B </li><li> Je 200 ul jeder Verdünnung Ir1 in Spalte D, die mit KB als Rohling in gut D1. Fügen Sie die Verdünnungen so dass die Vertiefungen zu erhöhen in Ir1 Konzentration durch die Säule. </li><li> Dieses Platte des Instruments in der rechten Seite der Platte mit den Vornetzen Sensoren. </li><li> Im Bioschicht Interferometrie-Software, die Einrichtung eines Grund Kinetic Experiment durch die Definition der Platte, Test und Sensorspitzen. <ol><li> Um die Platte zu definieren, wählen Sie eine Spalte auf dem Bildschirm der rechten Maustaste, und wählen Sie die entsprechende Definition für die Brunnen. Wählen Sie &quot;Buffer&quot; für die Spalten A und C, &quot;Load&quot; für Spalte B und &quot;Probe&quot; für Spalte D. </li><li> Definieren Sie den Test in der nächsten Registerkarte, indem Sie die folgenden Schritte (Klicken Sie auf &quot;Hinzufügen&quot;): Die Gleichgewichtseinstellung (Custom), 60 sec; Loading, 120 s; Baseline, 60 sec; Association, 120 s; und Dissoziation, 300 sec. Wählen Sie das Äquilibrierungsschritt und klicken Sie doppelt auf Spalte A. Wiederholen Sie zum Laden (Spalte B), Baseline (Spalte C), Association (Spalte D) und Dissoziation (Spalte C). Wählen Sie die Ni (II) NTA-Sensoren. </li><li> Gehen Sie zum nächsten Reiter und bestätigen, dass die Sensoren in Spalte A auf der Plastiksensorhalter. </li><li> Bestätigen Sie das Experiment richtig beschrieben ist, legen Sie einen Dateinamen an, sicherzustellen, dass &quot;Verzögerung Experiment&quot; markiert ist, und drücken Sie auf &quot;Go&quot;. NAnmerkung: Durch die automatisierte Handhabung des Gerätes, sobald die kinetische Experiment wird ausgeführt, die Schritte vorkommen, wie programmiert. </li></ol></li><li> Sobald die kinetische Durchlauf abgeschlossen ist, verarbeitet die Daten in der vorgesehenen Verarbeitungssoftware. <ol><li> Doppelklicken Sie auf den Ordner mit dem Dateinamen des Interesses an dem unteren Abschnitt der Platte auf der linken Seite. Dann doppelklicken Sie auf den entsprechenden Ordner unter &quot;Kinetics&quot; im oberen Bereich der Frontscheibe. Gehen Sie zu der Registerkarte Verarbeitung. </li><li> Überprüfen Sie die Subtraktion-Box auf der linken Seite, um den Sensor Auswahlbildschirm zu öffnen. Klicken Sie rechts auf gut A4 und ändern Sie den Typ und Referenz-Well. </li><li> Markieren Sie das Kästchen neben der Y-Achse ausrichten und sicherstellen, dass die gewählte Stufe ist Baseline. Geben Sie den Zeitbereich, um die letzten fünf Sekunden der Basislinie (ca. 55-60 sec) sein. </li><li> Markieren Sie das Kästchen für die Inter-Schritt-Korrektur und wählen Align zur Dissoziation. Stellen Sie sicher, dass die Savitzky-Golay-Filter Feld markiert ist, und drücken Sie &quot;Process Data! ̶1; </li><li> Gehen Sie zu der Registerkarte Analyse. Stellen Sie sicher, dass &quot;Assoziation und Dissoziation&quot; ist die Auswahl für die Schritte zu analysieren und, dass das Modell 1: 1. Wählen Sie einen lokalen, Ganz fit und drücken Sie &quot;Fit Curves!&quot; </li><li> Markieren Sie alle Kurven in der Tabelle und der rechten Maustaste, um alle Kurven auf eine Farbe gesetzt. Als nächstes wählen Sie eine globale (Full) fit, nach Farbe und Rmax Unlinked von Sensor gruppiert. Drücken Sie auf &quot;Fit Curves&quot; globalen Kinetik Daten zu erhalten. </li></ol></li></ol> 5. On-Bead Nachweis von BNT-II und rcHRP-II mit Ir1 <ol><li> Vorbereitung jeweils 1 ml einer 1 &amp; mgr; M Lösung von BNT-II und rcHRP-II in HBS mit Tween (HBST; HBS mit 0,025% Tween 20). </li><li> Seriell jedes Protein verdünnt um die Hälfte in HBST bis zu einer Endkonzentration von 15,6 nM. </li><li> Je 100 &amp; mgr; l jeder Verdünnung in dreifacher Ausfertigung in einer weißen Platte mit 96 Vertiefungen, die Verdünnungen in der Reihenfolge von der niedrigsten zur höchsten Konzentration nach unten eine Spalte. </li><li> Je 10 &amp; mgr; l von 50 um Ni (II) NTA Agarose magnetischen Teilchen in jeder Verdünnung gut. <ol><li> Mischen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen die magnetischen Teilchen nach jedem Pipettieren enthält, um sicherzustellen, die Teilchen bleiben suspendiert. </li></ol></li><li> Legen Sie die Platte auf einem Plattenschüttler für 15 Minuten, um die Proben mit den Partikeln inkubiert. </li><li> Nach dieser Inkubationszeit wird die Platte auf einer Platte mit 96 Vertiefungen Magneten und warten Sie 30 sec für die Partikel aus der Lösung ziehen. </li><li> Mit Hilfe einer Mehrkanalpipette, ziehen Sie die Originalprobe und entsorgen Sie als Abfall. Die Platte aus dem Magneten. </li><li> Fügen Sie 200 ul HBST in jede Vertiefung mit Hilfe der Mehrkanalpipette. Pumpen Sie den Puffer nach oben und unten mehrere Male, um die magnetischen Partikel zu waschen. </li><li> Legen Sie die Platte zurück auf den Magneten, und warten Sie 30 Sekunden für die Partikel aus der Lösung ziehen. </li><li> Unter Verwendung der Mehrkanalpipette, ziehen Sie die 200 ul Puffer und als Abfall entsorgen. Die Platte aus dem Magneten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,8 through 5.10 zweimal zu drei Waschungen der Teilchen zu vervollständigen. </li><li> 100 ul HBST in jede Vertiefung, die magnetische Teilchen, gefolgt von 2,5 ul 2 mM Ir1. </li><li> Die Teilchen mit Ir1 Inkubieren auf einem Plattenschüttler für 1 Stunde. </li><li> Nach 1 Stunde, lesen Sie die Emissionsintensität bei 510 nm (Anregung bei 365 nm) unter Verwendung einer 96-Well-Platten-Lesegerät. <ol><li> Die Platte wird in der Instrumentenplatte und öffnen Sie die Reader-Software, um die Einrichtung eines neuen Experiments. </li><li> Den neuen Versuch, einen Fluoreszenz Endpunkt mit einer Anregungswellenlänge von 365 nm und Emissionswellenlänge von 510 nm gelesen. Stellen Sie die Schlitzbreite für beide Wellenlängen bis 9 nm, mit der Optik an der Spitzenposition. </li><li> Lesen Sie die Platte und exportieren Sie die Daten für die Analyse. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Proben auf eine klare Platte mit 96 Vertiefungen und Bild die Titration mit einem UV-Transilluminator. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Als Mikropartikel-basierten Diagnosewerkzeuge kommen, um die Spitze der modernen Diagnose-Technologie, ist Nachweis von Ziel-Biomolekülen direkt auf der Oberfläche des Partikels ein großer Vorteil. Sind die traditionellen molekularen Nachweisverfahren, wie ELISA und PCR, vorteilhaft, da sie sehr niedrige Nachweisgrenze 25 erreichen. Diese Tests erfordern jedoch umfangreiche Reagenzien und langwierige Protokolle. Dieser Test wurde entwickelt, um Sandwich-ELISA-Typ-Wechselwirkungen, ohne Zeit und Reagenz Anforderungen (Abbildung 5) zu imitieren. Zusätzlich wurde die Kosten des Ir1 Sonde pro Probe auf etwa einen Cent, wohingegen die Kosten für die Antikörper für einen typischen ELISA ist $ 0,20-0,30 pro Probe. Da die oben beschriebenen Verfahren beruhen auf einer cyclometallier- Iridium Sonde zur Detektion des Malaria Biomarker würde diese Sonde nicht anfällig für Fehlerarten gemeinsam mit anderen Nachweismethoden (d. Fluorophor quenchi seinng und Antikörper / Enzymabbau). Histidin ist in seiner Metallbindungseigenschaften einzigartig. Die skizzierten Arbeits nutzt dieses Phänomen durch Ersetzen der Antikörper in einem typischen Sandwich-ELISA mit Metall enthaltende Komplexe. Ni (II) NTA erfasst rcHRP-II auf der Oberfläche des Partikels und Ir1 signalisiert die Anwesenheit des Proteins. Der wichtigste Schritt im Assay ist damit die magnetischen Partikel mit der Probe und der Sonde mischen. In einer 96-Well-Platte ELISA die Biomoleküle und Reagenzien erreichen Gleichgewicht mit der zweidimensionalen Oberfläche des Boden des Bohrlochs. Magnetpartikel haben die Tendenz, aus der Lösung absetzen aufgrund ihrer dichten Eisenoxid-Kern, der die verfügbaren Bindungsstellen reduzieren würde. Daher müssen die Teilchen während des Assays Zeit gemischt werden, um eine maximale Bindung zu gewährleisten. Bei der Gestaltung eines Reagenz zur Krankheitsdiagnose, muss man im Hinterkopf behalten die Form der Patientenprobe sowie die physiologische Konzentration der Biomarker. FürMalaria kann die Konzentration von PF-HRP-II in dem Blut eines Patienten zu günstigen picomolar hohe nanomolar variieren. Während dieser Assay für höhere Infektion klinisch relevant, die Nachweisgrenze muss, um auf asymptomatische Patienten mit niedrigen picomolar zirkulierenden pf HRP-II erkennen verbessert werden. In den oben beschriebenen Verfahren, der &quot;Einschaltbereit&quot; in der Gegenwart von Histidin durch Ir1 erzeugte Signal auftritt. Während die Malaria Biomarker ist reich an Histidin, andere Serumproteine, wie Humanserumalbumin und Histidin Glykoprotein, würde eine Signalantwort mit der Sonde hervorzurufen. Dies würde wiederum zu falsch positiven Diagnosen führen. Dies macht die Erfassung des Proteins auf der Oberfläche des Partikels eine vorteil Schritt, dass das Protein von Interesse kann schnell von einer Patientenprobe extrahiert werden. Zusätzlich Gestaltung eines bifunktionellen Sonde, dass Paare eine Histidin-reiche Peptid zu einem robusten molekulares Erkennungselement (dh. Aptamer), Könnte eine weitere Ebene der Spezifität des Tests hinzufügen. Das Peptid würde mit Iridium geladen werden, bevor die Kopplung an das Aptamer. Bei einer solchen Konstruktion kann die stabile Ir1 Sonde immer noch verwendet werden, während eine Zielspezifität mit dem Aptamer. Dies würde für die Anwendung der Sonde an nativen HRP-II in einer komplexen Matrix (d. Plasma oder Vollblut) zu ermitteln und verringern unspezifische Bindung Effekte erlauben. Um das Signal des schnellen Diagnosetests weiter zu verbessern, könnte der Test in eine elektrochemilumineszente (ECL) System, bei dem PF-HRP-II auf der RDTs als elektroAuslese 26 erfaßt werden eingearbeitet werden. Diese nächste Generation Iridium Sonde würde erheblich verbessern unsere On-Bead-ELISA-Test zum Nachweis von Biomarkern Krankheit.

Kolorimetrischen und Fluoreszenzmarkierung ist eine wichtige Methode zur Detektion und Verfolgung von biochemischen Molekülen und verarbeitet 1,2. Die häufigsten Fluoreszenzmarker sind solche niedermolekularen organischen Farbstoffe 3,4, aber diese Moleküle nicht immer ideal optische Eigenschaften. Fluoreszenzfarbstoffe sind anfällig gegen Ausbleichung, haben oft geringe Stokes-Verschiebungen und können überlappende Anregungs- und Emissionsspektren haben. Kolorimetrischen Markierung wird oft durch den Einsatz von enzymatischen Markierungen, die ein verstärktes Signal nützlich Immunoassay Quantifizierung 5,6 erreicht. Diese Enzyme haben auch ihre Nachteile, einschließlich der Lichtempfindlichkeit, den Reaktionsbedingungen und kurzen Substrat Haltbarkeit. Diese Eigenschaften sind in der Regel Immunoassays und Proteinmarkierungsmethoden benötigen, um unter kontrollierten Bedingungen mit teuren Reagenzien durchgeführt werden. Emittierenden Übergangsmetallkomplexe wurden als Alternative Kennzeichnung Ansatz fo erforschtr biochemischen Nachweis. Insbesondere cyclometallierten Ir (III) wurde im Rahmen von organischen Leuchtdioden (OLEDs) 7-9 Sauerstofferfassungs 10 untersucht, Katalyse 11 und Protein / Zellfärbung 12-14. Hohe Photostabilität und Quantenausbeute machen diese Klasse von Sonden ein guter Kandidat für Biomolekül-Erkennungs 15,16. Es wurde vorher festgestellt, dass Ir cyclometallierten (III) -Komplexe, der Form [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] +, irreversibel binden, Histidin und rufen eine blau-grüne Signalantwort 12,17. Diese Komplexe sind nicht emittierenden in Solvenskomplex Zustand, aber wenn Histidin verdrängt die Lösungsmittelmoleküle und bindet an das Metallzentrum, ein intensives Phosphoreszenzsignal nach langwellige UV-Strahlung freisetzen sie. Dieses Signal erst nach Ligandensubstitution, und ist das Ergebnis von einem Triplett-Zustand Elektronen Entspannung in den Grundzustand durch die Aktivierung von Metall-Ligand-Charge-Transfer (3 MLCT) und Liganden zentriert Transfer (3 LC) Pfade 8,15. Diese Komplexe können potentiell als Nachweissonden für Histidin-reiche Proteine ​​verwendet werden. Histidin-reiche Proteine ​​und deren Regulation Ebenen sind wichtig für viele Krankheiten, darunter Leberzirrhose, Krebs und thrombische Störungen. 18 Plasmodium falciparum Histidin Rich Protein II (pfHRP-II) ist insbesondere ein gut validierten Biomarker für die Malaria-Parasiten-Infektion. Dieses Protein ist 67 kDa und enthält 34% Histidin, meist innerhalb charakteristischen AHHAHHAAD wiederholende Motive 19. Diese Wiederholungen können Histidin freien Metallionen zu binden 19 und Häm-Komplexe 20 in Wirts Blut. pfHRP-II wird gewöhnlich in geringen Ressourceneinstellungen mit immunchromatographischen Schnelldiagnosetests (RDTs) erkannt, aber diese Tests sind oft ungenau aufgrund der Probenbedingungen, niedrige Biomarker-Konzentration, schlechte Fertigungsstandards und Antikörperabbau 21. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Metall basierende phosphoreszierende Sonden wie cyclometallier- Ir (III) oben beschriebenen Komplexe sind attraktive Möglichkeiten für den Nachweis von pfHRP-II aufgrund ihrer selektiven Bindung von Histidin und deren stabile und effiziente Emissionseigenschaften. In diesem Dokument ist die Verwendung von [Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2] + (Ir1) zu BNT-II, einen verzweigten Peptid-Mimetikum pfHRP-II erforscht 22 detektieren. Kinetik dieser Interaktion in Echtzeit mit Bioschicht Interferometrie-Techniken überwacht. Der Test wurde auch mit einem on-bead ELISA-Typ-Format, bei nanomolaren Nachweisgrenzen erreicht wurden angepasst. Dieser Test hat das Vorteile gegenüber herkömmlichen ELISAs, da es in weniger als 2 Stunden mit dem Antikörper-freie Reagenzien durchgeführt werden, anstelle der 4-5 h und biologischen Reagenzien mit typischen ELISAs erforderlich.

<table><tbody><tr><td>Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>658383</td><td></td></tr><tr><td>Silbertrifluormethansulfonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>176435</td><td></td></tr><tr><td>Kieselgel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6858</td><td></td></tr><tr><td>L-Aminosäuren</td><td>Fisher Scientific</td><td>variiert</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>BNT-II Peptid</td> Im <td>Haus synthetisiert</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>rekombinantes HRPII</td><td>Immunology Consultants Laboratory Inc.</td><td>AGPF-55</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96-Well-Platte aus schwarzem Polypropylen</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td></td></tr><tr><td>Costar weißes Polypropylen 96-Well-Platte</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Grenier schwarzes Polypropylen 96-Well-Platte</td><td>VWR</td><td>89089-582</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA magnetische Agarosepartikel</td><td>Qiagen</td><td>36111</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA Biolayer-Interferometrie-Sensoren</td><td>ForteBio</td><td>18-5101</td><td></td></tr><tr><td>Octet Red96 Biolayer-Interferometrie Instrumet</td><td>ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotek Synergy H4 Microplate Reader</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher Biotech Transilluminator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBDLT-88</td><td></td></tr></tbody></table>

iridium (iii) lumineszierende sonde zum nachweis von malaria-protein biomarker histidin rich protein-ii

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Diese Arbeit beschreibt die Synthese einer nicht-emittierende cyclometallierte Ir (III) -Komplexes, Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1), die eine schnelle und langlebiges phosphoreszierende Signal auslöst, wenn sie einem Histidin koordiniert enthaltenden Proteins auf der Oberfläche eines magnetischen Partikels immobilisiert. Synthese von Ir1, in hohen Ausbeuten, ist eine vollständige O / N und beinhaltet das Teilen des Muttercyclometallierten Ir (III) Chlor-verbrückten Dimer in zwei Äquivalente des solvatisierten Komplexes. Um die Spezifität zu bestätigen, wurden mehrere Aminosäuren, die für die Koordination Aktivität untersucht, wenn auf das synthetisierte Sonde aufgenommen und nur Histidin löste eine Signalantwort. Verwendung BNT-II, einen verzweigten Peptid-Mimetikum Malaria Biomarker histidinreichem Protein II (pfHRP-II), wurde das Iridium-Sonde als ein Werkzeug für HRP-II Detektions validiert. Abschrecken Effekte wurden im BNT-II / Ir1 Titration festgestellt, wenn im Vergleich zu L-Histidin / Ir1, diese wurden auf sterische Hinderung und Tri zurückzuführenPlet Zustand Abschrecken. Bioschicht Interferometrie wurde verwendet, um in Echtzeit die Kinetik der Wechselwirkung des Ir1 mit BNT-II zu bestimmen. Sobald das System optimiert wurde die Nachweisgrenze von rcHRP-II unter Verwendung der Sonde festgestellt, daß 12,8 nM in Lösung sein. Wenn dieses Protein auf der Oberfläche einer 50 um magnetische Agarose Teilchen immobilisiert, die Nachweisgrenze lag bei 14,5 nM. Die robuste Signalantwort dieses anorganischen Sonde sowie ihre Flexibilität im Einsatz in Lösung oder auf einer Oberfläche immobilisiert ist, kann sich in Richtung auf eine Vielzahl von Anwendungen verleihen, aus diagnostischen Anwendung zur Bilderzeugung.

Wie in Abbildung 1, Synthese der Ir1 Solvenskomplexes-Komplex beteiligte Aufspaltung des Chlorid Brücke in der Mutter Dimer durch Ausfällung des Chlorids in Form von unlöslichen AgCl und Vereinigung von Wassermolekülen an das Metallzentrum dargestellt. Die Bildung von Ir1 wurde von H 1 NMR und ESI bestätigt. Zusätzlich wurden UV-Vis-Banden charakteristisch für Metall-Ligand-Charge-Transfer-und π-π * Übergänge zu dem Spektrum zugeordnet, ferner die Validierung der Bildung von Ir1. Das solvatisierte Komplex weist keine emittierende Charakter, wenn sie bei 365 nm angeregt wird. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig1.jpg" /> Fig. 1: Synthese und Charakterisierung von Ir1 Chloride Brückenspaltungsreaktion von Dichlorotetrakis (2- (2-pyridinyl) phenyl) diiridium (III), um die Aquokomplex Ir erstellen (ppy) 2 (H 2 O) 2 </sub&gt; + (Ir1). Bei Zugabe von L-His zur Aquokomplex in wässrigem Puffer, Leuchtsignal eingeschaltet ist. Sobald der Komplex synthetisiert und charakterisiert wurde die Aminosäureselektivität analysiert, wie zuvor unter Verwendung eines ähnlichen Iridium Analog 17 beschrieben. 2A zeigt, daß nur Histidin löste eine Signalantwort bei 510 nm, wenn sie bei 365 nm angeregt wird. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig2.jpg" /> Figur 2: Aminosäure-Selektivität und Titration von Ir1 mit histidinreichem Peptide (A) Zusammenspiel von 200 uM verschiedener Aminosäuren (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His) mit 50 &amp; mgr; M. Ir1 in HBS. Spektrale Scans wurden von 400 bis 700 nm bei einer Anregungswellenlänge von 365 nm in einer schwarzen 96-Well-Platte entnommen. Signal in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) von allen Aminosäuren besides Histidin (gestrichelte schwarze Linie) war vernachlässigbar. (B) nanomolaren Konzentrationen von BNT-II (▪) und rcHRP-II (♦) wurden mit Ir1 in HBS titriert. Die Histidin-reiche Peptide wurden mit der Sonde für 15 min in der Lösung vor dem Ablesen der Emission bei 510 nm nach Anregung mit 365-nm-Licht inkubiert. Nachweisgrenze wurde als Wert von x, wenn y = 3σ blank berechnet. Dieses &quot;on-Schalter&quot; der Phosphoreszenz des Iridium-Sonde tritt auf, weil die angeregten Singulettzustand (1 MLCT / 1 LC) des Ir (III) Biokonjugat erfährt Intersystem Crossing zum Triplett angeregten Zustand (3 MLCT), wenn Histidin koordiniert mit dem Metallzentrum. Diese Sonde wurde ein Peptid Mimik des Malaria-Biomarker Plasmodium falciparum Histidin Rich Protein II (pf HRP-II) zu BNT-II angewendet. In einer Titration von BNT-II mit Ir1, eine konzentrationsabhängige Signalantwort beobachtet ( <strong&gt; 2B). Rekombinante HRP-II (rcHRP-II) zeigte auch eine ähnliche Reaktion in Lösung. Die Nachweisgrenze der BNT-II und rcHRP-II in Lösung waren 54,8 nM und 12,8 nM. Verwendung Bioschicht Interferometrie-Techniken, die K D von Ir1 Bindung an BNT-II immobilisiert auf einem Ni (II) NTA-Oberfläche wurde gefunden, dass 2,05 &amp; mgr; M (Figur 3) sein. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig4.jpg" /> Abbildung 3: Echtzeit-kinetische Analyse Ir1 mit BNT-II Bioschicht Interferometrie für kinetische Analyse von verschiedenen Konzentrationen von Ir1 Bindung an BNT-II auf der Oberfläche eines Ni (II) NTA Glassensor.. Nach Äquilibrieren der Sensoren in KB (Region A) sind die Sensoren mit 0,5 uM BNT-II (Region B) geladen. Sobald das Peptid an den Sensoren geladen wird, wird ein Ausgangswert festgelegt (Region C) vor der Messung der Assoziation von Ir1 zum BNT-II (Region D). Nacheine Zeit der Vereinigung werden die Sensoren wieder in KB gesetzt, um die Dissoziation (Region E) zu messen. Die gesamte kinetische Analyse Vorgang dauert weniger als 30 Minuten. Wenn von einer Lösung basierenden Assay an ein magnetisches Teilchen Plattform, die zusätzliche Komplexität des Teilchens in dem System musste berücksichtigt werden. Es wurde aus früheren Arbeiten bekannt ist, dass diese Partikel effizient die Malaria Biomarker pf HRP-II zu binden. 24 Black Fluoreszenzplatten funktionierte gut für die Lösung Assay oben beschreiben, aber weiße Platten für die on-Partikeldetektionsplattform besser geeignet waren, wie in gesehen 4A. In einer weißen Platte wird das Licht zurück in die Probe reflektiert wird, wodurch eine bessere Absorption der Ir1 auf die Oberfläche des Partikels gebunden ist. Im On-Partikel-Assay wird die Nachweisgrenze der rcHRP-II wurde bestimmt, dass 14,5 nM (4B) ist. Die Nachweisgrenze für rcHRP-II-Lösung und von partikel waren STATISTMtisch die gleiche Basis eines ungepaarten t-Test (p = 0,731). <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> Abb. 4: On-bead Nachweis von BNT-II und HRP-II (A) Differenzen zwischen dem von Ir1 BNT-II auf der Oberfläche von 50 um Ni gebunden erfassten Signals (II) NTA magnetische Agarose-Teilchen in einem schwarzen 96- Well-Platte (durchgezogene Linie) im Vergleich zu einer weißen Platte mit 96 Vertiefungen (gestrichelte Linie). Die Partikel wurden mit 365 nm Licht angeregt und die Emission wurde bei 510 nm gemessen. (B) Die Titration rcHRP-II auf den magnetischen Teilchen immobilisiert und unter Verwendung Ir1. Nachweisgrenze wurde als das va berechnetlue von x, wenn y = 3σ leer. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" /> Abbildung 5: Schematische Darstellung des On-Bead-Erkennung von rcHRP-II mit Ir1 Allgemeine Systematik der HRP-II-Bindung an der Oberfläche des Ni (II) NTA-Teilchen und mit Ir1 gekennzeichnet.. Die Partikel werden mit einem histidinreichem Peptid für 15 min inkubiert. Nach diesem Inkubationszeitraum werden die Partikel mit Hilfe eines Magneten HBST, um die Teilchen aus der Lösung zu ziehen gewaschen. Schließlich können die Peptid gebundene Partikel mit Ir1 für 1 h vor dem Ablesen der Emission bei 510 nm nach Anregung mit Licht von 365 nm inkubiert.

Robuste Nachweisreagenzien sind von zunehmender Notwendigkeit für die Entwicklung neuer Malaria-Diagnosewerkzeuge. Es wurde eine Iridium(III)-Sonde entwickelt, die in Gegenwart eines histidinreichen Malariaprotein-Biomarkers ein lang anhaltendes Lumineszenzsignal aussendet. Der Nachweis des Proteins entweder in Lösung oder immobilisiert auf einem Magnetpartikel bietet Flexibilität in der Anwendung.

Iridium (III) Lumineszierende Sonde zum Nachweis von Malaria-Protein Biomarker Histidin Rich Protein-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Vorhandensein eines histidinreichen Malaria-Proteins als Biomarker in einer Probe mithilfe einer phosphoreszierenden Iridiumsonde nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst der cyclometallisierte Iridiumkomplex synthetisiert wird. Nach einer schnellen Spaltung der Chloridbrücke des ursprünglichen Dimerkomplexes kann der cyclometallisierte Iridiumkomplex isoliert und durch Verwendung im Assay gereinigt werden.Der zweite Schritt besteht darin, die Wechselwirkungen der Sonde mit verschiedenen Aminosäuren zu validieren, um deren Spezifität sicherzustellen. Allein für Histamin wird das phosphoreszierende Signal nur in Gegenwart von Histamin eingeschaltet und mittels Lumineszenzspektroskopie beobachtet. Als anschließender Nachweis des Konzepts wird die Iridium-Sonde mit einem peptidischen Mimetikum des Malaria-Biomarkers, des histidinreichen Proteins zwei, titriert, um die Nachweisgrenzen in Lösung zu bestimmen.Zusätzlich wird die Kinetik der Wechselwirkung der Sonde mit dem Peptid mittels Biolinien-Interferometrie aufgeklärt. Im letzten Schritt wird rekombinantes histidinreiches Protein auf der Oberfläche von Nickel-NTA-magnetischen Partikeln immobilisiert und die Nachweisgrenze des Proteins mittels der Sonde bestimmt. Abschließend werden Lumineszenz und Spektroskopie verwendet, um zu zeigen, wie Proteine auf der Oberfläche einer festen Trägermatrix mit einer neuen Klasse phosphoreszierender Iridium-Sonden nachgewiesen werden können.Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Markierung mit fluoreszierenden Proteinen und Immunassays bestehen darin, dass die Sonde robust ist. Sie weist schnelle Assoziationskinetik auf und ist nicht anfällig für Photobleichen. Außerdem erfordert diese Technik nicht so viel Zeit wie Immunassays.Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Diagnose einer Malaria-Infektion. Dies liegt am hohen Gehalt an Histidin im Protein-Biomarker für die Plasmodium-SRO-Infektion, bekannt als histidinreiches Protein zwei. Die Idee zu dieser Methode entstand erstmals, als uns auffiel, dass eine Veröffentlichung erschienen war, in der ein cyclometallierter Iridium-Probe zur Färbung lebender Zellen verwendet wurde.In dieser Arbeit gaben sie an, dass die Sonde in die lebende Zelle eindrang und durch Bindung an seine reichen Proteine die Kerne anleuchtete. Angesichts der Natur des pathologischen Biomarkers, des reichen Proteins zwei, beschlossen wir, diese Sonde zur Detektion unseres Proteins von Interesse zu verwenden. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist aufgrund der Komplexität des Assays und der zahlreichen Wasch- und Übertragungsschritte, die zur Detektion dieses Zielproteins an Partikeln erforderlich sind, entscheidend. Zunächst werden 53,6 Milligramm des ursprünglichen Iridium-Dimers in fünf Milliliter Methylenchlorid gelöst.Fügen Sie diese Lösung einem 50-Milliliter-Lummi-Kolben mit Rührstab hinzu. Wiegen Sie anschließend 26,2 Milligramm Silber-FL ab und lösen Sie diese in fünf Millilitern Methanol. Geben Sie das gelöste Silber-FL zur Ausgangslösung des Iridium-Dimers hinzu und rühren Sie eine Stunde lang. Es sollte sich nach einer Stunde eine cremefarbene Suspension bilden. Die Suspension über Kieselgel in ein Filtergefäß filtrieren. Das filtrierte Produkt in ein 25 × 95 mm großes DRAM-Gefäß überführen und das verbleibende Lösungsmittel mithilfe eines Rotationsverdampfers fünf bis zehn Minuten lang entfernen. Sobald der größte Teil des Lösungsmittels entfernt ist, überprüfen Sie, ob ein öliges, gelbes Rückstand im Gefäß verbleibt.Zu diesem Rückstand geben Sie ein Milliliter Methanol, um das Produkt aufzunehmen. Stehen Sie es ein bis zwei Tage, um einen gelben Feststoff zu erhalten, und charakterisieren Sie das Produkt wie im Textprotokoll beschrieben, um die Wechselwirkungen der Iridiumsonde mit verschiedenen Aminosäuren zu untersuchen. Pipettieren Sie jeweils 100 Mikroliter jeder Aminosäurelösung in eine schwarze 96-Well-Platte.Geben Sie 100 Mikroliter gepufferte Salzlösung oder HBS in die Platte, um als Leerprobe zu dienen. Anschließend geben Sie 2,5 Mikroliter der hergestellten zweimillimolaren Iridiumsondenlösung zu jeder Probe hinzu und schütteln die Platte 10 Minuten lang auf einem Plattenschüttler. Nach 10 Minuten nehmen Sie die Emissionsspektren der Proben mithilfe eines 96-Well-Plattenlesegeräts auf.Um dies durchzuführen, stellen Sie die Platte in das Gerät und öffnen die Software des Plattenlesegeräts, um ein neues Experiment einzurichten. Übertragen Sie anschließend die Proben in eine klare 96-Well-Platte und nehmen Sie die Emission mit einem UV-Transilluminator auf, um die Titration des Iridiumprobes mit dem verzweigten Peptidmimetikum des Malaria-Biomarkers, histidinreiches Protein zwei BNT zwei, durchzuführen. Bereiten Sie zunächst eine einmillimolare Stammlösung von BNT zwei in HBS vor.Anschließend die BN T zwei-Lösung wie im Textprotokoll beschrieben seriell verdünnen. Jeweils 100 Mikroliter jeder Verdünnung im Dreifachansatz unter Verwendung von HBS als Leerprobe in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte geben. Zu jeder Probe 2,5 Mikroliter der zwei Millimolar iridiumhaltigen Sonde hinzufügen. Die Platte 10 Minuten lang auf einem Plattenrührer schütteln. Nach dem Schütteln die Emissionsintensität bei 510 Nanometern mit einem 96-Loch-Plattenreader messen.Überführen Sie die Proben abschließend in eine klare 96-Well-Platte und nehmen Sie ein Bild der Titration mithilfe eines UV-Durchlichtgeräts auf, um eine Echtzeit-Kinetikanalyse mittels Biolinien-Interferometrie durchzuführen. Geben Sie zunächst 200 Mikroliter Kinetikpuffer in acht Vertiefungen der ersten Spalte einer schwarzen 96-Well-Platte. Nachdem Sie die Platte in den Kunststoff-Sensorhalter eingesetzt haben, überführen Sie vorsichtig acht Nickel-Biosensoren in die erste Spalte des Kunststoffhalters, sodass die Spitzen in den Puffervertiefungen hängen.Dann befestigen Sie den Kunststoffhalter auf der linken Seite des Interferometrieinstruments und pipettieren Sie 200 Mikroliter KB in alle acht Vertiefungen der Spalten eins und drei derselben schwarzen 96-Well-Platte. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter der 0,5-Mikromolar-BNT-2-Lösung in die Vertiefungen der Spalte zwei. Danach pipettieren Sie jeweils 200 Mikroliter jeder Verdünnung der Iridiumsonde in Spalte vier, wobei KB als Leerprobe in Vertiefung A4 verwendet wird. Fügen Sie die Verdünnungen so hinzu, dass die Konzentration der Iridiumsonde in den Vertiefungen entlang der Spalte nach unten hin zunimmt.Platzieren Sie diese Platte im Instrument rechts neben der Platte mit den Vorbenetzungssensoren in der Biolinien-Interferometrie-Software. Richten Sie ein grundlegendes kinetisches Experiment ein, indem Sie den Plattenassay und die Sensortipps definieren, um die Platte festzulegen; klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine Spalte auf dem Bildschirm und wählen Sie die entsprechende Definition. Wählen Sie für die Vertiefungen Puffer aus.Für die Spalten eins und drei laden Sie für Spalte zwei und die Probe. Für Spalte vier definieren Sie den Assay im nächsten Tab, indem Sie zuerst auf „Gleichgewicht hinzufügen“ klicken. 60 Sekunden Ladezeit, 120 Sekunden. Assoziation 120 Sekunden und Dissoziation 300 Sekunden. Wählen Sie den Gleichgewichtsschritt aus und doppelklicken Sie auf Spalte eins. Wiederholen Sie dies anschließend für die Beladung auf Spalte zwei, die Basislinie auf Spalte drei, die Assoziation auf Spalte vier und die Dissoziation auf Spalte drei.Wählen Sie abschließend die Nickel-NTA-Sensoren aus. Überprüfen Sie, ob das Experiment korrekt beschrieben ist. Geben Sie einen Dateinamen ein.Stellen Sie sicher, dass das Verzögerungsexperiment ausgewählt ist, und drücken Sie „go“. Sobald der kinetische Durchlauf abgeschlossen ist, verarbeiten Sie die Daten in der bereitgestellten Verarbeitungssoftware, um die Detektion von BNT zwei und rekombinantem HRP zwei mit der Iridiumsonde auf der Perle durchzuführen. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung von BNT zwei und rekombinantem HRP zwei wie im Textprotokoll beschrieben vor.Dann pipettieren Sie je 100 Mikroliter jeder Verdünnung im Dreifachansatz in eine weiße 96-Well-Platte, wobei die Verdünnungen einer Spalte nach steigender Konzentration angeordnet werden. Geben Sie 10 Mikroliter 50 Mikron Nickel-NTA-magnetische Agarose-Partikel in jede Verdünnung. Beachten Sie, dass die magnetischen Partikel während des Pipettierens in Suspension bleiben müssen. Falls sie zu sedimentieren beginnen, mischen Sie erneut durch Pipettieren oder Vortexen. Anschließend setzen Sie die Platte 15 Minuten lang auf einen Plattenrührer, um die Proben mit den Partikeln zu inkubieren. Nach dieser Inkubationszeit stellen Sie die Platte auf einen 96-Well-Magneten und warten 30 Sekunden, bis die Partikel aus der Lösung gezogen sind.Entfernen Sie mit einer Mehrkanalpipette die ursprüngliche Probe und entsorgen Sie sie als Abfall, nachdem Sie die Platte vom Magneten genommen haben, und geben Sie 200 Mikroliter HBS mit Tween oder HBST in jedes Loch. Spülen Sie die magnetischen Partikel mehrmals durch Auf- und Abpipettieren des Puffers mit der Mehrkanalpipette. Stellen Sie die Platte erneut auf den Magneten und warten Sie 30 Sekunden, bis die Partikel aus der Lösung gezogen sind.Entfernen Sie mit der Mehrkanalpipette die 200 Mikroliter Puffer und entsorgen Sie diese als Abfall. Entfernen Sie die Platte vom Magneten, bevor Sie die Waschschritte zwei Mal wiederholen, um insgesamt drei Waschungen der Partikel abzuschließen. Geben Sie dann 100 Mikroliter HBST in jede Vertiefung mit magnetischen Partikeln, gefolgt von 2,5 Mikrolitern der zweimillimolaren Iridiumsondenlösung.Inkubieren Sie die Partikel eine Stunde lang mit der Iridium-Sonde auf einem Plattenrührer. Nach einer Stunde messen Sie die Emissionsintensität bei 510 Nanometern mit einem 96-Well-Plattenreader.Nach der Synthese und Charakterisierung der cyclometallierten Iridiumsonde werden verschiedene Aminosäuren auf ihre Reaktivität mit dem Komplex getestet. Nur Histidin führt bei der Titration der Sonde zu einer Signalantwort in relativen Fluoreszenzeinheiten. Bei zwei Histamin enthaltenden Peptiden in Lösung wird eine konzentrationsabhängige Antwort beobachtet.Diese Reaktion ist hier unter Breitband-UV-Licht sichtbar. Die Bio-Layer-Interferometrie zur kinetischen Analyse verschiedener Konzentrationen der Iridiumsonde, die an BNT zwei auf der Oberfläche eines Nickels bindet, zeigt, dass die Iridiumsonde eine Affinität im Mikromolarbereich für die Histidin enthaltenden Peptide aufweist. NT.A-Glasksensor.Die Nachweisgrenze für das histidinreiche Protein mithilfe der Sonde war vergleichbar, unabhängig davon, ob das Protein an der Oberfläche eines magnetischen Partikels immobilisiert war oder in Lösung vorlag. Sobald die Methode beherrscht ist, kann diese Markierung des Proteins an der Oberfläche der Partikel selbst sichtbar gemacht werden. Bei sachgemäßer Durchführung kann diese Technik innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, bei den Wasch- und Transfer-Schritten mit den magnetischen, proteinbelegten Partikeln sorgfältig vorzugehen. Das Entfernen nicht gebundenen Proteins ist entscheidend für die korrekte Detektion des immobilisierten P-F-H-R-P zwei, um ein molekulares Erkennungselement zu entwerfen, das gezielt das gebundene Protein über Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen erfasst. Die gleichzeitige Verwendung der robusten Iridiumsonde ermöglicht nach ihrer Entwicklung eine empfindlichere und spezifischere Detektion der auf der Oberfläche der Partikel gebundenen Proteine.Diese Technik könnte dazu beitragen, Forschern auf dem Gebiet der Diagnostik den Weg zu ebnen, um die Nutzung solcher Reagenzien zu erforschen, die nicht nur für den Nachweis von Malaria, sondern auch für andere Infektionskrankheiten robust sind.

iridium-iii-luminescent-probe-for-detection-malarial-protein

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Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

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Hier beschreiben wir ein Verfahren, das eine detaillierte Analyse der phosphorylierungsabhängigen Aktivierung des IRF3-Transkriptionsfaktors ermöglicht. Dies wird durch die Kombination einer hochauflösenden SDS-PAGE und einer nativen PAGE erreicht, die mit Immunoblots unter Verwendung mehrerer phosphospezifischer Antikörper gekoppelt ist.

Eine hohe Auflösung Methode zur Phosphorylierung abhängige Aktivierung von IRF3 Überwachen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von Plasmodium Falciparum infizierten wässrigen roten Blutkörperchen mit einem abgeschwächten Totalreflexion Infrarot-Spektrometer und multivariate Datenanalyse.

Erkennung und Quantifizierung von Plasmodium Falciparum in wässrigen roten Blutkörperchen durch gedämpft totale Reflexion Infrarotspektroskopie und Multivariate Datenanalyse

Der Elektrochemilumineszenz-Immunoassay (ECLIA) ist ein neuartiger Ansatz für den quantitativen Nachweis endogener und exogen angewendeter MeCP2-Proteinvarianten, der hochquantitative, genaue und reproduzierbare Messungen mit geringem Intra- und Inter-Assay-Fehler über einen weiten Arbeitsbereich erzeugt. Hier wird das Protokoll für die MeCP2-ECLIA im 96-Well-Format beschrieben.

Ein Electrochemilumineszenz-basierter Assay für MeCP2-Proteinvarianten

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur hochauflösenden optischen Detektion chemischer Informationen um implantierte medizinische Geräte mit röntgenangeregter lumineszenzchemischer Bildgebung (XELCI) vor. Dieses neuartige bildgebende Verfahren wird in unserem Labor entwickelt und ermöglicht die Untersuchung der Biochemie implantatassoziierter Infektionen.

Chemische Bildgebung mit hoher räumlicher Auflösung von implantatassoziierten Infektionen mit röntgenangeregter Lumineszenz-chemischer Bildgebung durch Gewebe

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine detaillierte Echtzeit-NIR-II-Fluoreszenz-Bildgebungsoperation einer Maus unter Verwendung eines NIR-II-optischen Bildgebungsgeräts.

Eine helle NIR-II-Fluoreszenzsonde für die Gefäß- und Tumorbildgebung

Erfahren Sie die Synthese einer phosphoreszierenden Iridium-Sonde zur spezifischen Detektion des Malaria-Biomarkers Histidin-reiches Protein-II. Diese Methode ermöglicht robuste Lumineszenzdetektion in Lösung und auf festen Trägern.

Iridium (III) Lumineszierende Sonde zum Nachweis von Malaria-Protein Biomarker Histidin Rich Protein-II

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