Ein Verfahren zum Fern Silencing neuronale Aktivität in Nagetiere Während diskreter Phasen des Lernens

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, die neuronale Aktivität in diskreten Hirnregionen vorübergehend und aus der Ferne zum Schweigen zu bringen, während die Tiere mit Lern- und Gedächtnisaufgaben beschäftigt sind. Dies wird erreicht, indem zuerst das a a V, das einen Designerrezeptor und einen Reporter enthält, in eine Spritze zur Infusion geladen wird. Der zweite Schritt besteht darin, ein a V in die interessierende Region im Rattengehirn zu infundieren.

Als nächstes wird das biologisch inerte Designermedikament Clozapin und -oxid hergestellt und der Ratte systemisch injiziert. Der letzte Schritt besteht darin, Verhaltenstests unter Verwendung eines sensorischen Präkonditionierungsparadigmas durchzuführen. Letztendlich wird die Immunfluoreszenzmikroskopie am Gehirngewebe der Ratte verwendet, um die Platzierung des Designer-Rezeptors zu überprüfen.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Verhaltensneurowissenschaften zu beantworten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Regulation von Motivation, Aufmerksamkeit sowie Lernen und Gedächtnis Stellen Sie sicher, dass alle institutionellen Vorsichtsmaßnahmen für die Arbeit mit Adeno-assoziierten Viren in allen Bereichen befolgt werden. Das in diesem Video verwendete Virus wird als Verbindung der Biosicherheitsstufe eins eingestuft. Bereiten Sie eine 10%ige Bleichlösung vor. Die Dekontamination ist ein Abfallplatz, eine Bega mit Bleichlösung und eine sterile 10-Mikroliter-Spritze.

Setzen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Aliquot von a a V in einen Standard-Schraubstock Load, eine 10-Mikroliter-Spritze mit mindestens vier Mikrolitern a A v ein. Stellen Sie sicher, dass sich in den vier Mikrolitern a a v Lösung keine Luftblasen befinden. Entsorgen Sie das leere Virusröhrchen in der Spritze im Becherglas mit 10 % Bleichmittel.

Geben Sie weitere 10 % Bleichmittel in den Abfallbehälter und lassen Sie den Abfall 30 Minuten ruhen, bevor Sie den dekontaminierten flüssigen Abfall gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgen. Bereiten Sie den Operationsbereich vor, indem Sie saugfähiges Tischpapier unter das stereotaktische Gerät und auf einen angrenzenden Raum legen, der als spezieller Bereich für die Virushandhabung ausgewiesen ist. Nach Einleitung der Anästhesie wurden 3% isof, Fluor und Sauerstoff mit einer Rate von einem Liter pro Minute aufgenommen.

Das Fell zwischen den Augen bis leicht hinter die Ohren rasiert. Nach der Rasur wird die Ratte drei Minuten lang wieder in die Induktionskammer gelegt, wobei die Ratte in einem stereotaktischen Gerät gesichert ist. Decken Sie die Augen mit Augensalbe ab und bereiten Sie die Schnittstelle durch Reinigung mit Betadine vor.

Nachdem Sie einen 2,4 Zentimeter langen Schnitt in der Mittellinie der Haut gemacht haben, der über dem Schädel liegt, beginnend etwa zwei Millimeter cordal zu den Augen, ziehen Sie die Haut zurück, um den Schädel freizulegen, und entfernen Sie dann membranöses Gewebe vom Schädel, bis bgma und lambda deutlich sichtbar sind. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass der Schädel flach ist, positionieren Sie den Bohrer bei bgma, setzen Sie die Koordinaten auf Null und bewegen Sie den Bohrer dann auf die gewünschten medialen, lateralen und anterioren hinteren Koordinaten. Bohren Sie ein Loch mit einem 0,9-, 0,7- oder 0,5-Millimeter-Bohrer.

Stellen Sie die Infusionspumpe so ein, dass das Virus mit einer Geschwindigkeit von 0,2 Mikrolitern pro Minute abgegeben wird. Stecken Sie die Spritze in den Infusionsarm des stereotaktischen Geräts und senken Sie die Spritze auf die gewünschte Koordinate ab. Verwenden Sie die Pumpe, um die gewünschte Virusmenge zu verabreichen, nachdem die Virenabgabe abgeschlossen ist.

Lassen Sie die Spritze 10 Minuten lang an Ort und Stelle, um einen Rückfluss in die Nadel zu verhindern, und heben Sie die Spritze langsam mit einer Geschwindigkeit von etwa fünf Millimetern pro Minute an. Wechseln Sie dann zur nächsten Koordinate und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Koordinaten mit einem a v versehen sind. Nach dem Schließen der Wunde und der postoperativen Analgesie gemäß dem genehmigten Protokoll setzen Sie die Ratte in einen sauberen Käfig mit Einstreu, Deckel und ordnungsgemäßer Beschilderung.

Wenn sich die Ratte vollständig von der Narkose erholt hat, bringen Sie sie in den Haltungsraum zurück. Warten Sie drei oder mehr Wochen, bevor Sie mit Verhaltenstests beginnen, um eine angemessene Expression des Designer-Rezeptors sicherzustellen. Diese Abbildung zeigt die drei Phasen des sensorischen Vorkonditionierungsparadigmas, die Vorkonditionierungsphase, die Konditionierungsphase und die Testphase.

Das Designermedikament Clozapin und Oxid oder CNO wird verwendet, um die neuronale Aktivität zum Schweigen zu bringen. Durch die Aktivierung des Designrezeptors kann CNO vor jeder Testphase injiziert werden. Hier wird CNO 30 Minuten vor jeder der Vorkonditionierungssitzungen injiziert. Nach der Zubereitung einer frischen Lösung von Clozapin und Oxid von einem Milligramm pro Milliliter gemäß den Anweisungen im schriftlichen Teil des Protokolls injizieren Sie das CNO intraperitoneal in einer Dosis von einem Milligramm pro Kilogramm 30 Minuten vor dem Verhaltenstest.

Initiieren Sie den Computercode für die entsprechende Verhaltenssitzung. Nach Ablauf von 30 Minuten werden die Ratten in die Testkammern gebracht und die erste von 4 64-minütigen Vorkonditionierungssitzungen begonnen, indem wir den Ratten 12 miteinander gemischte Versuche präsentieren, die aus der Abgabe von auditiven und visuellen Reizen bestehen. Bei sechs der Versuche wurde ein Ton des Vorbedingungsreizes für 10 Sekunden vorgelegt, gefolgt von einer fünfsekündigen Präsentation des Blitzlichtreizes bei den anderen sechs Versuchen.

Präsentieren Sie das weiße Rauschen, den nicht ausgestrahlten Reiz allein für 10 Sekunden. Beginnen Sie nach Abschluss der Vorkonditionierungsphase mit den Konditionssitzungen, die an fünf aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt werden. Präsentieren Sie den Ratten acht Versuche, die aus der Abgabe des visuellen Stimulus, dem Blinklicht für fünf Sekunden, unmittelbar gefolgt von der Abgabe von 2 45-Milligramm-Futterpellets, bestehen.

Diese Zeit beinhaltet Intervalle zwischen den Versuchen, die sieben Minuten betragen, wenn die Konditionseinheiten abgeschlossen sind. Führen Sie die einzelne 78-minütige Testsitzung durch, indem Sie den Ratten 12 miteinander gemischte Versuche präsentieren, die ausschließlich aus der Abgabe der auditiven Reize bestehen. Bei sechs der Versuche.

Präsentieren Sie den Tonreiz, den Vorbedingungsreiz allein für 10 Sekunden. Bei den anderen sechs Versuchen präsentieren Sie das weiße Rauschen, den ungepaarten Reiz allein für 10 Sekunden. Entfernen Sie nach Abschluss der Verhaltensaufgabe sofort die Ratten aus den Kammern und bringen Sie sie in die Tierkolonie zurück.

Analysieren Sie die Daten aus der Konditionierungs- und Testphase gemäß den detaillierten Anweisungen im schriftlichen Teil des Protokolls. Nach der Durchführung einer Immunhistochemie, die gegen den markierten Reporter oder das Reporterprotein gerichtet ist, untersuchen Sie die Färbeschnitte durch Mikroskopie, um die Position und Expression des Designerrezeptors und/oder Reporters wie erwartet zu bestimmen. Kontroll- und Versuchsratten lernten in ähnlicher Weise die Pawlowsche Assoziation zwischen dem Blitzlichtreiz und der Nahrung. Während der Konditionseinheiten.

In den Sitzungen waren beide Gruppen auch motiviert, während der Konditionierungssitzung eine Belohnung für das Futter zu erhalten. Im Gegensatz dazu scheiterten die Versuchsratten während der kritischen Testsitzung daran, zwischen den vorkonditionierten und den nicht ausgestrahlten auditiven Reizen zu unterscheiden, während Kontrollratten als Reaktion auf die Präsentation des Vorbedingungsreizes ein stärkeres Verhalten bei der Nahrungstasse zeigten. Somit zeigten Kontrollratten, aber nicht experimentelle Ratten, den sensorischen Präkonditionierungseffekt.

Dieses Bild zeigt die histologische Verifizierung der Lokalisation einer a v-Infusion in die interessierende Region im Nagetiergehirn nach seiner Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um den Beitrag bestimmter Gehirnregionen und/oder Zelltypen zu komplexem Verhalten in vivo zu untersuchen.