Isolierung und Vermehrung von zirkulierenden Tumorzellen aus einer Maus Cancer

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zirkulierende Tumorzellen aus Vollblut eines syngenen Maus-Tumormodells mit Metastasen des hepatozellulären Karzinoms zu isolieren und zu vermehren. Dies wird erreicht, indem zunächst das von den Mäusen gesammelte Vollblut zentrifugiert und die Büffycoat-Fraktion isoliert wird. Anschließend werden die roten Blutkörperchen im Büffycoat lysiert und die zirkulierenden Tumorzellen in einem Pellet gesammelt.

Die Zellen werden anschließend gewaschen, in komplettem Kulturmedium suspendiert und in der Zellkultur vermehrt. Die schnell wachsenden Tumorzellen bleiben über zahlreiche Passagen hinweg vital und können mit standardmäßigen molekulardiagnostischen Methoden verifiziert werden. Die Bedeutung der Isolierung zirkulierender Tumorzellen mittels unserer Technik liegt darin, dass sie ein reproduzierbares Modell bereitstellt, das für eine mögliche Anwendung im klinischen Umfeld optimiert werden kann.

Michèle Nadu, eine Studentin aus unserem Labor, wird mir bei der Demonstration des Verfahrens assistieren. Beginnen Sie mit der Gewinnung von Vollblut aus einem Ciea-Kamau-Tumormodell mit hepatozellulärer Karzinommetastase, wie in einer separaten Ausgabe des J des vertikalen Zentrifugen beschrieben. Zentrifugieren Sie das gesammelte Vollblut bei 1.167 ×g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Nach der Schichtung vorsichtig die obere Plasma-Schicht abheben und in ein separates 1,5-Milliliter-ROGEN-freies Röhrchen für weitere Experimente, wie beispielsweise den Nachweis zellfreier Nukleinsäuren, überführen. Anschließend die Buffy-Coat-Schicht in ein separates 1,5-Milliliter-ROGEN-freies Röhrchen überführen, um die Lyse der roten Blutkörperchen vorzubereiten. Dies ist erforderlich, um verbleibende rote Blutkörperchen in der Buffy-Coat-Schicht vor der Isolierung zirkulierender Tumorzellen zu entfernen.

Beginnen Sie mit der Herstellung einer einliterigen Lösung eines Erythrozytenlysepuffers mit einer Endkonzentration von 155 Millimolar Ammoniumchlorid und 10 Millimolar Triss. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 7,5 ein. Entnehmen Sie eine Aliquotprobe von etwa zwei bis vier Milliliter aus dem Vorrat, der einliterigen Mischung des Erythrozytenlysepuffers.

Fügen Sie dann einen Milliliter des roten Blutkörperchen-Lysepuffers in das Röhrchen mit dem gesammelten Buffy Coat hinzu. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens durch mehrmaliges Umstülpen. Inkubieren Sie anschließend das Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf dem Pult.

Zentrifugieren Sie die gemischten Inhalte anschließend fünf Minuten lang bei 1.167 × g. Nach der Zentrifugation erhält man ein weißliches Pellet. Entsorgen Sie das rötliche Überstandsmittel langsam und vorsichtig in 10 % Bleiche, ohne das Pellet aufzuwirbeln.

Nach dem Verwerfen des Überstandes wird das weißliche Pellet in einem Milliliter PBS gewaschen. Anschließend werden die Zellen erneut pelletiert und in vollständigem Kulturmedium resuspendiert. Die resuspendierten Zellen werden in eine Zellkulturschale gegeben und bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit Luft und 5 % Kohlendioxid inkubiert.

Erneuern Sie das Zellkulturmedium alle zwei bis drei Tage. Nach fünf bis sieben Tagen haben zirkulierende Tumorzellen an der Zellkulturschale angeheftet und mit der Proliferation begonnen. Um zu überprüfen, dass die zirkulierenden Tumorzellen des hepatozellulären Karzinoms korrekt isoliert wurden.

Führen Sie eine PCR für ein spezifisches Segment des murinen Beta-Globin-Gens durch, wie von Stu beschrieben und validiert. Anschließend immunfärben Sie die Zellen mit einem Antikörper, der spezifisch für das hepatozytenspezifische Markerprotein ist. Zyklisches AMP-reaktives Element-Bindungsprotein drei like drei unter Verwendung standardisierter Techniken; hier gezeigte Bilder sind repräsentativ für zirkulierende Tumorzellen aus zwei verschiedenen Mäusen.

In Kultur aus einem orthotopen syngenen Mausmodell des hepatozellulären Karzinoms. Metastatische Tumorzellen haften an der Kulturschale und proliferieren schnell. Sie können über 25 Passagen hinaus expandiert werden und überstehen mehrfache Einfrier- und Auftauzyklen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man zirkulierende Tumorzellen, die lebensfähig sind, isoliert und vermehrt sowie sowohl molekular als auch funktionell charakterisiert.