Isolierung und Vermehrung von zirkulierenden Tumorzellen aus einer Maus Cancer

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zirkulierende Tumorzellen aus dem Vollblut eines syngenen Maustumormodells mit hepatozellulärer Karzinommetastasierung zu isolieren und zu vermehren. Dies wird erreicht, indem zuerst das Vollblut der Mäuse zentrifugiert und das Buffy Coat isoliert wird. Als nächstes werden die roten Blutkörperchen im Buffy Coat lysiert und zirkulierende Tumorzellen in einem Pellet gesammelt.

Die Zellen werden dann gewaschen, in vollständigem Kulturmedium suspendiert und in Zellkultur vermehrt. Die schnell wachsenden Tumorzellen bleiben durch zahlreiche Passagen lebensfähig und können mit molekulardiagnostischen Standardverfahren verifiziert werden. Die Bedeutung der Isolierung von kreisenden Tumorzellen mit unserer Technik besteht darin, dass sie ein reproduzierbares Modell liefert, das für einen möglichen Einsatz in einem klinischen Umfeld optimiert werden kann.

Michelle Nadu, eine Studentin aus unserem Labor, wird das Verfahren mit mir demonstrieren, um mit der Ernte zu beginnen. Vollblut aus einem Ciea Kamau Tumormodell mit Leberzellkarzinommetastasen, wie in einem separaten J der vertikalen Zentrifuge beschrieben. Das gesammelte Vollblut bei 1.167 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Nach der Trennung in Schichten entfernen Sie die obere Plasmaschicht vorsichtig und überführen sie in ein separates 1,5-Milliliter-Rogen-freies Röhrchen für weitere Experimente, wie z. B. den Nachweis von zellfreien Nukleinsäuren. Übertragen Sie als Nächstes die Buffy-Codeschicht in ein separates 1,5-Milliliter-ROGEN-freies Röhrchen, um die Lyse der roten Blutkörperchen vorzubereiten. Dies ist notwendig, um verbleibende rote Blutkörperchen in der Buffy-Mantelschicht vor der Isolierung zirkulierender Tumorzellen zu entfernen.

Beginnen Sie mit der Zubereitung einer Ein-Liter-Lösung aus Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen mit einer Endkonzentration von 155 Millimolar Ammoniumchlorid und 10 Millimolar Triss. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 7,5 ein. Nehmen Sie etwa zwei bis vier Milliliter aliquot aus der Brühe, einen Liter Puffermischung für die Lyse roter Blutkörperchen.

Geben Sie dann einen Milliliter des Lysepuffers für rote Blutkörperchen in das Röhrchen mit dem gesammelten Buffy Coat. Mischen Sie den Inhalt der Tube, indem Sie sie mehrmals umdrehen. Dann inkubieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf der Bank.

Zentrifugieren Sie anschließend den gemischten Inhalt fünf Minuten lang. Bei 1,167 mal G nach der Zentrifugation erhält man ein weißliches Pellet. Entsorgen Sie das rötliche Supernat langsam und vorsichtig in 10%iges Bleichmittel, ohne das Pellet zu stören.

Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, waschen Sie das weißliche Pellet in einem Milliliter PBS. Pelletieren Sie die Zellen dann erneut und resuspendieren Sie sie in vollständigem Kulturmedium. Sehen Sie sich die resuspendierten Zellen in einer Zellkulturschale an und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit Luft und 5% Kohlendioxid.

Wechseln Sie das Zellkulturmedium alle zwei bis drei Tage. Nach fünf bis sieben Tagen haben sich zirkulierende Tumorzellen an der Zellkulturschale festgesetzt und beginnen sich zu vermehren. Um zu überprüfen, ob die hepatozellulären Karzinom-zirkulierenden Tumorzellen korrekt isoliert wurden.

Führen Sie eine PCR für ein bestimmtes Segment des Beta-Globin-Gens der Maus durch, wie von Stu beschrieben und validiert. Anschließend werden die Zellen mit einem Antikörper immungefärbt, der für den hepatozytenspezifischen Marker spezifisch ist. Cyclic A MP responsive element binding protein drei like three unter Verwendung von Standardtechniken, hier gezeigt sind repräsentative Bilder von zirkulierenden Tumorzellen von zwei separaten Mäusen.

In Kultur aus einem orthotopen syngenen Mausmodell des hepatozellulären Karzinoms. Metastasierungstumorzellen haften an der Schale und vermehren sich schnell. Sie können über 25 Durchgänge hinaus erweitert werden und halten wiederholten Frost-Tau-Zyklen stand.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie also ein gutes Verständnis dafür haben, wie man zirkuläre Tumorzellen, die lebensfähig sind, isoliert und vermehrt sowie sie sowohl molekular als auch funktionell charakterisiert.