Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Leukozyten aus den humanen Decidua, Baus und Decidua paral zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das menschliche Gewebe von der Plazenta aus präpariert wird. Anschließend wird das Dezidualgewebe durch mechanische Disaggregation und enzymatischen Verdau dissoziiert.

Dann wird die Zellsuspension mit einem 100-Mikrometer-Zellsieb filtriert, mit einem XPBS gewaschen und fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 300 g gefüttert, um ein Zellpellet zu erhalten. Schließlich wird die Zellsuspension auf die Dichtegradientenlösung und die Zentrifuge geladen, und die Grenzfläche, die die Leukozyten enthält, wird gesammelt. Letztendlich können isolierte Leukozyten für Immunphänotypisierungen, Zellkulturen und funktionelle Studien verwendet werden.

Der Vorteil dieser Technik im Gehirn oder bestehender Methoden, wie z. B. der mechanischen Dissoziation oder des enzymatischen Aufschlusses, besteht darin, dass sie die mechanische Entmischung des Gewebes mit einem automatischen Gewebeassoziator und den thematischen Aufschluss mit Accutane und Leukozytenisolierung unter Verwendung eines Stuhlgradienten kombiniert. Es wurde nachgewiesen, dass dieses Protokoll Zelloberflächenantigene für die Lebensfähigkeit von Zellen konserviert, und seine Implikationen erstrecken sich auf das Verständnis der funktionellen und phänotypischen Eigenschaften von infiltrierenden Leukozyten an der maternalen fetalen Grenzfläche im Zusammenhang mit der Pathogenese pränataler Komplikationen. Die Entnahme und Verwendung von menschlichen Proben zu Forschungszwecken wurde von den institutionellen Prüfungsausschüssen der Eunice Kennedy Shriver, des nationalen Instituts für Kindergesundheit und menschliche Entwicklung, der nationalen Gesundheitsinstitute, des Ministeriums für Gesundheit und soziale Dienste und der Wayne State University genehmigt.

Vor der Entnahme von Gewebeproben wurde von allen schwangeren Frauen eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Yay. Zu Beginn präparieren die Deci basilis ein Stück der Basalplatte von einem Co-Leadin der Plazenta. Legen Sie es auf ein steriles Schneidebrett mit dem Plazenta-Vli, das blutrot ist und nach oben hin behaart aussieht.

Die Basalplatte ist glatt und blassrot, während das Gewebe in einem XPBS getränkt bleibt. Verwenden Sie eine scharfe, feine Schere und Pinzette, um das Zottengewebe und die Blutgefäße zu entfernen. Sammeln Sie zwei bis drei Stücke und spülen Sie sie mit PBS gründlich ab, um das Blut zu entfernen. Um das Deci Paral zu isolieren, zerlegen Sie das 10 Zentimeter x 10 Zentimeter große quadratische Stück.

Lege es auf das Brett mit dem Corion, das Blutgerinnsel enthält und normalerweise eine hellgelbe Farbe hat, die nach oben zeigt. Verwenden Sie anschließend eine Pinzette mit feiner Spitze, um so viele Blutgerinnsel wie möglich zu entfernen. Spülen Sie dann mit einem sterilen XPBS die Membran aus, bis das PBS klar ist.

Kratzen Sie mit einem sterilen Einweg-Zellschaber und beim Aufbringen von PBS auf die Membran die Dezidualschicht vorsichtig ab. Sammeln Sie die Deci-Gewebe und legen Sie sie in ein 50-Milliliter-Plastikröhrchen mit sterilem PBS, um die Decidua Bali oder die Deci Paral mechanisch zu disaggregieren. Beginnen Sie damit, das Gewebe mit einem sterilen XPBS in einem 50-Milliliter-Röhrchen zu waschen.

Zentrifugieren Sie dann das Gewebe bei 300 g und Raumtemperatur für fünf Minuten. Saugen Sie die Schlinge vorsichtig an, ohne das Pellet zu stören. Nach der Reanimation des Gewebes und der Ablöselösung gemäß dem Textprotokoll wird das homogenisierte Gewebe in ein C-Röhrchen überführt.

Das Röhrchen wird in den automatischen Dissoziator eingelegt und das entsprechende Programm nach der Dissoziation mit einer handelsüblichen Zellablösung, wie z.B. Accutane, auf das Gewebe ausgeführt, bei 37 Grad Celsius unter leichtem Rühren 45 Minuten lang inkubiert, um es zu verdauen. Nach der Inkubation fügen Sie der Aufschlussmischung 10 Milliliter PBS hinzu und leiten Sie es durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Je nach Klebrigkeit können mehrere Siebe notwendig sein, um eine Verdauung zu belasten.

Verwenden Sie PBS, um das Röhrchen zu füllen und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 300 g und Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den S-Überstand und verwenden Sie fünf Milliliter eiskalten Faxpuffer, um das Zellpellet wieder zu suspendieren. Um mononukleäre Leukozyten zu untersuchen, geben Sie fünf Milliliter Gradientenmedium mit 20 % Dichte in ein 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen.

Dann die Zellsuspension langsam darüber legen, dabei darauf achten, dass sich die Schichten nicht vermischen. Mit einer Ausschwingrotorzentrifuge bei 500 G bei vier Grad Celsius und ohne Unterbrechung für 30 Minuten befinden sich Leukozyten in der Grenzfläche zwischen dem Dichtegradientenmedium und dem Faxpuffer. Pipettieren Sie anschließend vorsichtig die obere Schicht, die den Faxpuffer und die Zellreste enthält. Die Grenzfläche enthält die restlichen mononukleären Zellen und einen Teil der polymorphkernigen Leukozyten.

Übertragen Sie diese Schicht auf ein neues 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie mindestens drei Volumen Faxpuffer in das Röhrchen und zentrifugieren Sie es dann fünf Minuten lang bei 300 g. Um die Zellen zu gaumen, aspirieren Sie den S-Überstand und waschen Sie die Zellen ein zweites Mal mit Faxpuffer, bevor Sie die Zellkulturzellen durchführen.

Sortierung und Immunphänotypisierung gemäß dem Textprotokoll zeigt diese Abbildung eine Morphologie von isolierten Makrophagen, die von den Dezidua-Parias in einer Terminschwangerschaft mittels magnetischer Zellsortierung gesammelt wurden. Isolierte Makrophagen behalten die Fähigkeit, Zytokine nach drei Tagen Kultur freizusetzen. Die Ausbeute an lebensfähigen Zellen, die aus dem Decidua-, Baus- und Decidua-Paral isoliert wurden, wurde nach Dichtegradiententrennung bestimmt.

Unter Verwendung einer fixierbaren Viabilität, wie hier gezeigt, betrug sie mehr als 90 % für jede Deci-Zellpopulation. Hier ist die Gating-Strategie zur Analyse von polymorphkernigen und mononukleären Leukozyten innerhalb des sichtbaren Gatings dargestellt, einschließlich T-Zellen, Neutrophilen, Makrophagen, NK-Zellen, NK-T-Zellen und B-Zellen. Bei der Schwangerschaft zeigt diese Abbildung Neutrophile, Makrophagen, T-Zellen und B-Zellen aus isolierten Restzellen einer Schwangerschaft.

Schließlich sind NK-, NKT- und T-Zellen aus isolierten Restzellen aus einer Schwangerschaft in diesem Diagrammsatz dargestellt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, das Gewebe gut zu reinigen, eine Blutkontamination zu vermeiden und den Gewebe- und Enzymcocktail während des Eingriffs auf den Augen zu halten.