Name: Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Lernen Sie die Isolation von Leukozyten aus der Dezidua basalis und parietalis der menschlichen mütterlich-fetalen Schnittstelle. Diese Methode bewahrt Zelloberflächenmarker und liefert lebensfähige Zellen für Immunphänotypisierung.

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Diese Arbeit wurde von der Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und Human Development, NIH / DHHS unterstützt. Diese Arbeit wurde unterstützt, teilweise von der Wayne State University in Perinatal Initiative von Müttern, Perinatal-Kind-Gesundheit. Wir danken Maureen McGerty (Wayne State University) für ihre kritische Messwerte des Manuskripts.

Dieses Protokoll wird für Leukozyten isoliert von den Decidua basalis und Dezidua parietalis in der Vorbereitung für Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie geeignet. Weiterhin können die isolierten Zellen für die Zellsortierung, Zellkultur, RNA-Isolierung und der Zytologie verwendet werden. Vor der Arbeit mit den in diesem Protokoll genannten Proben müssen menschliche ethische Genehmigung durch die lokalen Forschungsethikkommission und Institutional Review Boards erhältlich. Die Sammlung und Nutzung der menschlichen Proben zu Forschungszwecken wurden von den Institutional Review Boards der Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health und Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Department of Health and Human Services (DHHS genehmigt , Bethesda, MD, USA) und der Wayne State University (Detroit, MI, USA). Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen schwangeren Frauen vor der Entnahme von Gewebeproben erhalten. HINWEIS: Während der Arbeit mit Tierblut, Zellen oder GefahrenGehilfen, wie in diesem Protokoll erwähnt, ist es wichtig, dass die richtige biologische Sicherheit und Laborsicherheitsmaßnahmen eingehalten werden. 1. Dissection der Menschen Deziduale Tissues HINWEIS: Die Basalplatte ist die Basis unterhalb und Plazenta befestigt und stellt die mütterliche Oberfläche. Die chorioamniotic Membranen sind das Amnion und Chorion. Die Basalplatte umfasst die Decidua basalis und das Chorion umfasst die Decidua parietalis (Abbildung 1). <ol><li> Decidua Basalis <ol><li> Sezieren ein Stück der Basalplatte von einem Keimblatt der Plazenta (1A und 1B). </li><li> Legen Sie sie auf einem sterilen Schneidebrett mit den Plazentazotten nach oben zeigt. Die Seite, die die Plazentazotten ist in der Regel blutig rot mit behaarten Gewebe in Erscheinung. Die Basalplatte ist glatt und blass in der Farbe rot. </li><li> Verwenden Sie scharfe, feine Punkt Schere und Pinzette, um die vill entfernenous Gewebe und Blutgefäße. Halten Sie das Gewebe in 1x PBS eingeweicht während des Prozesses (Abbildung 1c) (Ca 2+ - kostenlos - und Mg 2+). Sammeln Sie 2 bis 3 dieser Stücke und spülen Sie sie gründlich mit 1x PBS, das Blut (1D) zu entfernen. </li></ol></li><li> Decidua parietalis <ol><li> Sezieren ein Stück der chorioamniotic Membranen (ungefähr 10 cm x 10 cm, 1E). Legen Sie sie auf dem Brett mit dem Chorion nach oben zeigt. Das Chorion-Seite enthält blutigen Klumpen und ist in der Regel leicht gelblich gefärbt. </li><li> Verwenden Sie fein Punkt Pinzette möglichst viele der von Blutgerinnseln wie möglich (1E) zu entfernen. Spülen Sie die Membran in sterile 1x PBS, um das überschüssige Blut aus der Membran zu reinigen, bis die 1x PBS klar ist. </li><li> Verwenden Sie eine sterile Zellschaber sanft kratzen die dezidualen Schicht von der Membran. Bewerben sterile 1x PBS auf der memBrane während Abschluss dieses Prozesses (1F). Sammeln Sie die dezidualen Gewebe und legen Sie sie in einem 50 ml-Kunststoffröhrchen mit sterilem 1x PBS (1G). </li></ol></li></ol> 2. Mechanische Disaggregation und enzymatische Verdauung <ol><li> In einem 50 ml-Kunststoffrohr waschen das Gewebe aus der Dezidua basalis (aus Schritt 1.1.3) seziert oder Dezidua parietalis (aus Schritt 1.2.3) mit sterilem 1x PBS. Sammeln Gewebepellets durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min bei RT. </li><li> Saugen Sie den Überstand über dem Gewebepellet befinden vorsichtig, ohne das Pellet aufzurühren. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt werden die Pellets sehr locker, da sie rote Blutzellen enthalten. Wenn das Volumen des Pellets beträgt etwa oder weniger als 3 ml, resuspendieren das Pellet in 6 ml Zellentfernungslösung auf 37 ° C vorgewärmt. Wenn die Pellets größer als 3 ml Volumen, fügen Sie mehr Zellablösung Lösung (fügen Sie etwa 2 mal the Volumen der Gewebeproben). </li><li> Übertragen Sie die homogenisierte Gewebe (Decidua basalis + Zellablösung Lösung oder Dezidua parietalis + Zellablösung Lösung) zu einem C-Rohr. </li><li> Legen Sie das C-Rohr in der automatischen Dissociator und führen Sie das entsprechende Programm. HINWEIS: Das Programm für die Decidua basalis läuft für 17 sec mit 668 Gesamt Schuss pro Lauf. Das Programm für die Decidua parietalis läuft für 37 sec mit 235 Gesamt Schuss pro Lauf. Diese Programme wurden angepasst, um Leukozyten aus der Dezidua basalis oder der Dezidua parietalis mit guter Ausbeute und Lebensfähigkeit der Zellen zu isolieren. </li><li> Nach der mechanischen Disaggregation der Gewebe zu verdauen die Gewebe mit einer im Handel erhältlichen Zellablösung Lösung wie Accutase; (Ein Cocktail, der proteolytischen und kollagenolytische Enzyme enthält) für 45 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln. </li></ol> 3. Isolierung der Leukozyten <ol><li> Nach der Inkubation mit 10 ml 1x PBS auf die DIGElierte Gemischs und führt es durch einen 100 um Zellsieb in einen 50 ml Kunststoffrohr. In Abhängigkeit von der Klebrigkeit des Verdauungsgemisch, kann man brauchen, um mehrere Zellsiebe für eine Mischung zu verwenden. </li><li> Füllen Sie den Schlauch mit 1x PBS und Zentrifuge bei 300 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die 1x PBS über den Zellpellets sorgfältig und resuspendieren der Pellets mit 5 ml eiskaltem FACS-Puffer. HINWEIS: Um die polymorphkernigen und mononukleären Leukozyten zusammen lernen, gehen Sie zu Schritt 6.1; um die mononukleären Leukozyten zu untersuchen, gehen Sie zu Schritt 3.3. </li><li> 5 ml 20% Dichtegradientenmedien (1,077 + 0,001 g / ml) in ein 15 ml-Kunststoffrohr und langsam lagern die Zellsuspension auf der Oberseite des Dichtegradientenmedien. Während Schichtung der Probe ist es wichtig, nicht die Dichtegradientenmedien mit der Zellsuspension gemischt. </li><li> Zentrifuge mit einem Ausschwingrotor bei 500 xg für 30 min bei 4 ° C ohne Bremse. Es ist sehr wichtig, schalten Sie die Bremse, um zu vermeiden, indem die Zellen und lOsing die Steigung. Leukozyten werden in der Schnittstelle zwischen dem Dichtegradienten Medien und der FACS-Puffer gefunden werden. </li><li> Die obere Schicht, die die FACS-Puffer und Zelltrümmer enthält sehr vorsichtig mit einer Pipette. Das Band an der Schnittstelle enthält die decidual mononukleären Zellen und einen Teil der polymorphkernigen Leukozyten. </li><li> Übertragen der Zellen an der Grenzfläche vollständig auf eine neue 15-ml-Plastikröhre. Fügen mindestens 3 mal mehr Volumen FACS-Puffer. </li><li> Zentrifuge bei 300 × g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren. Den Überstand aspirieren und waschen Sie die Zellen mit FACS-Puffer. Pelletisieren der Zellen mit einem weiteren Zentrifugation bei 300 g für 5 min bei RT. HINWEIS: Um die Zellkultur durchführen, finden Sie in Schritt 4. Zum Zellsortierung durchführen, finden Sie unter Schritt 5. Um Immunphänotypisierung durchführen, finden Sie in Schritt 6. </li></ol> 4. Anwendungen - Zellkultur <ol><li> Resuspendieren der Zellen aus Schritt 3.7 in 1 ml RPMI 1640 Kulturmedium Zählen der lebensfähigen Zellen using eine automatische Zellzähler oder einer Zählkammer und Trypanblau-Lösung 0,4%. </li><li> Addieren der Menge an RPMI-Kulturmedium, um eine Zellkonzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml zu ergeben. Die Zellen sind nun bereit für Kultur. </li></ol> 5. Anwendungen - Isolierung von Makrophagen für Primärzellkultur <ol><li> CD14 + Zellen zu isolieren, magnetisch zu markieren, die Zellen aus Schritt 3.7 mit CD14 Microbeads (20 ul Perlen pro 10 7 Zellen), die Proben für 15 min bei 4 ° C und separate CD14 + Zellen aus anderen Arten von Zellen, die durch Anlegen eines Magnetfeldes. Nach 2 Waschvorgängen mit MACS-Puffer und Entfernen des Magnetfelds eluieren magnetisch gehalten CD14 + Zellen mit MACS-Puffer. </li><li> Nach der Zentrifugation resuspendieren die Zellpellets in RPMI 1640 Kulturmedium werden die Zellen bereit für die Beschichtung (2). </li></ol> 6. Anwendungen - Immunphänotypisierung <ol><li> Um die Zellen auf immunophenot verwendenyping, resuspendieren der Zellen aus Schritt 3.7 in 1 ml 1 × PBS. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen unter Verwendung eines automatischen Zellzähler oder einer Zählkammer und Trypanblau-Lösung 0,4%. </li><li> Beschriften Sie die Zellen mit einem fixierbaren Lebensfähigkeit Farbstoff (Abbildung 3). Wasche die Zellen zweimal mit FACS-Puffer und Resuspension der Zellen in Puffer Fleck. Inkubieren mit einem FcR-Blocker für 15 min bei 4 ° C. </li><li> In der extrazellulären Antikörpern gegen Fluorochrome konjugiert. Zum Beispiel wird in diesem Protokoll verwendet anti-CD3, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 und anti-CD56-Antikörpern (Tabelle 1). Inkubieren für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Nach 2 Waschvorgängen mit 1x PBS werden die Zellen in 500 ul Puffer Fleck unter Verwendung eines Durchflusszytometers analysiert. Eine Darstellung der Gating-Strategie verwendet, um die Leukozyten-Subpopulationen in der Dezidua-Geweben zu analysieren, ist in 4 gezeigt. </li></ol>

Die Autoren legen keine Interessenkonflikte offen.

Charakterisierung der funktionellen und phänotypischen Eigenschaften der Infiltration von Leukozyten im menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle ist wesentlich für das Verständnis der Immunmechanismen, um eine Schwangerschaft zu Störungen führen. Es wurden mehrere Techniken, um Leukozyten aus dem menschlichen mütterlich-fötalen Grenzfläche während der gesamten Schwangerschaft 10,14,25,28,37,42,43 isolieren beschrieben. Jedoch jede dieser Techniken unterscheidet, verwendet verschiedene Enzyme oder Enzymkomb...

Schwangerschaft wird durch drei verschiedene immunologische Phasen gekennzeichnet: 1) der Implantation und der frühen Plazentation mit einer pro-inflammatorische Reaktion verbunden (dh der Implantation ähnelt eine &quot;offene Wunde&quot;); 2) dem zweiten Trimester und das meiste des dritten Trimesters der Schwangerschaft, wenn Immunhomöostase wird durch eine überwiegend anti-entzündlichen Zustand an der mütterlich-fötalen Grenzfläche erreicht; und 3) der Geburt, einer pro-inflammatorischen Zustand 1-7. Immunzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Entzündungsreaktion an der Mutter und Fötus-Schnittstelle, wo ihre Fülle und Lokalisierung Veränderung während der Schwangerschaft 6-9. Bei Menschen, die Mutter und Fötus-Schnittstelle stellt einen Bereich des direkten Kontakts zwischen mütterlichen (decidua) und fetale (Chorion oder Trophoblast) Gewebe. Diese Schnittstelle umfasst: 1) die Decidua parietalis, die Linien der Gebärmutterhöhle nicht von der Plazenta bedeckt und in Juxtapositionauf die Chorion laeve; und 2) der Dezidua basalis, in der Basalplatte der Plazenta, wo es durch interstitielle Trophoblasten 10 (1) eingedrungen entfernt. Die Intimität dieser Kontaktbereiche schafft die Voraussetzungen für die fetale Antigen-Exposition gegenüber dem mütterlichen Immunsystem 11-13. Nicht überraschend, umfassen Leukozyten bis zu 30-40% der Deciduazellen 8,9,14,15 neben typischen Stromazellen Typzellen und Drüsenzellen 8,14,16. Die Rolle der Leukozyten bei der mütterlich-fötalen Grenzfläche umfasst mehrere Prozesse, für die Begrenzung der Trophoblastinvasion 17, Umbau von Spiralarterien 18,19, Wartung der mütterlichen Toleranz 12,20 und Initiierung der Arbeits 21-26 enthalten. Leukozyten sowohl des adaptiven und angeborenen Schenkel des Immunsystems, dh T-Zellen, Makrophagen, Neutrophilen, B-Zellen, dendritische Zellen und NK-Zellen, sind in den decidual Geweben identifiziert worden, und ihreProportionen und Aktivierungsstatus wurde gezeigt, räumlich und zeitlich während der Gestation 6-10,12,14,24,27-30 variieren. Störungen in der Leukozyten-Population und / oder Funktion sind mit Spontanabort 31, Präeklampsie 32, intrauterine Wachstumsrestriktion 32,33 und Frühgeburt 7,24 verbunden. Daher wird die Untersuchung der phänotypischen Eigenschaften und Funktionen von Leukozyten im menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle die Aufklärung der immunologischen Wege in Schwangerschaftsstörungen fehlreguliert zu erleichtern. Eine der leistungsfähigsten Werkzeuge verwendet, um den Phänotyp und funktionellen Eigenschaften der Leukozyten zu bestimmen, ist Durchflusszytometrie Technologie, die die quantitative Analyse von mehreren Parametern gleichzeitig 34-36 ermöglicht. Leukozyten durch Durchflusszytometrie analysiert, wird die Isolierung der Leukozyten in einer Einzelzellsuspension benötigt. Daher ist ein Verfahren zur Abtrennung infiltrierenden leukocytes von der Mutter und Fötus-Schnittstelle benötigt wird, um ihre phänotypischen und funktionellen Eigenschaften zu studieren. Es wurden mehrere Verfahren beschrieben worden, um Leukozyten aus dem menschlichen maternofetalen Schnittstelle 10,14,25,27,37-39 isolieren. Während einige gelten mechanische Aufschlüsselung 10,25,27,38, andere verwenden enzymatische Verdauung 37,40 für Gewebedissoziation. Da mechanische Zerlegung erzeugt eine geringere Ausbeute und verminderte Lebensfähigkeit 41 und enzymatische Dissoziation kann Lebensfähigkeit und Zelloberflächenmarker Retention 42 beeinflussen, die hier beschriebene Methode kombiniert sanfte mechanische Dissoziation mit enzymatische Vorbehandlung, die Ausbeute an isolierten Leukozyten, ohne dabei die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen. Eine ähnliche Kombination von Methoden nachgewiesen wurde als wirksam bei der Isolation von Leukozyten aus der Dezidua-Gewebe an der mütterlich-fötalen Grenzfläche 39 ist. Daher sind die hierin beschriebenen Protokoll beinhaltet mechanische Disaggregation mit einer automatischen Gewebe Dissociator, die Konsistenz erhöht und spart Zeit und Arbeit, wenn die traditionellen Fleischwolf gegenüber gegnerischen Skalpelle, Rasierklingen, oder chirurgische Scheren 10,28. Die für Gewebedissoziation gewählten Enzym war Accutase. Anders als häufig verwendete Kollagenase 43, Dispase 44 und Trypsin 45, Accutase (a Zellablösung Lösung) kombiniert sowohl allgemeine proteolytischen und kollagenolytische Aktivitäten, die für eine effiziente und dennoch schonende Dissoziation 46,47 beizutragen. Nach Dissoziation werden die Leukozyten aus der Gesamtbevölkerung der Deciduazellen durch Dichtegradientenzentrifugation angereichert. Verschiedene Dichtegradientenmedien zuvor verwendet worden, von denen die häufigsten sind Percoll (eine Suspension von kolloidalen Siliciumdioxidteilchen) 48 und Ficoll (ein Polymer aus Saccharose mit einem hohen synthetischen Molekulargewicht) 49. Die überlegene Effizienz der Trennung von der Saccharose Polymer wurde previonuierlich 50 gezeigt, und die hierin weiter beschriebenen Protokoll beweist, dass diese Dichtegradientenmedien erzeugt eine ausreichend hohe Reinheit von mononukleären Leukozyten. Daher ist das hier beschriebene Protokoll verbindet die mechanische Gewebe Disaggregation mit einer automatischen Gewebe Dissociator, enzymatische Verdauung mit einer Zellentfernungslösung und Leukozyten-Trennung mit einem Dichtegradientenmedien (1,077 + 0,001 g / ml), um Leukozyten aus menschlichen Dezidua-Gewebe zu isolieren. Dieses Protokoll ist nachgewiesen worden, Zelloberflächenantigene zusammen mit Zelllebensfähigkeit zu bewahren. Die isolierten Leukozyten kann für mehrere Anwendungen, die Immunphänotypisierung mit der Durchflusszytometrie und funktionelle Untersuchungen in vitro zählen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Dissektion</td></tr><tr><td>Sterile Dissektionswerkzeuge: chirurgische Scheren, Pinzetten und Pinzetten mit feiner Spitze&nbsp;</td><td>Beliebiger Anbieter</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td></td> <td>(1X PBS)</td></tr><tr><td>Große und kleine Petrischalen</td><td>Beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dissoziation</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td> <td>(Zellablösung)</td></tr><tr><td>Sterile 2 ml konische Safe-Lock-Röhrchen</td><td>Beliebig </td><td></td><td></td>Anbieter</tr><tr><td>50 ml konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 & Mikro; m Zellsiebe</td><td>FALCON/Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Reagenzgläser aus Polystyrol mit rundem Boden</td><td>Beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Beliebiger Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-Röhrchen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Cell Culture</td></tr><tr><td>RPMI Kulturmedium 1640&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td>(1X) (10% FBS und 1% P/S)</td></tr><tr><td>Objektträger aus Kunststoff</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Scientific Corporation</td><td>HEPA Class 100</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>ISOTEMP 110</td><td></td></tr><tr><td>Zellzähler</td><td>Nexelcom</td><td>Cellometer Auto2000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>Olympus CKX41<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Cell Separation</td></tr><tr><td>MS Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Zellseparator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu; m Vorabscheidefilter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-40</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konische Safe-Lock-Röhrchen</td><td>Beliebiger Hersteller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS-Puffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0,5 % Rinderserumalbumin, 2 mM EDTA und 1X PBS)</td></tr><tr><td colspan="4"><stark>Reagenzien</td></tr><tr><td>FcR Blockierung</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>(Fc-Block)</td></tr><tr><td>Anti-humane Zelloberflächenantigen-Antikörper&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>(Tabelle 1)</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viabilitätsfarbstoff</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix-Puffer&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>346202 FACS-Puffer</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0,1 % BSA, 0,05 % Natriumazid und 1X PBS, pH=7,4)</td></tr><tr><td>Färbepuffer</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-011</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>20% Dichtegradientenmedium (1,077 + 0,001 g/ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Zusätzliche Instrumente</td></tr><tr><td>Inkubator mit Schüttler</td><td>ThermoScientific</td><td>MAXQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>LSR-Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>SpinChron DLX</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumsystem</td><td>Beliebiger Hersteller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatischer Gewebedissoziator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>gentleMACS Dissoziator</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation von leukozyten aus dem menschlichen mutter und fötus-schnittstelle

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Schwangerschaft wird durch die Infiltration von Leukozyten in der reproduktiven Gewebe und an der Mutter und Fötus-Schnittstelle (Decidua basalis und Dezidua parietalis) gekennzeichnet. Diese Schnittstelle ist der anatomischen Stelle der Kontakt zwischen Mutter und Fetus Gewebe; es ist daher ein immunologisches Wirkort während der Schwangerschaft. Infiltrieren Leukozyten an der Mutter und Fötus Schnittstelle spielen eine zentrale Rolle bei der Implantation, Schwangerschaft Wartung, und der Zeitpunkt der Lieferung. Daher werden phänotypische und funktionelle Charakterisierung dieser Leukozyten Einblick in die Mechanismen, die zu Schwangerschaftsstörungen führen werden. Verschiedene Protokolle haben, um zu isolieren infiltrierenden Leukozyten aus der Dezidua basalis und Dezidua parietalis beschrieben; Jedoch macht der Mangel an Übereinstimmung in den Reagenzien, Enzyme und Inkubationszeiten es schwierig, diese Ergebnisse zu vergleichen. Hierin wird ein neuartiger Ansatz, der die Verwendung von sanften mechanischen und enzymatischen diss kombiniertereinigung Techniken, um die Lebensfähigkeit und Integrität der extra- und intrazellulären Markern in Leukozyten aus den menschlichen Geweben an der Mutter und Fötus-Schnittstelle getrennt zu bewahren. Abgesehen von Immunphänotypisierung, Zellkultur und Zellsortierung, die zukünftige Anwendungen dieses Protokolls sind zahlreich und vielfältig. Nach diesem Protokoll können die isolierten Leukozyten verwendet werden, um DNA-Methylierung, die Expression von Zielgenen, in vitro Leukozyten Funktionalität (dh die Phagozytose, Zytotoxizität, T-Zellproliferation und Plastizität, etc.), und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies zu bestimmen an der Mutter und Fötus-Schnittstelle. Zusätzlich mit dem beschriebenen Protokoll wurde dieses Labor in der Lage, neue und seltene Leukozyten an der Mutter und Fötus-Schnittstelle zu beschreiben.

. Die Präparation von menschlichen Geweben auf der mütterlich-fötalen Grenzfläche (Dezidua basalis und Dezidua parietalis) ist in Abbildung 1 dargestellt Dieses Verfahren umfasst die Präparation der Grundplatte, die Decidua basalis (1A - D) enthält. Decidua basalis wird durch Entfernen des Plazentazotten (fötales Seite) von der basalen Platte (1C) erhalten. Decidua parietalis wird durch leichtes Abkratzen der Chorionmembran (1E - <stron...

Hierin wird ein Protokoll zur Isolierung und weiteren Untersuchung der infiltrierenden Leukozyten der Decidua basalis und der Decidua parietalis - der menschlichen mütterlich-fetalen Schnittstelle - beschrieben. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität der Zelloberflächenmarker und liefert genügend lebensfähige Zellen für nachgelagerte Anwendungen, wie die Durchflusszytometrie-Analyse beweist.

Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Leukozyten aus dem menschlichen Decidua, Baus und Decidua paral zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die menschlichen Dee-Gewebe von der Plazenta disseziert werden. Anschließend wird das Deciduagewebe durch mechanische Disaggregation und enzymatische Verdauung dissoziiert.Anschließend wird die Zellsuspension durch einen 100-Mikrometer-Zellsieb filtriert, mit einem XPBS gewaschen und fünf Minuten bei vier Grad Celsius mit 300 × g zentrifugiert, um ein Zellpellet zu erhalten. Schließlich wird die Zellsuspension auf die Dichtegradientenlösung aufgeschichtet, zentrifugiert, und die Schnittstelle, die Leukozyten enthält, wird gesammelt. Letztendlich können die isolierten Leukozyten für Immunphänotypisierung, Zellkultur und funktionelle Untersuchungen verwendet werden.Der Vorteil dieser Technik oder bestehender Methoden, wie mechanischer Dissoziation oder enzymatischer Verdauung, für das Gehirn liegt darin, dass sie die mechanische Gewebeentmischung mit einem automatischen Gewebeassoziator und einer thematischen Verdauung mit Accutase sowie die Leukozytenisolierung mittels Dichtegradient verbindet. Dieses Protokoll hat sich als wirksam erwiesen, um die Antigene der Zelloberfläche sowie die Zellviabilität zu erhalten, und seine Bedeutung reicht bis zur Aufklärung der funktionellen und phänotypischen Eigenschaften infiltrierender Leukozyten an der mütterlichen fetalen Grenzfläche im Zusammenhang mit der Pathogenese pränataler Komplikationen. Die Sammlung und Nutzung menschlicher Proben zu Forschungszwecken wurde von den institutionellen Ethikkommissionen der Eunice Kennedy Shriver, des National Institute of Child Health and Human Development, der National Institutes of Health, des Department of Health and Human Services sowie der Wayne State University genehmigt.Schriftliche, informierte Einwilligung wurde von allen schwangeren Frauen vor der Entnahme von Gewebeproben eingeholt. Zunächst dissecieren Sie eine Probe der Basalplatte von einem Kotyledon der Plazenta. Legen Sie sie auf ein steriles Schneidebrett mit der plazentaren Oberfläche, die blutrot und haarartig erscheint, nach oben weisend.Die Basalplatte ist glatt und blassrot gefärbt. Während das Gewebe in 1x PBS eingeweicht bleibt, mit scharfen feinen Scheren und einer Pinzette das villöse Gewebe und die Blutgefäße entfernen. Zwei bis drei Stücke sammeln und mit PBS gründlich spülen, um das Blut zu entfernen. Um das dezi-duale Gewebe zu isolieren, das 10 cm × 10 cm große quadratische Stück präparieren.Platzieren Sie es mit dem Korion, das Blutgerinnsel enth&auml;lt und normalerweise hellgelb ist, nach oben gerichtet auf das Board. Entfernen Sie anschlie&szlig;end mit feinen Pinzetten so viele Blutgerinnsel wie m&ouml;glich. Sp&uuml;len Sie dann die Membran mit steriler 1x PBS, bis die PBS-L&ouml;sung klar abl&auml;uft.Unter Verwendung eines sterilen Einweg-Zellkratzers und gleichzeitigem Aufbringen von PBS auf die Membran vorsichtig die deziduale Schicht abkratzen. Sammeln Sie die Dezidagewebe und geben Sie sie in ein 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen mit steriler PBS, um die Dezidua Bali oder die deci paral mechanisch zu dissoziieren. Beginnen Sie damit, das Gewebe in einem 50-Milliliter-Röhrchen mit steriler 1×PBS zu waschen.Anschließend die Gewebeprobe bei 300 G und Raumtemperatur fünf Minuten lang zentrifugieren. Vorsichtig den Überstand abpipettieren, ohne den Pellet zu stören. Danach das Gewebe in Abhängigkeit von der Textprotokollanweisung resuspendieren und die Detachierungslösung hinzufügen, anschließend das homogenisierte Gewebe in eine C-Schläuche überführen.Stellen Sie das Röhrchen in den automatischen Disaggregierer und führen Sie das entsprechende Programm nach der Dissoziation mit einer im Handel erhältlichen Zellablösungslösung, wie beispielsweise Accutase, an den Geweben durch. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln für 45 Minuten, um die Probe aufzuschließen. Fügen Sie nach der Inkubation 10 Milliliter PBS zu der Verdauungsmischung hinzu und filtrieren Sie diese durch einen 100-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Abhängig von der Viskosität können mehrere Siebe erforderlich sein, um eine einzige Verdauungslösung vollständig zu filtrieren.Füllen Sie das Röhrchen mit PBS und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 300 G und Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig das Überstand-Supernatant und resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Milliliter eiskaltem Fax-Puffer. Um mononukleäre Leukozyten zu untersuchen, geben Sie fünf Milliliter 20%-Dichtegradientenmedium in ein 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen.Dann langsam die Zellsuspension vorsichtig obenauf aufschichten, wobei darauf geachtet werden muss, dass sich die Schichten nicht vermischen, und Zentrifugation mit einem Schwenkrotor bei 500 G und vier Grad Celsius ohne Bremse für 30 Minuten; die Leukozyten befinden sich anschließend an der Grenzfläche zwischen dem Dichtegradientenmedium und dem Fax-Puffer. Danach vorsichtig die obere Schicht, die den Fax-Puffer und Zelltrümmer enthält, abpipettieren. An der Grenzfläche befinden sich die verbleibenden mononukleären Zellen sowie ein Teil der polymorphkernigen Leukozyten.Überführen Sie diese Schicht in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie mindestens drei Volumina Fax-Puffer zum Röhrchen hinzu und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 300 ×g. Um die Zellen zu pelletieren, aspirationsieren Sie das überstehende S-Supernatant und waschen Sie die Zellen ein zweites Mal mit Fax-Puffer, bevor Sie die Zellkultur durchführen.Sortierung und Immunphänotypisierung gemäß dem Textprotokoll: Diese Abbildung zeigt die Morphologie isolierter Makrophagen, die aus der Decidua parietalis einer Schwangerschaft im Termin mithilfe der magnetischen Zellsortierung gewonnen wurden. Die isolierten Makrophagen behalten nach drei Tagen Kultur die Fähigkeit zur Freisetzung von Zytokinen bei. Die Ausbeute an lebensfähigen Zellen, die aus der Decidua, baus und Decidua paral isoliert wurden, wurde nach der Dichtegradientenseparation bestimmt.Unter Verwendung eines fixierbaren Vitalitätsnachweises, wie hier gezeigt, lag die Vitalität bei über 90 % für jede Dezizellpopulation. Dargestellt ist hier die Gating-Strategie zur Analyse polymorphonukleärer und mononukleärer Leukozyten innerhalb des sichtbaren Gatings, einschließlich T-Zellen, Neutrophilen, Makrophagen, NK-Zellen, NK-T-Zellen und B-Zellen. Bei einem Schwangerschaftsende zeigt diese Abbildung Neutrophile, Makrophagen, T-Zellen und B-Zellen aus isolierten Restzellen einer Schwangerschaft am Ende der Tragzeit.Abschließend werden NK-, NKT- und T-Zellen aus isolierten Restzellen einer voll ausgetragenen Schwangerschaft in diesem Satz von Diagrammen dargestellt. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie in drei Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das Gewebe gründlich zu reinigen, eine Kontamination mit Blut zu vermeiden und das Gewebe sowie die Enzymcocktails stets im Auge zu behalten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Ein schnelles Verfahren zur Infiltration von Leukozyten aus dem murinen Gehirns zu erhalten, ist beschrieben. Diese Methode verwendet einen kontinuierlichen und diskontinuierlichen Percoll-Gradienten Ficollgradienten auszuwählen und zu reinigen, die Leukocyten-angereicherte Schicht. Isolierte Leukozyten kann dann durch durchflusszytometrische Messungen charakterisiert werden.

Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung Teilmengen von Vorläufer-B-Zellen aus Nabelschnurblut. Ein ausreichender Menge und Qualität von Nukleinsäuren können aus den Zellen extrahiert werden und in nachfolgenden Assays DNA oder RNA.

Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

Hierin wird ein Protokoll zur Isolierung und Analyse der infiltrierenden Leukozyten von Geweben an der mütterlich-fetalen Grenzfläche (Uterus, Dezidua und Plazenta) von Mäusen beschrieben. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität der meisten Zelloberflächenmarker und liefert genügend lebensfähige Zellen für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich Durchflusszytometrie-Analysen.

Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Hier beschreiben wir Verfahren zur Präparation von fetalen und mütterlichen Geweben aus menschlichen Plazenta, gefolgt von der Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stromazellen (MSC) aus diesen Geweben.

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Eine einfache Methode, primäre menschliche Plazenta (Villi) und dezidualen Organkulturen zu etablieren beschrieben. Villöse und dezidualen Organkulturen sind wertvolle Werkzeuge Pathogenese an der menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle für das Studium. Eine Infektion mit dem Bakterium fakultativ intrazellulären Listeria monocytogenes nachgewiesen wird .

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

Hier stellen wir ein Protokoll für die Präparation der menschlichen Nabelschnur (UC) und fetaler placenta Probe in Kord Belages (CL), Wharton-Sulze (WJ), Cord-Plazenta-Übergang (CPJ) und fetale Plazenta (FP) für die Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs), um die Explantation Kultur-Technik.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

Dieses Protokoll zeigt eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen deziduale Zellen gesammelt von den fetalen Membranen der Begriff plazentas, die für eine Vielzahl von Anwendungen (z. B. Immunocytochemistry, Durchflusszytometrie, etc.) verwendet werden können mit dem Ziel zur Untersuchung der Rolle von verschiedenen Zell-Populationen in Komplikationen während der Schwangerschaft.

Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas

Muttermilch überträgt das humane Immundefizienzvirus (HIV), obwohl sich nur 15 % der säuglingsgestillten Säuglinge, die von HIV-infizierten Müttern gestillt werden, anstecken. Gestillte Säuglinge nehmen täglich 105bis 108 mütterliche Leukozyten auf, obwohl diese Zellen unteruntersucht sind. Hier beschreiben wir die Isolierung von Muttermilchleukozyten und eine Analyse ihrer phagozytischen Kapazität.

Isolierung von Leukozyten aus menschlicher Muttermilch zur Verwendung in einem antikörperabhängigen zellulären Phagozytose-Assay von HIV-Zielen

Dies ist eine Methode, um uteruslymphoide Zellen sowohl von schwangeren als auch von nicht schwangeren Mäusen zu isolieren. Diese Methode kann für mehrere nachgelagerte Anwendungen wie FACS-Phänotypisierung, Zellsortierung, funktionelle Assays, RNA-seq und Proteomik verwendet werden. Das Protokoll hier zeigt, wie man angeborene lymphatische Zellen der Gruppe 1 durch Durchflusszytometrie phänotypisiert.

Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gebärmutter zur Analyse mittels Durchflusszytometrie

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung lebender immuner und nicht-immuner Populationen aus der Lunge von Mäusen in einem stabilen Zustand und nach einer Influenzainfektion. Es bietet auch Gating-Strategien zur Identifizierung von epithelialen und myeloischen Zelluntergruppen.

Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

Dieses Protokoll ermöglicht die Reinigung, Charakterisierung und Kultivierung primärer HLA-G+-extravillöser Trophoblasten (EVT) aus der Decidua basalis und der chorionischen Membran menschlicher Term-Plazentas. Primäre EVT-Kulturen erhalten die Lebensfähigkeit 96 Stunden lang aufrecht, was eine Kokultivierung mit probengematchten mütterlichen Immunzellen sowie eine anschließende zytometrische und molekulare Analyse ihrer Interaktionen ermöglicht.

Reinigung von HLA-G+ -Extravillen-Trophoblasten aus menschlichen Term-Plazentageweben für Phänotypisierung und funktionelle Analyse

Lernen Sie die Isolation von Leukozyten aus der Dezidua basalis und parietalis der menschlichen mütterlich-fetalen Schnittstelle. Diese Methode bewahrt Zelloberflächenmarker und liefert lebensfähige Zellen für Immunphänotypisierung.

Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

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