Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die infiltrierenden Leukozyten der murinen maternalen fetalen Schnittstelle zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zuerst die Gebärmutter, die Plazenta und die EUA entnommen werden. Der Abbau des Gewebes erfolgt durch mechanische Dissoziation in einer enzymatischen Lösung, gefolgt von einem anschließenden enzymatischen Aufschluss.

Die resultierende Zellsuspension wird dann filtriert und gewaschen, woraufhin die interessierenden Immunzellen durch einen fötalen Rinderserumgradienten von Zelltrümmern, wie z. B. nicht lebensfähigen Zellen, getrennt werden. Letztlich können die isolierten Leukozyten für die Immunphänotypisierung, Zellkultur oder Zellsortierung verwendet werden. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir versuchten, ein Protokoll für die Isolierung von Leukozyten aus der maternalen fetalen Schnittstelle zu etablieren, und wir stellten fest, dass die veröffentlichten Methoden die Isolierung der seltenen Immunzellen, die für uns von Interesse sind, nicht erleichterten.

Eine Demonstration Das Verfahren wird von Mile El Sanchez Rodriguez und Marcina Hernandez durchgeführt, die wissenschaftliche Mitarbeiter meines Labors sind. Um das mütterliche Grenzflächengewebe des Fötus zu sammeln, beginnen Sie mit einer sterilen chirurgischen Schere, um den unteren Bauchteil der Haut und das Muskelgewebe vollständig zu entfernen. Schieben Sie dann mit einer Pinzette alle anderen Organe zur Seite, bis die Gebärmutter und die Eierstöcke sichtbar sind. Bewegen Sie dann die Gebärmutter aus der Bauchhöhle heraus.

Lokalisieren Sie die Eierstöcke distal der UCT und den uterotubalen Übergang jedes Uterushorns. Machen Sie dann einen Schnitt am Übergang der Gebärmuttertuben, um die Hörner von dem Mesentar zu trennen, das die Gebärmuttergefäße enthält. Exzisierung am Gebärmutterhals, um die Gebärmutterhörner von der Bauchhöhle zu lösen.

Machen Sie dann mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt zwischen dem Gebärmutterhals und dem unteren Segment der Hörner, wobei ein Teil des Gebärmutterhalses befestigt bleibt, um eine Öffnung des Gebärmutterhorns zu vermeiden. Tauchen Sie die Hörner und den Gebärmutterhals in eine große Petrischale, die mit 10 bis 15 Millilitern PBS gefüllt ist, um die Implantationsstellen mit Feuchtigkeit zu versorgen. Schneiden Sie jegliches Fett aus dem Gewebe ab.

Dann halten Sie die Hörner mit der Pinzette an Ort und Stelle. Machen Sie einen Querschnitt durch einen Interimplantationsbereich, um eine der Implantationsstellen aus der Gebärmutter zu entfernen. Halten Sie nun die Stelle an Ort und Stelle und machen Sie einen kleinen Schnitt in der Gebärmutterwand, die an das Plazenta- und Restgewebe angrenzt.

Schneiden Sie um den Umfang der Plazenta und der Dezidua herum, bis sich das Gewebe sowohl von der Gebärmutterwand als auch von der Choriotoic-Membran getrennt hat. Übertragen Sie dann die Plazenta und das daran befestigte Dezidualgewebe in eine frische Petrischale, die drei bis fünf Milliliter PBS enthält. Übertragen Sie den Fötus mit PBS in eine andere Petrischale und ziehen Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze das weiß-graue Deci-Gewebe vorsichtig von der Plazentaoberfläche ab.

Darauf zu achten, dass die Integrität des Plazenta- und ECI-Gewebes erhalten bleibt. Teilen Sie die Plazenta und das ECI-Gewebe in zwei einzeln beschriftete Petrischalen auf, die mit PBS gefüllt sind. Entfernen Sie dann mit der Pinzette mit feiner Spitze vorsichtig die Gebärmutterwand der Chorio-Allen-Toic-Membran und legen Sie dieses Gebärmuttergewebe in eine neue, mit PBS gefüllte Petrischale, um das Gewebe mechanisch zu dissoziieren.

Übertragen Sie als nächstes zwei 100 bis 150 Milligramm des Uterus-Disci- und Plazentagewebes und einzeln beschriftete zwei konische Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter kalte enzymatische Lösung in jedes Röhrchen. Verwenden Sie dann eine sterile Schere, um jedes der Gewebe nicht länger als zwei Minuten mechanisch zu dissoziieren, bis die Suspensionen vorhanden sind.

Entwickeln Sie ein milchiges Aussehen. Fügen Sie weitere 500 Mikroliter kalte enzymatische Lösung hinzu, einen in jedes Röhrchen, und legen Sie die Röhrchen auf Eis. Inkubieren Sie dann das gesamte Gewebe bei 37 Grad Celsius mit einer sanften orbitalen Bewegung bei 80 U/min und legen Sie die Röhrchen nach 30 bis 35 Minuten auf Eis, um die Verdauung zu stoppen.

Seihen Sie nun jede Gewebeaufschlämmung durch ein 100-Mikron-Sieb in einzeln beschriftete konische 50-Milliliter-Röhrchen ab und waschen Sie jeweils zwei Milliliter Röhrchen und Sieb zwei- bis dreimal mit 20 Millilitern PBS, um alle Zellen zu sammeln. Wenn alle Zellen filtriert sind, schleudern Sie sie herunter und saugen Sie das SUP-Natin vorsichtig an, ohne die Pellets zu stören. Suspendieren Sie die isolierten Leukozyten und Stromazellen vorsichtig in einem Milliliter RPMI-Kultur, Medium ohne Vortexing.

Geben Sie dann für jedes Gewebe 500 Mikroliter fötales Rinderserum in ein Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen und überlagern Sie die Zellsuspension langsam mit dem Serum. Schließlich, wenn alle Zellen überlagert wurden, zentrieren Sie die Zellen ohne Unterbrechung und aspirieren Sie das Supinat, ohne die Zellpellets zu berühren. In diesen Bildern zeigt sich die Morphologie von F vier 80 positiven Makrophagen, die aus Dezid- und Uterusgewebe isoliert wurden.

16,5 Tage post coum werden Zellen sowohl aus mütterlichem als auch aus fetalem Grenzflächengewebe gezeigt. Sie weisen nach der Isolierung durch diese Methode eine Lebensfähigkeit von mehr als 70 % auf und enthalten neutrophile Makrophagen-, T-Zell-, NK-Zell- und dendritische Zellpopulationen mit einem hohen Anteil an Makrophagen, die Coex CD 11 C-Leukozyten-Subpopulationen exprimieren, die aus Geweben an der Schnittstelle zwischen Spiegel und mütterlichem Fötus isoliert wurden. Zu den ebenfalls gehörenden B-Zellen und CD gehören vier positive T-Zellen, CD acht positive T-Zellen und CD drei positive CD vier negative CD acht negative T-Zellen sind ebenfalls isoliert, wie in diesem Dichtediagramm beobachtet.

Okay, wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Gewebe und den Enzymcocktail auf Eis zu halten, um die richtige Temperatur im Inkubator einzustellen und Ihr Gewebe während der Verdauung nach diesem Verfahren nicht zu stark zu manipulieren. Andere Methoden wie Immunphänotypisierung, Zellkultur, Zellsortierung und D-N-A-R-N-A-Isolierung können durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die infiltrierenden Leukozyten an der maternalen fetalen Grenzfläche, der Gebärmutter, der Gebärmutter und der Plazenta isolieren können.