Spot the Correct Tissue Every Time in Multi-Gewebe-Blöcke

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Werkzeug zu konstruieren, das die Gewebeidentifizierung in Paraffinblöcken mit mehreren Geweben unterstützt. Dies wird erreicht, indem zunächst HistoGel mit Gewebemarkierungsfarbstoff kombiniert wird, um einen hellfarbigen Gelpfropfen zu bilden. Der zweite Schritt besteht darin, die farbigen HistoGel-Plugs nach den üblichen Gewebeverarbeitungs- und Einbettungstechniken zu verarbeiten und einzubetten.

Als nächstes wird ein Biopsiestanzer verwendet, um die kleinen Zylinder zu entfernen. Dabei handelt es sich um Probenausrichtungsmarkierungen oder Spots. Der letzte Schritt besteht darin, den Spot in einen Mehrgewebeblock einzubetten, wobei die Position des Spots und jede Probe sorgfältig dokumentiert werden, um eine einfache Referenz zu ermöglichen.

Letztendlich bietet der Spot einen klaren visuellen Hinweis für die Probenorientierung und -identifizierung in Gewebe-Microarrays und Multigewebeblöcken. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Nähten oder asymmetrischen Kernen besteht darin, dass der Spot das Gewebe nicht verändert und Flexibilität bei der Anordnung der Proben für eine optimale Analyse ermöglicht. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir Anfragen von Forschern erhielten, Gewebeproben von mehreren Tieren in einem einzigen Paraffinblock zu kombinieren, um Geld zu sparen und die Analyse zu vereinfachen: Um die Spots vorzubereiten, beginnen Sie mit der Zugabe von 50 Milligramm biochemischem BSA zu einem Milliliter Gewebemarkierungsfarbstoff in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen.

Wirbeln Sie die Mischung mindestens eine Minute lang, bis sie sich vollständig aufgelöst hat. Laden Sie anschließend neun Milliliter Hydroxyethyl-Arous-Verarbeitungsgel in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und erhitzen Sie es in einer Mikrowelle bei 30 % Leistung. Pulsieren Sie die Hitze in Zehn-Sekunden-Schritten, bis das Gel vollständig geschmolzen ist.

Mischen Sie nun das geschmolzene Verarbeitungsgel und die Farbstoff-BSA-Lösung in einem einzigen konischen 15-Milliliter-Röhrchen und mischen Sie es gründlich mit einer Pipette. Dann die Lösung verwirbeln und für einige Stunden in einen Kühlschrank stellen, damit sie sich verfestigt. Nach dem Aushärten entfernen Sie die feste Dilatation im Gel, indem Sie sie vorsichtig mit einem schmalen Spatel lösen.

Schneiden Sie den Plug in fünf Millimeter dicke Abschnitte. Verwenden Sie nicht die abgerundeten Enden. Übertragen Sie drei bis sechs Schnitte in eine Histologiekassette und tauchen Sie sie in 70%iges Ethanol, wechseln Sie die 70%ige Ethanollösung alle zwei bis vier Stunden und mindestens dreimal über 24 Stunden, bis die Pfropfen vollständig dehydriert sind.

Sie laugen einen Teil des Markierungsfarbstoffs in die Ethanollösung aus. Die Verwendung von frischem Ethanol hilft zunächst, einen Teil des überschüssigen Farbstoffs auszuspülen, was zu einem saubereren Pfropfen führt, der weniger wahrscheinlich Farbe auslaugt. Übertragen Sie anschließend die Kassetten in jedem Bad eine Stunde lang auf 80 % Ethanol und dann auf 95 % Ethanol.

Der Farbstoff kann aus dem Gelstopfen austreten, was andere Gewebe und die flüssigen Reagenzien in einem automatisierten Gewebeprozessor beeinträchtigen könnte. Daher wird eine manuelle Dehydrierung dringend empfohlen. Die automatisierte Verarbeitung ist jedoch ebenso effektiv.

Beenden Sie die Dehydrierung mit drei Wäschen in 100 % Ethanol für jeweils eine Stunde. Die Proben werden durch dreimaliges Eintauchen in Kohlenwasserstoffe oder Xylole für eine Stunde in jedem Bad gereinigt. Infiltrieren Sie nun die Abschnitte mit drei einstündigen Bädern.

In geschmolzenem Paraffin. Betten Sie die bearbeiteten Abschnitte wie gewohnt ein, und wenn der Block Raumtemperatur hat, verwenden Sie eine dermale Punch-Nadel, um Punktkerne herzustellen. Aus einem Block können 22-Millimeter-Kerne oder sogar mehr 1,5-Millimeter-Kerne hergestellt werden.

Beginnen Sie mit der Erstellung eines Diagramms, in dem Sie die gewünschten Positionen und Identitäten aller einzelnen Gewebestücke, die zusammen eingebettet werden sollen, sowie die Position des Flecks angeben. Bereiten Sie ein Exemplar vor, um es griffbereit zu haben. Für den erfolgreichen Einsatz von Probenorientierungsmarkierungen ist eine klare und leicht verständliche Karte der Bioproben erforderlich, auf der alle Bioproben genau aufgeführt sind: ihre Position und ihre Position relativ zum Fleck.

Nach der Verarbeitung ordnen Sie die Tissue-Stücke auf der Einbettstation an. Laut dem Gewebeorientierungsdiagramm ist die korrekte Ausrichtung absolut entscheidend. Es ist auch wichtig, dass der Spot-Kern höher ist als alle Gewebestücke, die in den Block eingebettet werden.

Nachdem Sie die Gewebeanordnung abgeschlossen haben, betten Sie die Flecken ein. Halten Sie jede Stelle mit einer Pinzette aufrecht, bis sich das Paraffin verfestigt hat, damit es nicht umkippt. Ein oder zwei Minuten sollten ausreichen.

Füllen Sie für ein manuelles TMA-Kit die TMA-Form mit geschmolzenem Paraffin. Während die Form abkühlt, befestigen Sie die Spots auf ähnliche Weise an den Rändern der Anordnung. Teilen Sie nun die Abschnitte ab und färben Sie sie mit dem Fleck an.

Mit einem Standardansatz werden hier Fünf-Mikrometer-Abschnitte hergestellt. Um die Abschnitte auf Objektträger zu legen, lassen Sie sie in einem 40 Grad Celsius warmen Wasserbad schwimmen und übertragen Sie sie dann auf positiv geladene Glasobjektträger. Sobald Sie sie an den Objektträgern befestigt haben, trocknen Sie sie mindestens 20 Minuten lang bei 60 Grad Celsius.

Die Objektträger können nun manuell oder auf einer automatisierten Färbeanlage gefärbt werden. Für die routinemäßige h- und d-Färbung erschienen spezielle Färbungen oder immunohistochemische Flecken als runde, hell gefärbte Flecken. im Paraffinblock und in allen Paraffinsektionen.

Spots ermöglichten eine einfache Orientierung und Gewebeidentifizierung in Mehrgewebeblöcken, die ähnlich aussehende Gewebe von verschiedenen Individuen und Behandlungsgruppen enthielten. Bei der Verwendung in einem Gewebe ermöglichten Microarray-Spots, dass jeder Kern für wertvolle Gewebeproben verwendet werden konnte, und Spots konnten leicht neben einem Gewebe-Microarray-Kern ausgewählt werden. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass eine genaue und klare Dokumentation der Bioprobe und des Flecks im Block entscheidend für ihre erfolgreiche Verwendung ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Probenorientierungsetikett einfach erstellen und als Hilfe zur Gewebeidentifizierung in Paraffinblöcken aus mehreren Geweben verwenden können.