Name: Generation of Local CA1 γ Schwingungen durch tetanische Stimulation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Präparation von Hirnschnitten zur Aufzeichnung von Gamma-Oszillationen im CA1-Bereich. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Erregbarkeit und die Analyse von Arzneimittelwirkungen auf Netzwerkfunktionen.

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Unterstützt von APA an RJH, NHMRC-Programmzuschuss 400121 an SP und NMHRC-Stipendium 1005050 an SP. CAR bedankt sich für die Unterstützung des ARC (FT0990628) und des DOWD-Stipendienprogramms. Das Florey Institute of Neuroscience and Mental Health wird von Infrastrukturfonds der Regierung des Bundesstaates Victoria unterstützt.

Alle Experimente an Mäusen wurden durch die Florey Institute Tierethikkommission genehmigt. 1. Einrichtung zum Schneiden Hirnschnitten <ol><li> Vorbereitung einer von (mM) 125 Cholin-Cl, 2,5 KCl, 0,4 CaCl 2, 6 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3 umfasst Schneidmittel, 20 D-Glucose mit Carbogen Gas (95% O 2 -5 gesättigten % CO 2) und ein künstlicher Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) Aufnahmelösung (mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3 enthielt, 10 D-Glucose, mit gesättigter Carbogen. Legen Sie die Schnittlösung auf Eis, um sie kalt zu halten. </li><li> Frieren Sie ca. 400 ml des Schneid Lösung und Mischung zusammen mit 100 ml nicht gefrorenen Schneidelösung, um ein Eisbrei erstellen. Blase mit Carbogen (95% O 2 -5% CO 2) bei einem Fluss von etwa 0,5 L / min durch kleine cAliber Schlauch oder Sinterglas, um einen stetigen, aber sanfte Strömung von Luftblasen zu produzieren. </li><li> Bereiten ein 250 ml Becherglas mit einem erhöhten Nylongewebeeinlage, auf der die Gehirnscheiben platziert wird. Füllen Sie mit aCSF, um das Netz um etwa 2 cm und Blase mit Carbogen abdecken, um sicherzustellen, dass die Blasen nicht unmittelbar die Scheibe Haltebereich stören. Es ist auch wichtig, dass sich keine Luftblasen in der Nylon-Mesh, also, wenn irgendeine vorhanden entfernen. Dies wird die Haltekammer und bei RT gehalten (20 - 25 ° C). </li><li> Layout Das Sezieren Instrumente, darunter eine große Schere, eine kleine Schere, kleine und große Mikro Spatel, und große und kleine Paare von Zangen und entspannen sie auf Eis. Legen Sie die Vibratom Gewebeschneiden Block auf Eis auf einem quadratischen Aluminiumfolie. Erhalten 2 Stück 6 cm Filterpapier, eine einzige Rasierklinge und einem 25-ml-Becher mit dem Schneid Lösungsaufschlämmung gefüllt als auch. </li><li> Füllen Sie einen zweiten Behälter mit Eis, und legen ein Stück Gewebe paper auf dem Eis und legen Sie eine 12 cm Kulturschale an der Spitze. Füllen Sie die Kulturschale mit Schnittlösung Eisbrei und Blase mit Carbogen. Dies ist der Container, in dem das Gehirn Dissektion durchgeführt werden. </li><li> Bereiten Sie die Vibratom. Entfernen Sie einen neuen zweischneidiges Rasierklinge (verwenden Sie eine frische Klinge jedes Mal) aus der Verpackung und Spray mit 80% Ethanol dann deionisiertes Wasser. Schneiden Sie ein 3-ml-Plastiktransferpipette an dem Punkt, wo es beginnt zu verjüngen. Dies wird verwendet, um Gehirnscheiben zu übertragen. Biege einen 27 G-Nadel an der Basis etwa 45 ° und heften sich an einer 1 ml-Spritze. Dies wird verwendet, um Scheiben beim Schneiden zu manipulieren. </li></ol> 2. Schneiden Hirnschnitten <ol><li> Betäuben eine Maus (P16 - P18) mit 2% Isofluran oder einer lokal zugelassenen Methode. Nach der Induktion, enthaupten, das Tier mit einem großen Schere und Tropfen den Kopf in den 12 cm Kulturschale, die mit Bläschen Schneid Lösungsaufschlämmung enthält. Der Schlamm muss völlig den Kopf eintauchen fürschnelle Abkühlung. </li><li> Halten Sie die Vorderseite des Kopfes mit einer Hand Peeling die Haut und Bindegewebe nach vorn in Richtung der Nase. Mit den kleinen Schere das Bindegewebe die zugrunde liegende Schädel zu offenbaren. Dann entfernen Sie die Muskeln überlagert dorsalen Aspekt der Schädel und Hals. </li><li> Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel durch erste Sicherung der Vorderseite des Schädel mit den großen Zange und dann zwei seitliche Schnitte durch den Knochen auf beiden Seiten des Foramen magnum mit den kleinen Schere (Abbildung 1, Schnitte mit A1 und A2). <ol><li> Eine weitere Schnitt zwischen den Augen (nur Front des Bregma) (Abbildung 1, geschnitten mit B) vorsichtig entlang der Pfeilnaht geschnitten vorne und beziehen sich auf die Schnittschädelabschnitte, um das Gehirn (Abbildung 1, schneiden markierten C) zu offenbaren. </li><li> Verwenden Sie den kleinen Spatel, um auf einer Kulturschale schaufelt aus dem Gehirn und den Ort. Seien Sie sich der cranial Nerven auf dem Unterrand des Gehirns die müssen getrennt werden, kann dies unter Verwendung der kleineren Mikro Spachtel erfolgen. Mit den größeren Spachtel übertragen das Gehirn, um die 25-ml-Becher mit dem Schneid Lösungsaufschlämmung gefüllt. </li></ol></li><li> Vorbereiten des Gehirnhälfte zum Schneiden. <ol><li> Legen Sie ein Stück der 6 cm Filterpapier in den Boden einer frischen Kulturschale dann mit frischen Schnitt Lösungsaufschlämmung und Blase zu füllen. Verwenden Sie den größeren Spachtel, um das Gehirn, Bauchseite nach unten zu positionieren, auf das Filterpapier. Nehmen Sie eine neue und gereinigt einzigen Rasierklinge und schneiden Sie das Gehirn, um das Kleinhirn zu entfernen, dann ein Schnitt entlang der Mittellinie, um das Gehirn in zwei Hemisphären zu trennen. </li></ol></li><li> Vorbereiten des Vibratom Gewebeblock. <ol><li> Nehmen Sie die gekühlte Vibratom Gewebeblock, trocknen Sie die Oberfläche, und einen Tropfen Sekundenkleber in der Mitte und gleichmäßig verteilt auf die ungefähre Größe des Gehirns. Verwenden Sie den kleinen Spatel zu einem der ManipulationGehirnhälften auf die große Mikro Spatel so dass die mediale Seite des Gehirns ab. </li><li> Berührt die Kante der Spatel an der Grenzfläche des Gehirns auf dem zweiten Stück Filterpapier, um so viel von der Lösung, wie möglich zu entfernen. Schieben des Gehirns abseits grosser Spatel unter Verwendung der kleineren Spatel, um es auf den Leim zu führen. </li><li> Sichern Sie den Schneideblock in die Vibratom Kammer und füllen Sie die Kammer mit Schneid Lösungsaufschlämmung und Blase, wodurch das Gehirn vollständig eingetaucht ist. Drehen Sie den Schneideblock, so dass die Bauchseite des Gehirns wird die Klinge gegenüber. </li></ol></li><li> Schneiden des Gehirns. Hinweis: Jeder Vibratom ist einzigartig, so folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Stellen Sie die Scheibendicke zu 450 &amp; mgr; m, und sicherzustellen, dass die Klinge schwingt, wie es durch das Gehirn bewegt sich mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,3 mm / s. Vollständig durch das Gehirn von der Bauchseite zu der kortikalen Oberfläche schneiden, wird diese ganze Gehirn sagittal, die B produzierene für elektrophysiologischen Ableitungen verwendet. Slices werden seitlich an medial produziert werden und in der Regel 3-4 Scheiben können aus jeder Hemisphäre abgeschnitten werden. </li><li> Wenn die Basis der Scheibe Aufzüge benutzen Sie den gebogenen 27 G Nadel sanft drücken Sie die Scheibe wieder nach unten. Da jede Scheibe geschnitten wird, verwenden Sie die Transferpipette, um es auf die Plattform in der Haltekammer, wo sie lebensfähig für bis zu 8 Stunden sind zu bewegen. </li></ol></li></ol> 3. Extrazelluläre Elektrophysiologie Recordings <ol><li> Montage der Scheibe in der Aufnahme Kammer. <ol><li> Unter Verwendung der Transferpipette, legen Sie einen Hirnschnitt in einem untergetauchten Aufnahme Kammer mit aCSF in 1 fließt perfundiert - 2 ml / min und 32 ° C erhitzt. Das für Aufzeichnungen verwendet aCSF unterscheidet sich von der in der Haltekammer wie der Mg 2+ -Konzentration von 2 bis 4 mm vergrößert. </li><li> Befestigen Sie die Scheibe mit einem &quot;Harfe&quot; (halbkreisförmige Edelstahl mit Nylon-Stränge an erstreckte sich über 2 - 3 mm Abstand). Platzdie Harfe so dass die Stränge parallel laufen zu CA1. Erhöhen die Geschwindigkeit der Perfusion zum 8 - 10 ml / min bei 32 ° C. </li></ol></li><li> Unter einem Präpariermikroskop Ort eine Stimulationselektrode und eine Aufzeichnungselektrode (Glaselektrode mit der Aufzeichnungslösung gefüllte aCSF) auf der Oberfläche des Stratum radiatum von CA1 (2A). Setzen Sie den ersten Stimulationselektrode dann die Aufzeichnungselektrode. </li><li> Stimulieren die Schaffer-Kollateralen mit 120-150 &amp; mgr; A Amplitude und 0,1 ms Dauer Testimpuls und beobachten Sie die resultierende Feld exzitatorischen postsynaptischen Potentials (fEPSP) Wellenform zu bestimmen, slice Gesundheit (2B). Die anregenden und Aufzeichnungselektroden müssen möglicherweise in die Scheibe bewegt werden etwa 50 bis 100 &amp; mgr; m von der Scheibenoberfläche ein fEPSP Aufnahme mit einer kleinen Faser volley und großer Amplitude zu erhalten. Der Schaffer Sicherheiten evozierte fEPSPs sind stereotype und ein guter Indikator für die Gesundheit Scheibe. HEalthy Scheiben zeigen typischerweise einen Faser volley zum Amplitudenverhältnis von weniger als 0,3 fEPSP. </li><li> Neupositionierung der Elektroden. <ol><li> Verwendung eines Seziermikroskops Bewegen der Stimulationselektrode zu der Mitte der Schicht oriens und bewegen die Aufzeichnungselektrode auf den pyramidalen Zellschicht so nahe an die Aufzeichnungselektrode wie möglich, wie in 3A gezeigt. Die anregenden und Aufzeichnungselektroden müssen möglicherweise in die Scheibe gedrückt werden etwa 50 bis 100 &amp; mgr; m, so dass die fEPSP Antwortamplitude in die 120-150 uA Testimpuls ist ungefähr 1 mV. </li></ol></li><li> Erzeugen γ Schwingungen. <ol><li> So generieren γ Schwingungen stimulieren das Gewebe mit einem Zug von 20 x 0,1 bei 200 Hz geliefert msec Pulse. Diese tetanischen Stimulus können reproduzierbare Reaktionen ergeben bei Auslieferung alle 5 min. </li></ol></li><li> Verwenden Sie die folgenden Aufnahmeparameter. <ol><li> Skalieren Sie die Verstärkung des Ausgangssignals, um den Eingangsspannungsbereich entsprechenDer Analog-Digital-Wandler. Sicherzustellen, dass die maximale erwartete Signal Exkursion wird ein Minimum von 30% der Eingangsspannungsbereich. Seien Sie vorsichtig bei der Einstellung Gewinne zu hoch wie Signale könnten Clip. Die typische Bandbreite für Feldaufnahmen gebraucht wird, ist 500 Hz bei AC-Kopplung bei 0,1 Hz, um Basisliniendrift zu entfernen. </li><li> Digitalisieren mindestens 4-5 mal schneller als die Eckfrequenz des Tiefpassfilters, um Signal Aliasing zu vermeiden. </li></ol></li><li> Datenanalyse. <ol><li> Hochpassfilter Daten bei 5 Hz, alle Grundlinie verschiebt sich zu entfernen. Identifizieren Spikes mit einem Derivat Schwelle mit einer Mindest Ereignis Trennung von 10 ms, ein typisches Ereigniszeit zu Spitze und Regressions Intervall von 7 ms ein Schwellenwert von ~ 100 mV / msec und einer Trenn Tal von 100%. Berechnen Latenz die Zeit für den ersten identifizierten Spike ergriffen werden, um nach dem Ende des Stimulationsartefakt auf. Diese Analyse ermöglicht die Charakterisierung der Anzahl von Spikes, Latenz, inter-Ereignisintervall und die Dauer berechnet alsfolgt: </li><li> Berechnung der Anzahl der Spitzen als die Gesamtzahl der Spitzen pro Schwingung für jeden Durchlauf bestimmt. </li><li> Berechnen Sie die Schwingungs Latenz. Für jede Schwingung, subtrahieren die Zeit des ersten identifizierten Spitze vom Ende des Stimulationsartefakt. </li><li> Berechnen Sie die durchschnittliche inter-Ereignis-Intervall (ISI). Bestimmen Sie die Zeitdauer zwischen mehreren erfassten Spitzen und Durchschnitt. </li><li> Berechnen Sie die Schwingungsdauer. Messen Sie die Zeit zwischen dem ersten und letzten erkannten Spitze innerhalb jeder Schwingung. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Eine robuste Methode, um CA1 γ Schwingungen in akuten Hirnschnitten zu erzeugen, beschrieben. Die erzeugten Schwingungen ergeben sich aus einer lokalen Schaltung ermöglicht eine bessere Gelegenheit für die Steuerung und das Verständnis der neurophysiologischen Grundlagen der Netzwerkschwingungen 12. AMPA-Rezeptoren, GABA A -Rezeptoren, I h und T-Typ Ca2 + -Kanäle sind alle für γ Schwingungen in diesem Modell erforderlich. Während die lokalen hier beschriebenen CA1 Schwingungen...

Gehirn-Netzwerk-Oszillationen treten in unterschiedlichen Frequenzbändern, die zu Verhaltenszustände zu korrelieren. Bei Nagetieren Hippocampus θ Schwingungen - werden (5 10 Hz) während der Sondierungs Verhaltensweisen 1,2 beobachtet, während γ Schwingungen (20 - 80 Hz) assoziieren mit verschiedenen kognitiven Prozesse, einschließlich der Wahrnehmung und Aufmerksamkeit 3,4. Synchron γ Netzwerkaktivität wird auch in der Pathologie von Erkrankungen wie Epilepsie und Schizophrenie 5,6 gebracht. Beispielsweise sind γ Schwingungen gedacht, um Bereiche der kortikalen Epilepsieherden 5,7,8 entsprechen und könnte als Marker der pharmacosensitivity oder Widerstands zwei wichtige Untersuchungsbereiche in Epilepsieforschung 9 verwendet werden. Der Hippocampus Hirnschnitt ist ein Modell, das in großem Umfang verwendet wurde, um die Netzwerkaktivität 10-12 zu untersuchen. Verschiedene Protokolle wurden entwickelt, um γ Schwingungen in Hirnschnitten, die typischerweise erzeugen involve pharmakologischen Modulation, wie niedrige Mg 2+, 4-Aminopyridin (4AP) Bicucullin und Kainsäure 12-17. Mängel der pharmakologisch ausgelöst Schwingungen sind, dass sie nach dem Zufallsprinzip nach der Arzneimittelanwendung auftreten und werden nicht zuverlässig erzeugt oder über die Zeit stabil. Elektrisch ausgelöst γ Schwingungen zu überwinden viele dieser Probleme und haben auch den Vorteil, zeitlich auf die anregende Veranstaltung so dass für episodische Aufzeichnung und Analyse gesperrt. Hier ein Protokoll zur Erzeugung von CA1 γ Schwingungen durch die Bereitstellung einer tetanischen Stimulation, um das Stratum oriens im Hippocampus Scheibe beschrieben.

<table><tbody><tr><td>4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2-dimethyl-6-(methylamino)pyrimidiniumchlorid (ZD7288)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z3777</td><td></td></tr><tr><td>Biucullin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14340</td><td></td></tr><tr><td>6-Cyano-7-nitrochinoxa-line-2,3-dion (CNQX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C127</td><td></td></tr><tr><td>Nickel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>266965</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazepin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>(2R)-amino-5-phosphonopentano-at (APV)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Retigabin</td><td>ChemPacific</td><td>150812-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Cholin-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1879-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 & Bull; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 & Stier; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenglas</td><td>Harvard Gerät&nbsp;</td><td>GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Konzentrische bipolare stimulierende Metallelektrode</td><td>FHC</td><td>CBBPF75</td><td></td></tr><tr><td>Digitaler Isolator</td><td>Getting Instruments</td><td>Modell BJN8-9V1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Verstärker Modell 1800</td><td>A-M-Systeme</td><td>Verstärker Modell 1800 Digitizer</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nationale Instrumente</td><td>NI USB-6211</td><td></td></tr><tr><td>Vibrotome</td><td>Leica</td><td>VT1200s</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of local ca1 γ schwingungen durch tetanische stimulation

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Neuronale Netzwerk-Oszillationen sind wichtige Merkmale der Hirnaktivität in Gesundheit und Krankheit und kann durch eine Reihe von klinisch verwendeten Medikamente moduliert werden. Ein Protokoll ist vorgesehen, um ein Modell zur Untersuchung von CA1 γ Schwingungserzeugung (20 - 80 Hz). Diese γ Schwingungen sind stabil für mindestens 30 min und hängen von exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Aktivität zusätzlich zur Aktivierung des Schrittmacherströme. Tetanically stimuliert Oszillationen haben eine Anzahl von reproduzierbaren und leicht quantifizierbar Eigenschaften einschließlich Spikezahl, Schwingungsdauer, Latenz und Frequenz, die von der Netzwerkstatus zu melden. Die Vorteile der elektrisch stimuliert Schwingungen zählen Stabilität, Reproduzierbarkeit und episodischen Akquisition ermöglicht robuste Charakterisierung der Netzwerkfunktion. Dieses Modell der CA1 γ Schwingungen verwendet werden, um zelluläre Mechanismen zu studieren und systematisch zu untersuchen, wie die neuronale Netzwerkaktivität in Krankheit und durch Medikamente verändert werden.Krankheitszustand Pharmakologie kann leicht durch den Einsatz von Gehirnschnitten, die aus genetisch veränderten oder interventionelle Tiermodellen eingebaut werden, um die Auswahl von Wirkstoffen, die spezifisch auf Krankheitsmechanismen zu aktivieren.

Tetanische Stimulation der Stratum oriens erzeugt robuste und reproduzierbare γ Schwingungen (35,4 ± 2,2 Hz), siehe Abbildung 3B. Um zu demonstrieren, dass die Schwingungen wurden innerhalb des lokalen Netzwerks CA1 die Eingänge von CA3 wurden, indem die Scheibe in der CA2 Region mit einem gebogenen 32 G Nadel getrennt erzeugt. Die Schwingungseigenschaften in den geschnittenen Scheiben nicht von den unbeschnittenen Scheiben unterscheiden (p = 0,85; geschnittenen Scheiben 6,16 ± 1,1 Spitzen, n = 6; uncut...

Schwingungen sind grundlegende Netzeigenschaften und sind von Krankheiten und Arzneimittel moduliert. Studieren Gehirn-slice Schwingungen ermöglicht Charakterisierung der isolierten Netze unter kontrollierten Bedingungen. Protokolle sind für die Herstellung von akuten Gehirnscheiben zum Hervorrufen CA1 γ Schwingungen vorgesehen.

Generation of Local CA1 γ Schwingungen durch tetanische Stimulation

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Gehirnschnitte zur Ableitung extrazellulärer Gamma-Oszillationen als Modell der neuronalen Erregbarkeit vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn aus dem Schädel entfernt wird. Im zweiten Schritt wird das Gehirn rasch in einem Eisbad aus aCSF abgekühlt und in 450 µm dicke Schnitte zerschnitten. Als Nächstes überführen Sie eine Schnittpräparation in die Ableitungskammer und platzieren die stimulierende Elektrode in der Schicht und eine Ableitelektrode in der Schicht stratum pyramidale. Der letzte Schritt besteht darin, Gammaband-Oszillationen hervorzurufen und den Einfluss von Wirkstoffen auf die neuronale Erregbarkeit zu bewerten. Letztendlich wird die Charakterisierung hippocampaler Gammaband-Oszillationen verwendet, um die Wirkung von Arzneimitteln auf die Netzwerkfunktion zu demonstrieren oder die Mechanismen der Krankheitsentstehung bei neurogenetischen Erkrankungen zu verstehen.Diese Methode kann genutzt werden, um Einblicke in Krankheitsmechanismen zu gewinnen, bei denen eine erhöhte neuronale Netzwerkaktivität auftritt, wie beispielsweise bei Epilepsie, Autismus und Alzheimer, und eignet sich zudem zur Untersuchung der Wirkweise von Arzneimitteln. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie eine Haltekammer reparieren, indem Sie ein erhöhtes Nylonnetz in einen 250-Milliliter-Becher einsetzen. Füllen Sie anschließend den Becher mit Zerebrospinalflüssigkeit (CSF), sodass das Netz etwa zwei Zentimeter bedeckt ist, und belüften Sie die Flüssigkeit bei Raumtemperatur mit Carbogen.Stellen Sie sicher, dass die Blasen den Bereich mit dem Gewebeschnitt nicht direkt stören. Dann legen Sie die chirurgischen Instrumente, einschließlich einer großen Schere, einer kleinen Schere, eines kleinen und eines großen Mikrospatels sowie einer kleinen und einer großen Pinzette, auf Eis. Stellen Sie den gekühlten Vibram-Gewebeschnittblock auf eine Aluminiumfolie, die auf Eis liegt. Nach dieser Reparatur zwei Stücke Filterpapier mit sechs Zentimeter Durchmesser, ein Einweg-Rasiermesser mit einer scharfen Schneide und einen 25-Milliliter-Becher, der mit einer Schneidelösungssuspension gefüllt ist. Danach füllen Sie einen zweiten Behälter mit Eis für die Gehirndissektion. Legen Sie ein Stück Filterpapier auf das Eis und stellen Sie eine 12-Zentimeter-Kulturschale darauf.Füllen Sie die Kulturschale anschließend mit einer Eissuspension aus Schneidelösung und spülen Sie sie mit Carbogen durch. Heilen Sie in diesem Verfahren die Haut und das Bindegewebe des Kopfes in Richtung Nase mit der kleinen Schere, schneiden Sie das Bindegewebe durch, um den darunterliegenden Schädel freizulegen. Entfernen Sie danach die Muskulatur, die die dorsale Seite des Schädels und des Halses überlagert.Um das Gehirn zu entfernen, fixieren Sie die Vorderseite des Schädels mit einer großen Pinzette. Führen Sie dann zwei seitliche Schnitte durch das Knochengewebe auf beiden Seiten des Foramen magnum durch. Danach führen Sie einen weiteren Schnitt zwischen den Augen unmittelbar vor dem Foramen magnum durch.Schneiden Sie vorsichtig entlang der Sagittalsutura und klappen Sie die Knochenabschnitte zurück, um das Gehirn freizulegen. Heben Sie anschließend das Gehirn mit einem kleinen Spatel heraus und achten Sie darauf, die Hirnnerven zu durchtrennen. Legen Sie das Gehirn in eine Kulturschale.Überführen Sie das Gehirn anschließend in einen 25-Milliliter-Becher, der mit Schneidelösungssuspension gefüllt ist. Um die Gehirnhälfte zum Schneiden vorzubereiten, legen Sie ein Stück Filterpapier mit sechs Zentimetern Durchmesser auf den Boden einer Petrischale. Füllen Sie diese dann mit frischer Schneidelösungssuspension und spülen mit Car.Legen Sie anschließend das Gehirn mit der ventralen Seite nach unten auf das Filterpapier. Entfernen Sie dann das Kleinhirn mit einer neuen und gereinigten Einweg-Rasierklinge. Führen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie durch, um die beiden Hemisphären zu trennen.Um den Vibram-Gewebeklotz vorzubereiten, trocknen Sie die Oberfläche der gekühlten Vibram-Schneidplattform ab. Geben Sie einen Tropfen Sano-ACRL-Kleber in die Mitte und verteilen Sie ihn gleichmäßig auf die ungefähre Größe des Gehirns. Verwenden Sie einen kleinen Spatel, um eine Gehirnhälfte auf einen großen Mikrospatel zu übertragen, und positionieren Sie sie so, dass die mediale Seite des Gehirns nach unten zeigt.Die Lösung des Gehirns mit einem Stück Filterpapier so gut wie möglich absorbieren. Dann das Gehirn von der größeren Spatel abziehen und die kleinere Spatel verwenden, um es auf den Kleber zu führen. Danach die Schneideplattform an der Vibram-Kammer befestigen.Bauen Sie die Kammer mit einer Schneidlösungssuspension auf, um das Gehirn vollständig zu bedecken, und durchblasen Sie die Lösung mit Carbogen. Drehen Sie dann die Schneideplattform so, dass die ventrale Seite des Gehirns zur Klinge zeigt. Schneiden Sie das Gehirn in Schnitte von 450 Mikrometern Dicke; schneiden Sie dabei vom ventralen zum dorsalen Oberfläche, um vollständige sagittale Gehirnschnitte für elektrophysiologische Aufzeichnungen zu erhalten.Wenn sich die Unterseite des Schnitts hebt, verwenden Sie eine gebogene Nadel mit 27 Gauge, um den Schnitt vorsichtig nach unten zu drücken. Übertragen Sie den Schnitt anschließend mit einer Pipette in die Haltekammer. Typischerweise können aus jeder Hemisphäre drei bis vier Hippocampus-Schnitte gewonnen werden, um sie in der Ablesekammer zu montieren.Legen Sie eine Gehirnscheibe in eine überflutete Ableitungskammer, die mit einem Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) durchströmt wird, das mit einer Geschwindigkeit von ein bis zwei Milliliter pro Minute fließt und auf 32 Grad Celsius erwärmt ist. Die für die Ableitungen verwendete CSF unterscheidet sich von der in der Haltekammer dadurch, dass die Magnesiumkonzentration von zwei Millimolar auf vier Millimolar erhöht wird. Sichern Sie die Scheibe, indem Sie ein halbkreisförmiges Gewicht aus rostfreiem Stahl darauf platzieren, wobei dessen Drähte parallel zum Hippocampus CA1 ausgerichtet sind.Anschließend erhöhen Sie die Perfusionsgeschwindigkeit auf acht bis 10 Milliliter pro Minute bei 32 Grad Celsius. Unter Verwendung eines Stereomikroskops bringen Sie die Stimuliersonde in die Mitte der Stratum oriens. Danach positionieren Sie die Ableitelektrode in der Parametrie-Schicht so nah wie möglich an der Stimuliersonde.Senken Sie anschließend sowohl die stimulierende als auch die ableitende Elektrode um 50 bis 100 Mikrometer in das Schnittpräparat ab. Um eine feldgebildete EPSP von einem Millivolt als Antwort auf den 120 bis 150 Mikro-Testpuls zur Erzeugung von Gamma-Oszillationen zu erzeugen, reizen Sie das Gewebe mit einer Serie von 20 Impulsen mit jeweils 0,1 Millisekunden Dauer, die mit einer Frequenz von 200 Hertz appliziert werden. Dieser intensive Reiz kann reproduzierbare Antworten hervorrufen, wenn er alle fünf Minuten gegeben wird.Dieses Schema zeigt die Positionen der stimulierenden Elektrode in der Stratum orients und der Ableitelektrode in der Stratum para des CA1. Und hier ein Beispiel für die durch Titanic-Stimulation hervorgerufenen Gamma-Oszillationen. Diese Abbildung zeigt die pharmakologische Blockade von AMPA-Rezeptoren mit 20 µM CNQX, GABAA-Rezeptoren mit 20 µM Bicucullin, IH-Ströme mit 20 µM Zatepidin, Chloridkanäle und T-Typ-Calciumkanäle.Bei 100 Mikromolar Nickel konnte jede Substanz unabhängig voneinander die Anzahl der erzeugten Spikes reduzieren. Diese Präparation eignet sich ideal zur Bestimmung der netzwerkweiten Wirkung von Arzneimitteln. Tine ist ein klinisch verwendetes Antiepileptikum, das Kaliumkanäle öffnet und die membranöse Erregbarkeit im Bad reduziert.Die Anwendung von Tine führte zu einer dosisabhängigen Verringerung der Anzahl der Spikes während der Dauer der Oszillation. Sobald die Herstellung von Gehirnschnitten und die Dissektion für elektrophysiologische Ableitungen beherrscht sind, können diese innerhalb von etwa 10 Minuten nach dieser Anleitung durchgeführt werden. Die Ergänzung durch weitere Methoden wie Ganzzell-Patch-Clamp-Ableitungen kann hinzugefügt werden, um die Rolle einzelner Neuronen in einem Netzwerk bei Erkrankungen sowie nach Applikation von Wirkstoffen zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Herstellung von akuten Hirnschnitten aus isolierten hippocampi, sowie die gleichzeitige elektrophysiologischen Ableitungen von Astrozyten und Neuronen...

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Induktion lokaler CA1-Gamma-Oszillationen in einem CA1-Hippocampus-Maushirnschnitt mit Hilfe von tetanischen Simulationen. Diese Methode ist wichtig, um die Aktivität des neuronalen Netzwerks zu verstehen.

Erzeugung lokaler Cornu Ammonis 1 (CA1) Gamma-Oszillationen mit Hilfe tetanischer Stimulationen in einem hippokampalen Hirnschnitt

Dieses Video zeigt eine Methode zur Aufzeichnung von CA3-CA1 synaptischen Reaktionen in einem Hippocampus-Schnitt der Ratte. Es beschreibt die Schritte, die zum Platzieren der Stimulations- und Aufzeichnungselektroden auf dem Hippocampus-Schnitt und zur Messung des exzitatorischen postsynaptischen Feldpotentials (fEPSP) erforderlich sind, um die Stärke der synaptischen Reaktion zu beurteilen.

Aufzeichnung synaptischer Reaktionen von CA3-CA1 in einem Hippocampus-Schnitt der Ratte

Dieses Video demonstriert die Methode, die Optogenetik zu nutzen, um die Netzwerkdynamik des Hippocampus zu modulieren, indem genetisch veränderte lichtempfindliche Interneuronen in einem Maushirnschnitt aktiviert werden, die Synchronisation der Theta-Oszillation verbessert und das Verhalten neuronaler Schaltkreise untersucht wird.

Optogenetische Kontrolle der Netzwerkdynamik im Hippocampus

Der Nucleus pedunculopontinus (PPN) wird in der Hirnstamm und seine Neuronen befinden sich maximal aktiviert während des Wachens und schnelle Augenbewegungen (REM) Schlaf Gehirnzustände. Diese Arbeit beschreibt die experimentellen Ansatz in vitro Gamma - Band unterschwelligen Membran Schwingung in PPN Neuronen aufzuzeichnen.

Recording Gamma-Band-Oszillationen in Nucleus pedunculopontinus Neurons

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Aufzeichnung von rhythmischen neuronalen Netzwerk-Theta und Gamma-Oszillationen aus einer isolierten ganzen Hippocampus-Präparation. Wir beschreiben die experimentellen Schritte von der Extraktion des Hippocampus bis hin zu Details der Feld-, Einheits- und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen sowie der optogenetischen Stimulation des Theta-Rhythmus.

Tuning in der Hippocampal Theta Band<em&gt; In vitro</em&gt;: Methoden für die Aufnahme aus dem isolierten Nagetier Septohippocampal Circuit

Wir beschreiben die Verwendung der optogenetik und elektrophysiologische Aufnahmen für gezielte Manipulationen der hippocampal Theta Schwingungen (5 bis 10 Hz) im Verhalten Mäuse. Die Wirksamkeit von Rhythmus mitreißen wird mit lokalen Feldes Potenzial überwacht. Eine Kombination von Opto und pharmakogenetischen Hemmung befasst sich mit das ableitenden Auslesen der hippocampalen Synchronisation.

Optogenetische Mitnahme von Hippocampal Theta Schwingungen im Verhalten der Mäuse

Dieses Protokoll beschreibt die Aufzeichnung des lokalen Feldes Potentiale mit Multi-Schaft, die lineare Silicon-Sonden. Umwandlung der Signale mit Hilfe der aktuellen Quelle dichteanalyse ermöglicht die Rekonstruktion der lokalen elektrischen Aktivität im Hippocampus Maus. Mit dieser Technik können räumlich begrenzten Gehirn Schwingungen frei beweglichen Mäusen untersucht werden.

Aufzeichnung von räumlich eingeschränkt Schwingungen im Hippocampus Verhalten der Mäuse

Akuter Anfall Modelle sind wichtig für die Untersuchung der Mechanismen, die epileptiformen Veranstaltungen. Darüber hinaus bietet die Möglichkeit, epileptiformen Ereignisse auf Abruf erzeugen eine äußerst effiziente Methode um die genaue Abfolge der Ereignisse zugrunde liegen ihre Einleitung zu studieren. Hier beschreiben wir die akute 4-Aminopyridine kortikalen Beschlagnahme Modelle Maus und menschlichem Gewebe gegründet.

Generation und On-Demand Einleitung der akuten iktale Aktivität in Nagetier und menschlichem Gewebe

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Ca2 + Bildgebung in Neuronen und Gliazellen, die das Sezieren von Ca2 + Signale in subzellulären Auflösung ermöglicht. Dieser Prozess gilt für alle Zelltypen, die die Expression von genetisch codierte Ca2 + Indikatoren zu ermöglichen.

Dissektion der lokalen Ca2 + Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca2 + Indikatoren

Wir verwendeten Aufnahme- und Stimulationselektroden in Längs-Hippocampus-Gehirnscheiben und längs positionierten Aufnahme- und Stimulationselektroden im dorsalen Hippocampus in vivo, um extrazelluläre postsynaptische Potenziale zu evozieren und langfristige synaptische Plastizität entlang des Längsinterlamellars CA1.

Untersuchung der langfristigen synaptischen Plastizität im Interlamellar Hippocampus CA1 durch elektrophysiologische Feldaufzeichnung

Erfahren Sie die Präparation von Hirnschnitten zur Aufzeichnung von Gamma-Oszillationen im CA1-Bereich. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Erregbarkeit und die Analyse von Arzneimittelwirkungen auf Netzwerkfunktionen.

Generation of Local CA1 γ Schwingungen durch tetanische Stimulation

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