Implementierung von In-vitro- Drug Resistance Assays: Maximierung des Potenzials für die Aufdeckung klinisch relevanter Resistenzmechanismen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine rasche präklinische Entdeckung klinisch relevanter Einzelnukleotidvarianten zu ermöglichen, die funktionell die Resistenz gegen verschiedene Therapieklassen fördern können. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Onkologie zu beantworten, z. B. welche Genmutationen zur funktionellen Resistenz gegen Therapien in der Klinik beitragen können, die letztendlich zu einer Verbesserung der Therapien und alternativen klinischen Behandlungsstrategien für arzneimittelresistente Patienten führen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir das Auftreten spontaner Mutationen erleichtern und eine unvoreingenommene Screening-Technologie bei resistenten Klonen anwenden, so dass die Wahrscheinlichkeit größer ist, dass diese Varianten auf Rückfälle abzielende Therapien in der Klinik vorantreiben.

Das Verfahren wird von einem sehr talentierten Forscher aus meinem Labor demonstriert, um den GI 50 für Zelllinien zu beurteilen. Bereiten Sie eine Assay-Platte vor, indem Sie die Zellen in undurchsichtigem klarem Zustand aussäen. Untere 96 Well-Platten in 100 Mikrolitern Zellmedium gemäß der hier gezeigten Karte.

Bereiten Sie auf ähnliche Weise eine Kontrollplatte vor, indem Sie Zellen in die blauen Vertiefungen und nur mittlere Zellen in die weißen Vertiefungen geben. Nachdem Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, äquilibrieren Sie das Reagenz für die Viabilität der Leuchtzelle auf Raumtemperatur und mischen Sie es vorsichtig durch Invertieren. Um eine homogene Lösung zu erhalten, geben Sie 80 Mikroliter Reagenz in die Vertiefungen der Kontrollplatte und schütteln Sie den Inhalt 30 Minuten lang.

Zur Induktion der Zelllyse. Verwenden Sie ein Luminometer mit einer Belichtungszeit von 0,1 bis 1,0 Sekunden und einer Detektionswellenlänge von 560 Nanometern, um die Lumineszenz aufzuzeichnen. Um die Testverbindungen zu den Assay-Platten hinzuzufügen, führen Sie als Nächstes eine Reihe von Eins-zu-Vier-Verdünnungen von Verbindungen in DMSO durch, beginnend mit einer Konzentration von 2000 Mikromolen für insgesamt 10 Verdünnungen.

Fügen Sie dann die seriell verdünnten Verbindungen zum Medium hinzu, um eine Mischung aus dem Verbindungsmedium mit einer 10-fachen Endkonzentration herzustellen. Lagern Sie die Verbundplatte bei minus 20 Grad Celsius für die Verwendung am dritten Tag des Assays. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter der verdünnten Verbindungen in dreifacher Ausfertigung zu den Zellen hinzu, so dass die höchste Dosis 10 Mikromolar beträgt.

Inkubieren Sie die Platten drei Tage lang bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie am dritten Tag eine 400-Mikroliter-Mischung aus einem X Verbundmedium mit den drei Tage zuvor vorbereiteten Verbundplatten zu. Drehen Sie die Assay-Platten um, um das Medium zu entfernen, und tupfen Sie sie zwei- bis dreimal auf Autoklavenpapiertüchern trocken.

Geben Sie eine x Verbindung in die blau schattierte Vertiefung und fügen Sie 100 Mikroliter Medium bis Perimeter-Vertiefungen hinzu, um eine Verdunstung zu verhindern. Bestimmen Sie am sechsten Tag die relative Anzahl lebensfähiger Zellen, indem Sie eine Lumineszenzmessung durchführen, wie weiter oben im Video gezeigt. Berechnen Sie dann die GI 50-Werte mit Hilfe von Software wie PRISM und richten Sie mit den berechneten GI 50-Werten Zellen für Arzneimittelresistenz-Assays ein.

Bei der Arbeit mit einem Zytostatikum werden Zellen mit einer Konzentration von 30 bis 40 % in 150 Millimeter quadratischen Kulturschalen ausgesät. Wenn Sie mit einem toxischen Wirkstoff arbeiten, sehen Sie die Zellen bei 70 bis 80 % Konfluenz. Nach der Bestimmung der Ausgangskonzentrationen der Verbindungen gemäß dem Textprotokoll werden die Zellen mit den Testverbindungen auf hochtoxische Verbindungen behandelt, die in einem sechstägigen Viabilitätstest den Zelltod verursachen.

Beginnen Sie mit dem GI 50 und erhöhen Sie die Konzentration schrittweise alle zwei bis drei Wochen, bis eine robuste Resistenz beobachtet wird. Um einzelne Zellklone zu isolieren, verwenden Sie die Phasenkontrastmikroskopie bei 40-facher Vergrößerung, um die Kulturschale zu untersuchen und lebensfähige Zellcluster am Boden der Schale zu identifizieren. Verwenden Sie einen Stift, um Klone zu markieren, die durchschnittlich groß und gut von anderen Kolonien isoliert sind, um Klone mit einer P 200-Pipette zu entnehmen.

Nehmen Sie das Wachstumsmedium aus der Schale und spülen Sie mit einem XPBS alle schwimmenden Zellen ab. Heben Sie die Klone mit der Pipettenspitze an und geben Sie sie in die Vertiefungen einer 48-Well-Platte mit 50 Mikrolitern 0,25 % Trypsin, die ein bis zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert werden. Fügen Sie dann 200 Mikroliter frisches Medium mit der Hälfte der Konzentration der Verbindung hinzu, um eine optimale Erholung der Zellen zu ermöglichen.

Um die Klone mit drei Millimeter großen Klonierungsscheiben zu isolieren, legen Sie die Scheiben zwei Minuten lang in eine 10 Zentimeter große Gewebekulturschale mit fünf Millilitern 0,25 %-Trips in EDTA. Als nächstes aspirieren Sie das Medium aus der Schale, die die resistenten Klone enthält, und überlagern die Klone mit den Trips und getränkten Klonscheiben. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Minuten, je nachdem, wie leicht sich die Klone von den Platten abheben lassen.

Nehmen Sie dann mit einer sterilen Pinzette die Klonierungsscheiben auf und geben Sie sie in 48-Well-Platten mit 200 Mikrolitern frischem Medium, und lassen Sie die Konzentration der Verbindung vorsichtig auf und ab pipettieren, um die Zellen von den Klonierungsscheiben zu lösen, und inkubieren Sie am nächsten Tag über Nacht bei 37 Grad, entfernen Sie die Klonierungsscheiben, inkubieren Sie die Zellen. Beurteilen Sie dann die Arzneimittelresistenz. Gemäß dem Textprotokoll, wie hier gezeigt, wird HCT eine 16 Zellen über einen längeren Zeitraum mit zytotoxischen Zellen behandelt. Verbindung Nummer eins führte zum spontanen Auftauchen resistenter Klone, die während der Behandlung weiter wuchsen.

Die Klone wurden mit einem Pipettenmann ausgewählt. In dieser Abbildung zeigten die resistenten Klone eins bis drei eine signifikante Resistenz gegen die Verbindung Nummer eins und ihre nahe analoge Verbindung Nummer zwei, während alle Klone eine Empfindlichkeit gegenüber einer nicht verwandten zytotoxischen Verbindung zeigten. Velcade. Nach Bestätigung der phänotypischen Resistenz wurde GDNA isoliert und zur Analyse der Gesamt-Exom-Sequenzierung eingereicht.

Strukturvarianten, die wiederkehrend waren und das Potenzial für funktionelle Auswirkungen hatten, wurden durch ein unabhängiges Sequenzierungstool wie die Sanger-Sequenzierung bestätigt. Ein hier gezeigtes Beispiel trug eine heterozygote Missense-Mutation, und die elterliche Zelllinie wurde anschließend so verändert, dass sie die mutierte CDNA exprimierte. Die Überexpression des Wildtyps CDNA führte jedoch nicht zu einer Arzneimittelresistenz.

Die mutierte CD NA verlieh der Verbindung Nummer eins signifikant phänotypische Resistenz, was die funktionelle Rolle der strukturellen Variation als Treiber der Resistenz bestätigt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie spontanes resistentes Wachstum entwickeln können, um nach Genen zu suchen, die für die Arzneimittelresistenz in Krebszellen nach ihrer Entwicklung verantwortlich sind. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Onkologie die Möglichkeit, Mechanismen der Arzneimittelresistenz sowohl in Krebszelllinien als auch in Tiermodellen unvoreingenommen zu untersuchen.