Name: Einrichtung von einem klinisch relevanten Ex Vivo Mock Kataraktchirurgie Modell zur Untersuchung von epithelialen Wundheilung in einer nativen Mikromilieu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Lernen Sie die Einrichtung eines ex vivo Kataraktchirurgie-Modells zur Untersuchung epithelialer Wundheilung in nativem Mikromilieu. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbeobachtung von Reparaturmechanismen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch den National Institutes of Health Grant an A.S.M. (EY021784).

Das folgende Protokoll erfüllt die Thomas Jefferson University Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss Leitlinien und mit der ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in der Vision Research. 1. Aufbau und Herstellung von Linsen für Ex Vivo Wund Kultur <ol><li> Platzieren Sie drei 100 mm-Petrischalen in einer sterilen, Sterilbank. Füllen zwei der Petrischalen bis zur Hälfte mit Tris / Dextrose-Puffer (TD Puffer; 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na 2 PO 4, 5 mM D-Glucose, 8,25 mM Tris-Base, mit HCl auf pH 7,4) bei RT , so dass die dritte leer. Pre-warmen Kulturmedien (Medien 199 mit 1% L-Glutamin und 1% Penicillin / Streptomycin) bis 37 o C. Hinweis: Der Standard-Wundheilung Kulturmedien ist Serum-freien, als in vivo auftritt; jedoch können die Wundreparatur Kulturen erfolgreich in definierten Medien Bedingungen, Serum oder anderen Faktoren gehören gezüchtet werden. </li><li> Entfernen fruchtbaren embryonalen day 15 weiße Leghorn-Küken Ei Inkubator (bei 37,7 ° C unter leichtem Schütteln gehalten) </li><li> Ort Ausgewählter Ei in der Sterilbank und saubere Außenschale mit 70% Ethanol aus einer Waschflasche. Führen alle Verfahren unter unter aseptischen Bedingungen in der Sterilbank, mit sterilen Lösungen und Instrumente. </li><li> Knacken Sie Ei und Ort Inhalt in den leeren 100 mm Petrischale. Enthaupten Embryo mit Standard-Pinzette und einer feinen Schere. Setzen Sie den Hühnerembryo Kopf in einer Petrischale mit TD-Puffer und ordnungsgemäß von dem Rest des Embryos zu entsorgen. Gegebenenfalls halten die Hühnerembryo-Köpfe in TD-Puffer für einen kurzen Zeitraum, nicht länger als 15 min. </li><li> Setzen Sie den Hühnerembryo Kopf auf eine Petrischale Deckel. Mithilfe von Hochpräzisionszangen, nehmen Sie das Objektiv zusammen mit seinem beigefügten Glaskörper aus dem Auge in der folgenden Reihenfolge. Drücken Sie den hinteren Teil des Auges mit der Zange, um eine kleine Öffnung in der Rückseite des Auges zu schaffen. </li><li> Dann fassen Sie den Glaskörper with Pinzette und sanft zerren an den Glaskörper mit einer Rollbewegung, wird der Glaskörper mit dem Objektiv aus dem Auge verdrängt werden. Ort Linsen- / glasigen im übrigen Petrischale mit TD-Puffer. Lassen Sie die Linsen in TD-Puffer für nicht mehr als 30 Minuten zu bleiben. </li><li> Bewegen Sie das Objektiv auf eine neue Petrischale Deckel unter einem Binokular. Von diesem Zeitpunkt an alle Schritte unter einem Binokular. Mit hoher Präzision Pinzette sorgfältig wegzuwischen jede Ziliarkörper (pigmentierten Zellen), die mit dem Rand der Zange unter Vorsicht nicht, um die Linse Gewebe schädigen mit der Linse verdrängt wurden. Anmerkung: Das Entfernen des Ziliarkörpers sichergestellt, dass Zelltypen, die nicht endogen der Linse nicht in der Wundreparatur Kultur enthalten. </li><li> Trennen Sie die Linse aus dem Glaskörper mit hoher Präzision Pinzette durch Abquetschen des Glaskörpers aus seiner Teilnahme an der hinteren Linsenkapsel. </li><li> Mithilfe von Hochpräzisionspinzette übertragen die Linse in einem kleinen TropfenTD-Puffer (etwa 200 ul) in einer 35 mm Gewebekulturschale. </li></ol> 2. Durchführung Mock Kataraktchirurgie <ol><li> Richten Sie die Linse in der Drop von TD-Puffer in der 35-mm-Schale mit der vorderen Seite der Linse nach oben zeigt. Anmerkung: Die vordere der Linse leicht durch die Anwesenheit einer dichten Ring in dem Gewebe, die die Grenze zwischen dem vorderen und äquatorialen Region Linsenepithels stellt identifiziert. Im Gegensatz dazu gibt es ein Fehlen von Markierungen auf dem hinteren Teil der Linsenkapsel zu dem die Linsenfaserzellen angebracht sind. </li><li> Verwendung von zwei Hochpräzisions Pinzette einen kleinen Einschnitt (etwa 850 um) in der Mitte der vorderen Linsenkapsel, die dicke Basismembran, die das Linsengewebe umgibt und der zugehörigen vorderen Linsen Epithels durch Ergreifen des Gewebes mit einer Zange in jeder Hand und leichtes Ziehen in entgegengesetzte Richtungen. </li><li> Entfernen Sie die Faserzellmasse, die bis macht den Großteil der Linsengewebe, dislodGing es von seiner Anhänge zu der Linse Epithel und Umgebung Linsenkapsel durch hydro-Elution (Ansatz im klassischen Katarakt-Operation verwendet, die in 1A modelliert). </li><li> Eine 1 ml-Spritze mit einer 27,5 g Nadelspitze mit 300 ul TD-Puffer. Legen Sie die Nadelspitze in den Einschnitt in der vorderen Linsenkapsel hergestellt und etwa auf halbem Weg in die Linse. </li><li> Die Spritze Injektion des TD-Puffer in die Linse Faserzellmasse sanft niederdrücken. Injizieren von 50 bis 200 &amp; mgr; TD und niemals mehr als 300 &amp; mgr; l. Beachten Sie die Faserzellmasse Lösen sich aus dem Epithel und Linsenkapsel. </li><li> Mithilfe von Hochpräzisionszangen, entfernen Sie den aufgelockerten Faserzellmasse von der Linse durch den vorderen Einschnittstelle. Hinweis: Dieses Verfahren lässt den hinteren Linsenkapsel Basalmembran, an die die Faserzellen war angebracht entblößt von Zellen und einen verletzten Linsenepithels direkt neben dieser Website. </li></ol> 3. Preparing der Verwundeten Objektiv für ex vivo Kultur <ol><li> Glätten Sie das Linsenkapselsack, die aus der oben auf der Kulturschale beschrieben Kataraktchirurgie, Zellseite nach oben führt, indem sie fünf Schnitte in der Vorderseite des Kapselsack. </li><li> Senkrecht zur ursprünglichen Inzisionsstelle bis zum Äquator der Linse geschnitten. Glätten Sie die resultierenden fünf &quot;Klappen&quot; der Linsenkapsel mit angeschlossenem Epithel auf der Kulturschale Kapsel nach unten, Zellseite nach oben. Beachten Sie nun die ex vivo verwundet Linse sollte auf einen Stern oder blumen Form (siehe Abbildung 1B) zu nehmen. </li><li> Um die Kapsel in die Schale sanft nach unten mit der Zange an jedem Punkt des Sterns zu sichern, drücken Sie. Dies wird eine kleine Vertiefung an den fünf Außenspitzen der Explantation zu machen und zu einer anhaltenden Befestigung an der Schale. Hinweis: Es ist möglich, die Kapsel während dieses Verfahrens schädigen und so ist es wichtig, um die Kapsel in die Schale so nah an den Spitzen der fla sichernps wie möglich, als auch für die geringste Menge an Befestigungspunkte wie möglich zu machen (in der Regel zwei, höchstens drei pro Klappe). </li><li> Entfernen Sie das TD-Puffer aus dem 35-mm-Schale und ersetzen Sie es mit 1,5 ml vorgewärmten Medien. Decken Sie die 35-mm-Schale mit Deckel und in den Inkubator (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> 4. Trennung des Central Migration Zone (CMZ), wo Reepithelisierung des verwundeten Bereich der hinteren Kapsel eintritt, von der Original-Befestigungszone (OAZ) von Linsenepithelzellen, für die quantitative Analyse. Anmerkung: Die Zellen beginnen, in der Region unmittelbar CMZ in Reaktion auf eine Verletzung zu bewegen. Von ersten Tag an in der Kultur genügend Zellen für die CMZ Migration für die molekulare und biochemische Analyse, nach der Trennung von der CMZ und der OAZ durch Mikrodissektion 23. Dieses Protokoll schließt die Entfernung einer Klappe (OAZ) zu einem Zeitpunkt aus dem verwundeten Bereich der Kapsel. <ol><li> Beachten Sie eine demarKation, unter dem Binokular deutlich sichtbar ist, zwischen dem OAZ und CMZ (siehe Abbildung 2A). Der Einsatz von zwei hochpräzisen Pinzette greifen mit beiden Zangen am Rande des OAZ / CMZ Linie, ein direkt neben dem anderen, auf beiden Seiten der Linie (siehe Abbildung 2A, B, Pfeil). </li><li> Mit einer Hand / eine Zange auf der CMZ Seite weiterhin auf die verletzten Kultur zu halten, während mit der anderen Seite / Pinzette, ziehen Sie den OAZ entlang der OAZ / CMZ Linie. Die CMZ leicht trennt sich von der OAZ entlang dieser Linie. Fahren Sie weiter auf dieser Linie um die gesamte Kultur, bis die beiden Bereiche vollständig getrennt. </li><li> Studieren Sie die getrennt OAZ und CMZ Fraktionen für die molekulare Analyse, wie RNA-Seq 24 oder biochemischen Analyse, wie Western-Blot oder Co-Immunopräzipitation 23,25. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Hier wird eine Technik zur Vorbereitung eines Kulturmodells der Wundreparatur beschrieben, die die Durchführung einer ex vivo Kataraktoperation an Linsen von Hühnerembryonen nach ihrer Entnahme aus dem Auge beinhaltet. Das Linsenepithel reagiert auf diese klinisch relevante Wunde mit einem Reparaturprozess, der dem in vivo sehr ähnlich ist und Merkmale mit der Wundreparatur in anderen Epithelgeweben teilt2,4. Während das Protokoll unkompliziert und einfach zu befolgen ist, erfordert die Durch...

Die klinisch relevanten, mock Kataraktchirurgie, ex vivo hier beschriebenen epithelialen Wundheilung Modell wurde entwickelt, um ein Werkzeug für die Untersuchung der Mechanismen, die die Reparatur von Epithelgeweben regulieren in Reaktion auf eine Verletzung bereitzustellen. Key Features, die für die Schaffung dieses Modell ausgerichtet wurden eingeschlossen 1) Bereitstellen von Bedingungen, die eng repliziert die in vivo Antwort auf Verwundung in einer Kultur, Betrieb, 2) Leichtigkeit der Modulation der regulatorischen Elemente der Reparatur, und 3) die Fähigkeit, die dem Bild mit der Reparatur, in seiner Gesamtheit, in Echtzeit. Die Herausforderung war also, eine Kultur-Modell, in dem es möglich war, zu untersuchen, in nativen Mikroumgebung der Zellen zu erstellen und zu manipulieren, epitheliale Wundheilung. Die Verfügbarkeit dieses Wundreparaturmodell eröffnet neue Möglichkeiten für die Identifizierung der endogenen Signal Hinweise aus Matrixproteine, Zytokine und Chemokine, die den Reparaturvorgang zu regulieren. Darüber hinaus ist das Modell ideal für die Prüfung, wie einn Epithel ist in der Lage, als eine kollektive Blatt neu epithelisieren den Wundbereich 2,3, und für die Bestimmung der Abstammung von mesenchymalen Zellen Führer am Wundrand, die bei der Steuerung der kollektiven Migration des verletzten Epithel 4 funktionieren zu bewegen. Dieses Modell bietet auch eine Plattform, um Therapeutika, die effektive Wundheilung zu fördern und zu verhindern, anomale Wundheilung 5 könnten. Es gibt bereits eine Anzahl von verfügbaren Wundreparatur Modellen, sowohl in Kultur als auch in vivo, die das meiste, was über den Wundheilungsprozess bekannt heute zur Verfügung gestellt haben. In Tiermodellen Verletzungen, wie Hornhaut und die Haut 6-12 13-17, gibt es die Möglichkeit, die Reaktion des Gewebes auf Verwundung im Zusammenhang mit allen Reparatur-Mediatoren, die in den Prozess eingebunden werden könnten, einschließlich der Beiträge aus der Studie Gefäßsystem und das Nervensystem. Jedoch gibt es Beschränkungen für die Manipulation der Erfahmentale Zustände in vivo, und es ist noch nicht möglich, bildgebenden Untersuchungen des Reparaturantwort in vivo durchzuführen, über die Zeit kontinuierlich. Dagegen arbeiten die meisten in vitro Wundreparatur Kulturmodellen, wie die Kratzwunde, kann leicht bearbeitet werden und anschließend im Laufe der Zeit aber nicht die Umwelt Rahmen des Studierens der Wundheilung in vivo Gewebe. Während ex vivo Modelle bieten den Vorteil des Studiums der Verletzungsreparatur Verfahren kontinuierlich mit der Zeit im Zusammenhang mit der Mikroumgebung der Zellen in Verbindung mit der Fähigkeit, die Molekularregulatoren der Reparatur zu jedem Zeitpunkt in dem Verfahren zu modulieren, es gibt nur wenige Modelle, diese passen Parameter. Hier wird ein Verfahren beschrieben, um in hohem Maße reproduzierbar ex vivo epithelialen Wundheilung Kulturen, die Reaktion einer epithelialen Gewebes auf einen physiologischen Verwundung reproduzieren zu generieren. Unter Verwendung der Hühnerembryo Linse als Gewebequelle, einem ex vivo mock Kataraktoperation durchgeführt wird. Das Objektiv ist die ideale Gewebe für diese Studien zu verwenden, da es sich geschlossene innerhalb einer dicken Basalmembran Kapsel, avaskuläre, nicht innerviert, und frei von assoziierten Stroma 18,19. Bei der menschlichen Krankheit, Katarakt-Operation adressiert Sehverlust durch Trübung der Linse und ist die Entfernung der Linse Faserzellmasse, die die Masse der Linse umfasst. Nach einer Kataraktchirurgie Vision wird durch die Einfügung einer künstlichen Intraokularlinse wiederhergestellt. Die Kataraktchirurgieverfahren durch Entfernung von Faserzellen, induziert eine Verletzungsantwort in der benachbarten Linsen Epithel, das durch Reepithelisierung der hinteren Fläche der Linsenkapsel, die von den Faserzellen besetzt war anspricht. In der Kataraktchirurgie, wie in den meisten der Wundheilung Reaktionen tritt es manchmal ein anomales Ergebnis fibrotische zur Wundheilungsreaktion, mit dem Aufkommen von Myofibroblasten, die in der Linse als Posterior capsu bekannt verbundenle Die Trübung 20-22. Um die Kataraktchirurgie Wundheilung Modell zu erzeugen, wird eine Katarakt-Operation Verfahren in Linsen von der Hühnerembryo-Auge entfernt, um eine physiologische Verletzung produzieren nachgeahmt. Mikro Entfernung von Linsenfaserzellen führt zu einer sehr konsistenten kreisWundBereich durch die epithelialen Linsenzellen umgeben. Diese Zellpopulation bleibt fest an der Linsenkapsel befestigt Basalmembran und durch das chirurgische Verfahren verletzt. Die Epithelzellen wandern auf der defektfreien Bereich des endogenen Basalmembran, um die Wunde, von einer Bevölkerung von Vimentin reichen mesenchymalen Zellen in der Reparatur als Führer Zellen 1 bekannt, führte zu heilen. Mit diesem Modell wird die Antwort eines Epithels, um Verletzungen können leicht visualisiert und anschließend mit der Zeit im Zusammenhang mit der Zellen-Mikroumgebung werden. Die Zellen sind leicht zugänglich für Modifikationen der Expression oder Aktivierung der Moleküle erwartet, eine Rolle bei der Wundheilung spielen. Eine leistungsstarke Funktion von thist ein Modell ist die Fähigkeit, zu isolieren und zu untersuchen Migration spezifische Veränderungen im Rahmen der Wundheilung. Die Fähigkeit, eine große Anzahl von im Alter abgestimmt ex vivo Wundheilungs Kulturen für Studien vorzubereiten, ist ein weiterer Vorteil dieses Modells. Somit liefert diese Modellsystem eine einzigartige Gelegenheit, auf ihre Wirkung auf die Wundheilung necken neben Mechanismen der Wundheilung und Test Therapeutika. Die ex vivo mock Kataraktchirurgie Modell wird erwartet, dass eine breite Anwendbarkeit haben, die eine kritische Ressource für das Studium Mechanismen der Schädigung zu reparieren.

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Anwendung bei 140 mM in TD-Puffer</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Verwendung bei 5 mM in TD-Puffer</td></tr><tr><td>Natriumphosphat (Na2HPO4)</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td>Anwendung bei 0,7 mM in TD-Puffer</td></tr><tr><td>D-Glukose (Dextrose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td>Anwendung bei 0,5 mM in TD-Puffer</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Verwendung bei 8,25 mM in TD-Puffer</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>Verwendung bis pH TD-Puffer bis 7,4</td></tr><tr><td>Medien 199</td><td>GIBCO</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Corning/CellGro</td><td>25-005-CI</td><td>Verwendung bei 1% in Medien199</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Corning/ CellGro</td><td>30-002-CI</td><td>Verwendung bei 1% in Medien199</td></tr><tr><td>100 mm Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711Z</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Filtereinheit</td><td>Millipore</td><td>SCGPU01RE</td><td>Zur Filterung von sterilen Medien</td></tr><tr><td>verwenden Dumont #5 Pinzette (2 erforderlich)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Zellkulturschale</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>27 g 1 ml SlipTip mit Präzisions-Gleitnadel</td><td>BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>Andere benötigte Artikel: Allgemeine Sezierinstrumente, &nbsp; fruchtbare weiße Leghorn-Hühnereier, Check Egg Inkubator (befeuchtet, 37,7 Grad; C), Laminar-Flow-Haube, binokulares Stereovisionsmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

einrichtung von einem klinisch relevanten<em&gt; ex vivo</em&gt; mock kataraktchirurgie modell zur untersuchung von epithelialen wundheilung in einer nativen mikromilieu

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Das Haupthindernis für das Verständnis, wie ein Epithelgewebe die Wundreparatur durchführt, ist die begrenzte Verfügbarkeit von Modellen, in denen es möglich ist, die Wundreaktion ex vivo in einer Umgebung zu verfolgen und zu manipulieren, die der Verletzung von Epithelgewebe in vivo sehr ähnlich ist. Dieses Problem wurde durch die Erstellung eines klinisch relevanten epithelialen ex vivo Verletzungsreparaturmodells auf der Grundlage der Kataraktchirurgie gelöst. In diesem Kulturmodell kann die Reaktion des Linsenepithels auf die Verwundung live in der nativen Mikroumgebung der Zellen verfolgt werden, und die molekularen Mediatoren der Wundreparatur können während des Reparaturprozesses leicht manipuliert werden. Zur Vorbereitung der Kulturen werden Linsen aus dem Auge entnommen und ein kleiner Schnitt im vorderen Bereich der Linse gemacht, von dem die innere Masse der Linsenfaserzellen entfernt wird. Bei diesem Verfahren entsteht eine kreisförmige Wunde an der hinteren Linsenkapsel, der dicken Basalmembran, die die Linse umgibt. Dieser Wundbereich, an dem die Faserzellen befestigt wurden, befindet sich direkt neben einer durchgehenden Monoschicht aus Linsenepithelzellen, die während des chirurgischen Eingriffs mit der Linsenkapsel verbunden bleibt. Das verwundete Epithel, der Zelltyp, von dem Faserzellen während der Entwicklung abgeleitet werden, reagiert auf die Verletzung der Faserzellentfernung, indem es sich kollektiv über den Wundbereich bewegt, angeführt von einer Population von Vimentin-reichen Reparaturzellen, deren mesenchymale Vorläuferzellen endogen für die Linsesind 1. Diese Eigenschaften sind typisch für eine normale epitheliale Wundheilungsreaktion. In diesem Modell, wie auch in vivo, hängt die Wundreparatur von Signalen ab, die von der endogenen Umgebung geliefert werden, die in diesem ex vivo-Kultursystem einzigartig aufrechterhalten wird, was eine ideale Gelegenheit bietet, die Mechanismen zu entdecken, die die Reparatur eines Epithels nach einer Verwundung regulieren.

Ex-vivo-Modell erstellt, um den Wundheilungsprozess in nativen Mikroumgebung der Zellen zu studieren Mechanismen bei der Regulierung der Wundheilung eines Epithels im nativen Mikroumgebung der Zellen beteiligt zu untersuchen, wurde eine klinisch relevante ex vivo mock Kataraktchirurgie-Modell erstellt. Dieses Modell wird von Linsengewebe, die viele Vorteile aufgrund seiner inhärenten Eigenschaften bietet erstellt: 1) das Objektiv ist ein in sich geschlossenes Orgel durch ei...

Hier wird die Etablierung eines klinisch relevanten ex vivo Schein-Kataraktchirurgie-Modells beschrieben, das zur Untersuchung von Mechanismen der Verletzungsreaktion von Epithelgeweben in ihrer nativen Mikroumgebung verwendet werden kann.

Einrichtung von einem klinisch relevanten<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Kataraktchirurgie Modell zur Untersuchung von epithelialen Wundheilung in einer nativen Mikromilieu

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein klinisch relevantes Modell zu erstellen, bei dem die Wundheilung in ihrem natürlichen Mikromilieu verfolgt werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst die Linse aus dem Auge eines Hühnerembryos entfernt wird. Der zweite Schritt besteht darin, einen kleinen Einschnitt in der vorderen Region der Linse vorzunehmen.Anschließend wird die Linsenfasermasse durch Hydroelution gewonnen. Danach wird die Linsenkapsel mit dem zugehörigen Epithel durch zusätzliche Einschnitte in der vorderen Kapsel abgeflacht. Der letzte Schritt besteht darin, die verletzte Kultur in der Zellkulturschale zu fixieren, um die Wundheilung während ihres Verlaufs zu verfolgen.Schließlich werden Zeitraffermikroskopie, konfokale Mikroskopie und biochemische Analysen verwendet, um die Mechanismen der Wundheilung in einem Modell aufzuzeigen, das die in-vivo-Umgebung eng widerspiegelt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Wundheilung zu beantworten, beispielsweise wie Zellen koordiniert zusammenwandern, um die Wunde zu schließen. Obwohl diese Methode Einblicke in den Prozess der Wundreparatur ermöglichen kann.Es kann auch bei Untersuchungen der Wundheilung im Zusammenhang mit ABER, insbesondere Fibrose und Narbenbildung, angewendet werden. Beginnen Sie damit, drei 100-Millimeter-Petri-Schalen in einer sterilen Flüssigkeitsströmungskammer zu platzieren. Füllen Sie zwei der Petri-Schalen zur Hälfte mit Tris-Dextrose-Puffer bei Raumtemperatur und lassen Sie die dritte leer.Entfernen Sie dann ein fruchtbares Embryonal-Tag-15-White-Leghorn-Hühnchenei aus dem 37,7 Grad Celsius warmen Inkubator und reinigen Sie die Außenseite der Schale mit 70 % Ethanol, um sie zu sterilisieren. Schlagen Sie anschließend das Ei vorsichtig auf und geben Sie den Inhalt in die leere 100-Millimeter-Petri-Schale. Köpfen Sie mithilfe einer Standardpinzette und einer feinen Schere den Embryo und legen Sie den Kopf in eine der Schalen, die den TST-Dextrose-Puffer enthalten.Binnen 15 Minuten wird der Embryokopf auf den Deckel einer Petrischale verbracht. Mit hochpräzisen Pinzetten wird die Augenhinterseite eingeklemmt, um eine kleine Öffnung an der Augenhinterseite zu erzeugen. Anschließend wird mit der Pinzette das Glaskörpergel erfasst und unter rollender Bewegung vorsichtig daran gezogen.Der Glask&ouml;rper mit dem angeh&auml;ngten Linsen wird sich aus dem Auge l&ouml;sen. Legen Sie die Linse und den Glask&ouml;rper in die verbleibende Petrischale mit Tex-extras-Puffer. Lassen Sie die Linsen nicht l&auml;nger als 30 Minuten im Puffer, bevor Sie mit der Dissektion fortfahren.Als Nächstes versetzen Sie die Linse mit hochpräzisen Präparationsbestecken unter einem Stereomikroskop in einen neuen Petrischalen-Deckel und entfernen vorsichtig mit der Kante der Pinzette alle Ziliekörperzellen, die zusammen mit der Linse gelöst wurden. Trennen Sie anschließend die Linse vom Glaskörper, indem Sie den Glaskörper von seiner Verbindung mit der hinteren Linsenkapsel abklemmen. Nach der Trennung überführen Sie die Linse in einen Tropfen Tris-Dextrose-Puffer von 200 Mikrolitern in einer 35-Millimeter-Zellkulturschale und positionieren sie so, dass die vordere Seite der Linse nach oben zeigt.Das vordere Linsensegment ist leicht anhand eines dichten Rings im Gewebe erkennbar, der die Grenze zwischen dem inneren und dem äquatorialen Bereich des Linsenepithels markiert. Mit zwei hochpräzisen Pinzetten wird ein kleiner Einschnitt von etwa 850 Mikrometern Länge in der Mitte der vorderen Linsenkapsel erzeugt, indem das Gewebe mit je einer Pinzette in jeder Hand erfasst und vorsichtig in entgegengesetzte Richtungen gezogen wird. Danach nimmt man eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer Nadel der Stärke 27,5 und füllt sie mit 300 Mikrolitern TST-Dextrose-Puffer.Führen Sie die Nadelspitze in den Einschnitt in der vorderen Linsenkapsel ein, etwa bis zur halben Tiefe der Linse. Drücken Sie dann vorsichtig die Spritze zusammen, um den TST-Dextrose-Puffer in die Linse zu injizieren. Fasermassenzellen.Injizieren Sie zwischen 50 und 200 Mikroliter Puffer, um die Faserzellmasse vom umgebenden Epithel und der Linsenkapsel zu lösen. Injizieren Sie niemals mehr als 300 Mikroliter. Entfernen Sie mithilfe von hochpräzisen Pinzetten die gelöste Faserzellmasse durch die vordere Inzisionsstelle aus der Linse.Die Entfernung der Faserzellmasse von ihrer Verankerung an der hinteren Kapsel erzeugt einen hochgradig reproduzierbaren Wundbereich auf der Basalmembran, der von dem verletzten Epithel umgeben ist. Beginnen Sie mit der Kapselhülle und führen Sie fünf Schnitte in den vorderen Bereich der Linse bis hin zum Äquator durch. Breiten Sie die resultierenden fünf Klappen der Linsenkapsel mit dem daran befestigten Epithel in der Kulturschale so aus, dass die Kapselseite nach unten und die Zellseite nach oben zeigt.Drücken Sie mit der Pinzette an jedem Punkt des Sterns leicht nach unten, um die Kapsel in der Schale zu befestigen. Dies erzeugt eine kleine Vertiefung an den fünf äußersten Spitzen des x explan und führt zu einer dauerhaften Anheftung an der Schale. Anschließend entfernen Sie den Tris-Dextrose-Puffer aus der 35-Millimeter-Schale und ersetzen ihn durch 1,5 Milliliter vorgewärmtes M199.Medium, das mit 1 % L-Glutamin und Penicillin ergänzt wurde. Streptomycin bedeckte die Petrischale mit ihrem Deckel und stelle sie in den Inkubator. Stellen Sie die Kulturschale unter das Stereomikroskop und beobachten Sie die Abgrenzung zwischen der zentralen Migrationszone und der ursprünglichen Anheftungszone der epithelialen Zellen.Verwenden Sie dann zwei hochpräzise Pinzetten, um die Ränder beider Seiten der Begrenzungslinie zwischen den beiden Zonen zu erfassen. Ziehen Sie vorsichtig an der ursprünglichen Anhaftungszone entlang der Linie, um die beiden Zonen leicht zu trennen. Setzen Sie die Trennung der beiden Zonen entlang der gesamten Kultur fort, bis die beiden Bereiche vollständig getrennt sind.Untersuchen Sie die beiden Fraktionen mithilfe standardmäßiger molekularer oder biochemischer Analysetechniken. Unmittelbar nach dem Entfernen der Faserzellmasse wird eine Teilpopulation von Ment-enrich Mesenchymal-Reparaturzellen aktiviert und wandert zur Wundkante des Epithels. Diese Zellen bewegen sich rasch in den zellfreien Bereich der endogenen Basalmembrankapsel, die zentrale Migrationszone, um die Heilung einzuleiten.Die Wunde, die mit der hier beschriebenen Technik präpariert wurde, eignet sich hervorragend als Modellsystem, um diesen Prozess unter dem Mikroskop oder mit einer Videokamera zu beobachten. Die Wundheilung schreitet schnell voran und bedeckt bereits am ersten Kultivierungstag einen beträchtlichen Teil der Wunde. Bis zum dritten Tag ist der Wundheilungsprozess in der Regel abgeschlossen, nachdem die zentrale Migrationszone und die ursprüngliche Anheftungszone voneinander getrennt wurden. Molekulare Unterschiede zwischen diesen beiden klar abgegrenzten Zonen wurden hier analysiert.Die Spiegel der fokalen Adhäsionskinase wurden in den beiden Zonen gemessen, und die Menge an phosphorylierter fokaler Adhäsionskinase erwies sich als erhöht in der migrationspezifischen zentralen Migrationszone. Sobald die Technik beherrscht ist, kann die simulierte Kataraktoperation innerhalb von drei Minuten abgeschlossen werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Videos angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Modell für eine simulierte Kataraktoperation erstellt, das der Wundheilung in einem natürlichen Mikromilieu eng nachempfunden ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Eine Primärkultur von Rinder Endothelzellen wurde verwendet, um den Mechanismus der Cornea-Endothelzellen-mesenchymale Transition zu untersuchen. Weiterhin wurde eine Ratte Hornhautendothel cryoinjury Modell kornealen Endothel-mesenchymale Transition in vivo zu demonstrieren.

In vitro und in vivo Modelle Corneal Endothelial-mesenchymale Transition zu studieren

Dieses Manuskript wird beschrieben, wie Schnitt-ähnliche Läsionen am kultivierten Epithelzelle Monolagen günstig Modell Heilung in-vitro-, so dass für die Bildgebung durch konfokale gewickelt oder laser-scanning-Mikroskopie, und die bieten qualitativ hochwertige quantitative und qualitative Daten für das Studium Zelle Verhalten und die Mechanismen, die bei der Migration.

Mikroskopie-basierten Methoden für die Beurteilung der Epithelzelle Migration bei der In-vitro- Wundheilung

Ein Protokoll für eine Ex Vivo Hornhaut Orgel Kulturmodells nützlich für Wundheilung Studien beschrieben wird. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Agenten, regenerative Heilung zu fördern oder Medikamententoxizität in einer organisierten mehrzelligen 3D-Umgebung.

Ex Vivo Wundheilung Hornhaut Orgel Kulturmodells für Studien

Hier stellen wir ein Protokoll zur Ablösung von hornhauten Endothelzellen (CEC) von Descemets Membran (DM) unter Verwendung eines Neodym:YAG (Nd:YAG) Lasers als Ex-vivo-Krankheitsmodell für bullöse Keratopathie (BK) vor.

Entwicklung eines nichtinvasiven, laserunterstützten Versuchsmodells des cornealen Endotheliaalzellverlustes

Hier demonstrieren wir eine optimierte Technik zur Beurteilung der Wundreparatur mit ex vivo menschlicher Haut in Kombination mit einem Whole-Mount-Färbeansatz. Diese Methodik bietet eine präklinische Plattform für die Bewertung potenzieller Wundtherapien.

Humanes Ex-vivo-Wundmodell und Whole-Mount-Färbeansatz zur genauen Bewertung der Hautreparatur

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer zentralen Hornhautepithelabriebwicklung in der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud beschrieben. Dieses Hornhautwundheilungsmodell ist hochgradig reproduzierbar und wird nun verwendet, um eine kompromittierte Hornhautwundheilung im Zusammenhang mit Krankheiten zu bewerten.

Ein epitheliales Abriebmodell zur Untersuchung der Hornhautwundheilung

Hier werden Tiermodelle auf der Basis von Maus und Kaninchen für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels entwickelt, um neue Therapeutika und den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen.

Ex vivo und in vivo Tiermodelle für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels

Das vorliegende Protokoll zeigt die verschiedenen Schritte auf, die bei der Wunde der Hornhaut eines embryonalen Kükens in Ovo erforderlich sind. Die regenerierenden oder vollständig wiederhergestellten Hornhäute können nach dem Wundvorgang mit verschiedenen zellulären und molekularen Techniken auf Regenerationspotenzial analysiert werden.

Untersuchung der narbenlosen Geweberegeneration bei embryonalen verwundeten Kükenhornhäuten

In diesem Artikel wird ein Protokoll beschrieben, um den Prozess zu vereinfachen und die Herstellung von autologem konditioniertem Serum (ACS) kostengünstiger zu machen. Es werden keine speziellen Spritzen oder oberflächenbeschichteten Glasperlen benötigt. Darüber hinaus hat das modifizierte ACS (mACS) bei der Hornhautwundheilung von murinen Augen ex vivo Wettbewerbsvorteile gegenüber herkömmlichem autologem Serum.

Herstellung eines modifizierten autologen konditionierten Serums und ex vivo Beurteilung des Heilungspotentials im murinen Hornhautepithel

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Erzeugung von Wunden im Epithel einer lebenden Clytia hemisphaerica medusa und zur Abbildung der Wundheilung mit hoher Auflösung in vivo. Darüber hinaus wird eine Technik vorgestellt, mit der Farbstoffe und Medikamente eingesetzt werden können, um Signalprozesse in den Epithelzellen und der extrazellulären Matrix während der Wundheilung zu stören.

Charakterisierung der epithelialen Wundheilung in vivo am Nesseltier-Modellorganismus Clytia hemisphaerica

Diese Methode modelliert die Kataraktchirurgie in vivo , indem Linsenfaserzellen von adulten Mäusen entnommen und der Kapselsack mit angehängten Linsenepithelzellen (LECs) zurückgelassen wird. Das Verletzungsansprechen wird dann zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Operation anhand molekularer und morphologischer Kriterien beurteilt.

Modellierung der Kataraktchirurgie bei Mäusen

Lernen Sie die Einrichtung eines ex vivo Kataraktchirurgie-Modells zur Untersuchung epithelialer Wundheilung in nativem Mikromilieu. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbeobachtung von Reparaturmechanismen.

Einrichtung von einem klinisch relevanten Ex Vivo Mock Kataraktchirurgie Modell zur Untersuchung von epithelialen Wundheilung in einer nativen Mikromilieu (Video) | JoVE Journal

Einrichtung von einem klinisch relevanten

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