Einrichtung von einem klinisch relevanten Ex Vivo Mock Kataraktchirurgie Modell zur Untersuchung von epithelialen Wundheilung in einer nativen Mikromilieu

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein klinisch relevantes Modell zu schaffen, in dem die Wundheilung in ihrer nativen Mikroumgebung verfolgt werden kann. Dies wird erreicht, indem zuerst die Linse aus dem Auge eines Hühnerembryos entfernt wird. Der zweite Schritt besteht darin, einen kleinen Schnitt im vorderen Bereich der Linse zu machen.

Dann hydroeluieren Sie die Linsenfaserzellenmasse. Als nächstes wird die Linsenkapsel mit dem zugehörigen Epithel abgeflacht, indem zusätzliche Schnitte in der vorderen Kapsel vorgenommen werden. Der letzte Schritt besteht darin, die verwundete Kultur auf der Gewebekulturschale zu befestigen, um die Wundheilung zu verfolgen.

Letztendlich werden Zeitraffermikroskopie, konfokale Mikroskopie und biochemische Analysen verwendet, um die Mechanismen der Wundheilung in einem Modell zu zeigen, das die in vivo-Umgebung genau rekapituliert. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Wundheilung zu beantworten, z. B. wie sich Zellen koordiniert zusammenbewegen, um die Wunde zu schließen. Diese Methode kann jedoch einen Einblick in den Prozess der Wundheilung geben.

Es kann auch auf Studien zur WUNDHEILUNG von ABER angewendet werden, insbesondere bei Fibrose und Narbenbildung. Beginnen Sie damit, drei 100-Millimeter-Petrischalen in eine sterile Laminar-Flow-Haube zu stellen. Füllen Sie zwei der Petrischalen zur Hälfte mit Tris-Dextrose-Puffer bei Raumtemperatur, die dritte bleibt leer.

Nehmen Sie dann ein befruchtetes embryonales weißes Leghorn-Küken-Ei vom Tag 15 aus dem 37,7 Grad Celsius heißen Inkubator und reinigen Sie die Außenseite der Schale mit 70 % Ethanol, um sie zu sterilisieren. Schlagen Sie dann das Ei vorsichtig auf und geben Sie den Inhalt in die leere 100-Millimeter-Petrischale. Enthaupten Sie den Embryo mit einer Standardzange und einer feinen Schere und legen Sie den Kopf in eine der Schalen, die den TST-Dextrosepuffer enthalten.

Bewegen Sie innerhalb von 15 Minuten den Kopf des Hühnerembryos auf einen Deckel der Petrischale. Verwenden Sie eine hochpräzise Pinzette, um den hinteren Teil des Auges einzuklemmen, wodurch eine kleine Öffnung im hinteren Teil des Auges entsteht. Fassen Sie dann den Glaskörper mit einer Pinzette und ziehen Sie mit der Rollbewegung sanft am Glaskörper.

Der Glaskörper mit der aufgesetzten Linse löst sich aus dem Auge. Legen Sie die Linse und den Glaskörper in die restliche Petrischale, die Tex Extras Buffer enthält. Lassen Sie die Linsen nicht länger als 30 Minuten im Puffer verbleiben, bevor Sie mit der Dissektion fortfahren.

Bewegen Sie dann die Linse auf einen neuen Petrischalendeckel unter einem Präpariermikroskop mit einer hochpräzisen Pinzette und bürsten Sie vorsichtig alle Ziliarkörperzellen ab, die mit der Linse mit dem Rand der Pinzette gelöst wurden. Trennen Sie dann die Linse vom Glaskörper, indem Sie den Glaskörper aus seiner Verbindung mit der hinteren Linsenkapsel abkneifen. Nach dem Trennen geben Sie die Linse in einen 200-Mikroliter-Tropfen Tris-Dextrose-Puffer in einer 35-Millimeter-Gewebekulturschale und richten Sie sie so aus, dass die vordere Seite der Linse nach oben zeigt.

Der vordere Teil der Linse ist leicht an einem dichten Ring im Gewebe zu erkennen, der die Grenze zwischen der inneren und äquatorialen Region des Linsenepithels markiert. Machen Sie mit zwei hochpräzisen Pinzetten einen kleinen Schnitt von etwa 850 Mikrometern Länge in der Mitte der vorderen Linsenkapsel, indem Sie das Gewebe mit einer Pinzette in jeder Hand greifen und sanft in entgegengesetzte Richtungen ziehen. Nehmen Sie als Nächstes eine Ein-Milliliter-Spritze mit der 27,5-Gauge-Nadelspitze und füllen Sie sie mit 300 Mikrolitern TST-Dextrosepuffer.

Führen Sie die Nadelspitze in den Schnitt in der vorderen Linsenkapsel und etwa zur Hälfte in die Linse ein. Drücken Sie dann vorsichtig auf die Spritze und injizieren Sie den TST-Dextrosepuffer in die Linse. Masse der Faserzelle.

Injizieren Sie zwischen 50 und 200 Mikroliter Puffer, um die Faserzellmasse vom umgebenden Epithel und der Linsenkapsel zu lösen. Injizieren Sie niemals mehr als 300 Mikroliter. Entfernen Sie mit einer hochpräzisen Pinzette die gelöste Faserzellenmasse durch die vordere Schnittstelle von der Linse.

Durch die Entfernung der Faserzellmasse aus ihrem Ansatz an der hinteren Kapsel entsteht ein hochreproduzierbarer Wundbereich auf der Basalmembran, der vom verwundeten Epithel umgeben ist. Beginnend mit dem Kapselsack machen Sie fünf Schnitte in die vordere Seite der Linse und bis zum Äquator. Glätten Sie die resultierenden fünf Lappen der Linsenkapsel mit dem anhaftenden Epithel auf der Kulturschale mit der Kapsel nach unten und der Zellseite nach oben.

Drücken Sie mit der Pinzette an jedem Punkt des Sterns sanft nach unten, um die Kapsel an der Schale zu befestigen. Dadurch entsteht eine kleine Vertiefung an den fünf äußersten Spitzen des x Explans und führt zu einer dauerhaften Befestigung an der Schale. Entfernen Sie dann den Tris-Dextrose-Puffer aus der 35-Millimeter-Schale und ersetzen Sie ihn durch 1,5 Milliliter M1 99 aus der Vorkriegszeit.

Medium, ergänzt mit 1% L-Glutamin und Penicillin. Streptomycin bedeckte die Schale mit seinem Deckel und stellte sie in den Inkubator. Stellen Sie die Kulturschale unter das Präpariermikroskop und beobachten Sie die Abgrenzung zwischen der zentralen Migrationszone und der ursprünglichen Anheftungszone der Epithelzellen.

Greifen Sie dann mit zwei hochpräzisen Pinzetten die Kante beider Seiten der Demarkationslinie zwischen den beiden Zonen. Ziehen Sie die ursprüngliche Befestigungszone vorsichtig entlang der Linie, um die beiden Zonen leicht zu trennen. Fahren Sie fort, die beiden Zonen um die gesamte Kultur herum zu trennen, bis die beiden Regionen vollständig getrennt sind.

Untersuchen Sie die beiden Fraktionen mit molekularen oder biochemischen Standardanalysetechniken. Unmittelbar nach der Entfernung der Faserzellmasse wird eine Subpopulation von menenchymalen Reparaturzellen aktiviert und wandert an den Wundrand des Epithels. Diese Zellen wandern schnell in den zellfreien Bereich der endogenen Basalmembrankapsel, die zentrale Migrationszone, um mit der Heilung zu beginnen.

Die Wunde, die hier beschriebene Technik, bereitet dieses Modellsystem perfekt darauf vor, diesen Prozess mit einem Mikroskop oder einer Videokamera zu betrachten. Die Wundheilung schreitet schnell voran und deckt am ersten Tag der Kultur einen signifikanten Bereich der Wunde ab. Am dritten Tag ist der Wundheilungsprozess in der Regel abgeschlossen, nachdem die zentrale Migrationszone und die ursprüngliche Attachmentzone getrennt wurden. Hier wurden molekulare Unterschiede zwischen diesen unterschiedlichen Zonen analysiert.

Die Konzentrationen der fokalen Adhäsionskinase wurden in den beiden Zonen gemessen, und es wurde festgestellt, dass die Menge an phosphorylierter, fokaler Adhäsionskinase in der migrationsspezifischen zentralen Migrationszone erhöht war. Einmal gemeistert, kann diese Technik der Schein-Kataraktoperation in drei Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein simuliertes Katarakt-Operationsmodell erstellen, das die Wundreparatur in einer natürlichen Mikroumgebung genau nachahmt.