Name: Screening-Lebensmittel, die für Klasse 1 und Integrons Genkassetten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Klasse-1-Integrons und Antibiotikaresistenz-Gene in Lebensmitteln mit PCR und DNA-Sequenzierung nachweisen. Dieses Protokoll ermöglicht die Überwachung von Resistenzgenen in der Nahrungskette.

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Dank Michaela Hall, Larissa Bispo und Gustavo Tavares für technische Hilfe.

Lebensmittel, die roh gegessen werden oder leicht gekocht sind die größten Bedenken für die menschliche Gesundheit. Beispiele hierfür sind Salat Gemüse, Obst, Schalen- und Krustentieren. 1. Probenentnahme <ol><li> Die Proben werden unter Bedingungen, die Kontamination zu minimieren, und in getrennte, saubere Säcke beim Transport gespeichert. Sobald sie aufgenommen sind, sind die Proben bei 4 ° C gelagert und innerhalb von 24 Stunden verarbeitet werden. </li></ol> 2. Enriched Kultur Vorbereitung <ol><li> Obst und Gemüse: <ol><li> Zeigen ca. 10 g Material in einem haltbaren Kunststoffbeutel. Wenn Verarbeitung größerer Material, konzentrieren sich auf die Haut der Frucht oder Gemüse. 90 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 und Verfahren in einem Schaufelmischer für 30 Sekunden. Alternativ kann das Material von Hand bewegt werden, wenn eine Blattmischer ist nicht verfügbar. </li><li> Sammeln Sie die Flüssigkeit in zwei 50 ml-Falcon-Röhrchen. Zentrifugenröhrchen bei 4000 × g für 7 min zu Pellets Bakterien. </li&gt; <li> In 30 ml sterile Luria Bertani (LB) Brühe Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und suspendieren die pelletierten Bakterien. </li><li> Inkubieren auf einem Schüttler O / N, hält eine Röhre bei 25 ° C und die andere bei 37 ° C. Die Kulturen sollten bei 200 Schwingungen pro Minute (OPM) geschüttelt werden. Speicher-Kulturen bei 4ºC bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Meeresfrüchte: <ol><li> Sezieren den Magen (Austern) oder Verdauungstrakt (Garnelen) mit einer sterilen Pinzette und Pinzette und in einen sterilen 1,5-ml-Röhrchen mit 200 ul 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0. Mazeration der Probe um ein Homogenat zu erstellen. </li><li> Verzichtet werden 5 ml LB-Brühe in zwei sterile 5 ml Röhrchen und impfen jeweils mit der Meeresfrüchte Homogenat. </li><li> Inkubieren auf einem Schüttler O / N, hält eine Röhre bei 25 ° C und die andere 37 ° C. Die Kulturen sollten bei 200 opm geschüttelt werden. Speicher-Kulturen bei 4ºC bis zur Verwendung. </li></ol></li></ol> 3. Screening Kulturen für Integrons <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Hinweis: Standard-PCR-Protokolle werden in dieser Methode verwendet wird, unter Verwendung von Puffern mit dem Enzym zugeführt wird, und eine abschließende MgCl 2 -Konzentration von 2,5 mM. Falls erforderlich, hat Lorenz (2011) 24 PCR-Optimierung und Methoden zur Problembehandlung in einer früheren Ausgabe dieser Zeitschrift beschrieben. <ol><li> Gekochte DNA-Präparation: <ol><li> Dispense 100 ul angereicherten Kultur in ein steriles 0,5 ml PCR-Röhrchen. Erhitzen Sie die Probe auf 99 ° C für 10 Minuten, mit einem Wasserbad oder Wärmeblock. Snap Chill auf Eis für 2 min. </li><li> Mikrozentrifuge bei 14.000 × g für 5 min, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Zurück zu Eis. DNA-Proben können bei -20 ° C eingefroren werden, bis sie benötigt wurden, sondern muss auf Eis aufgetaut werden. </li></ol></li><li> Screening für Klasse 1 Integrons mittels PCR: ANMERKUNG: Mischkulturen aus dem O / N Inkubation für Klasse 1 Integrons Verwendung des HS463a / HS464-PCR-Protokoll (Tabelle 1) untersucht. <ol><li> Auftauen alle PCR-Reagenzien auf Eis, weg von jeder potenzielle souRCEs kontaminierender DNA. Make-up 48 &amp; mgr; l PCR Mastermix pro Probe, einschließlich Negativkontrollen (Tabelle 2). Verzichtet werden 48 ul der PCR-Master-Mix zu jedem Röhrchen mit Barrierespitzen. </li><li> In 2 ul DNA aufgetaut, um einzelne PCR-Gefäße mit Barriere-Tipps. Führen entsprechende Programm in der PCR-Thermocycler. </li><li> Um die Ergebnisse der Verstärkung zu bewerten, Elektrophorese 7 ul des PCR-Produkts auf einem 2% Agarosegel gegossen und in TBE-Puffer (90 mM Tris-Borat, 2 mM EDTA) durchgeführt. Gehören ein Molekulargewichtsmarker, wie beispielsweise ein 100 bp Leiter. </li><li> Beitrag färben das Gel mit einem DNA-Färbung, und visualisieren mit einem UV-Transilluminator. Überprüfen Sie, hat es keine Verstärkung in der negativen Kontrolle. Eine starke Bande bei etwa 470 bp für eine bestimmte Probe zeigt, dass die Mischkultur enthält Bakterien, die eine Klasse 1 Integron tragen. Reine Kolonien werden nun von einem beliebigen Mischkultur, die einen positiven PCR zurück isoliert werden. </li></ol></li></ol><ol><li> Reihenverdünnungen und Verbreitung Platten: ANMERKUNG: Um einzelne Kolonien aus den PCR-positiven Mischkulturen zu isolieren, wird der Mischkultur seriell 10-fach verdünnt in Natriumphosphatpuffer und ausplattiert, um einzelne Kolonien zu gewinnen dann. <ol><li> 1 ml der Mischkultur zu 9 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 und Mischen durch Umdrehen. 1 ml der Verdünnung auf eine weitere 9 ml Phosphatpuffer, und wiederholen, bis eine serielle Verdünnung von 10 -8 erreicht ist. </li><li> Striches 100 ul der 10 -4 bis 10 -8 Verdünnungen auf LB Agar, doppelt vorhanden. Die Platten O / N Inkubieren bei der gleichen Temperatur für die anfängliche Mischkultur verwendet wird. Die Platten können dann bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden, jedoch ist es am besten, um die einzelnen Kolonien ziemlich umgehend bearbeiten. </li></ol></li><li> Einzelkolonie Auswahl und gekochten DNA-Präparation: <ol><li> Wählen Sie einzelne Kolonien aus den Verdünnungsplatten, selecting so viele verschiedene Kolonietypen wie möglich, anhand von Kriterien wie Koloniegröße, Form und Farbe. Verwenden sterilen Zahnstochern zu Einzelkolonien aus der Verbreitung Platte auswählen. </li><li> Tippen Sie auf die Zahnstocher in die Kolonie, und dann in ein PCR-Röhrchen, das 100 &amp; mgr; l sterilem Wasser zu übertragen. Wenn eine große Anzahl von Kolonien zu sehen sein, dann können Kolonien in einer Mikrotiterplatte hergestellt werden. Drehen Sie die Zahnstocher zwischen den Fingern, um einige der Zellen in das Wasser zu entfernen. </li><li> Mit der gleichen Zahnstocher, impfen eine LB-Platte mit einem Streifen von der Kolonie. Eine große Zahl von Kolonien auf markierten Platten gespeichert werden, wenn jeder Streifen etwa 1 cm lang. Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 3, bis Sie eine geeignete Anzahl von Isolaten ausgewählt haben. </li><li> Inkubieren LB Platten O / N, bei der gleichen Temperatur wie bei der anfänglichen Anreicherungskultur verwendet. Kulturen können dann bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Zur Herstellung von DNA aus den Bakteriensuspensionen, gehen Sie wie ouin Abschnitt 3.1 tlined. Für das Screening von Reinkultur Lysaten, führen Sie die HS463a / HS464 PCR, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben. Isolate, dass eine positive Rück PCR wird zur Herstellung von genomischer DNA (Abschnitt 5) verwendet werden, und für weitere Analysen. </li></ol></li></ol> 5. Die genomische DNA Extraktion von Integron-positive Einzelkolonien Mit Bead Beating 25 <ol><li> Impfen 5 ml LB-Brühe mit einer Probe der Reinkultur isoliert in Abschnitt 4.2. Inkubieren O / N, bei gleicher Temperatur, die für die anfängliche Anreicherungskultur verwendet wurde Schütteln. </li><li> Pellet-Zellen bei 4.000 g für 7 min, dann entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren der pelletierten Zellen in 1 ml CLS-TC-Lösung in einem Lysismatrix E schnell prep Rohr. Mit einer Perlmühle Mahlmaschine, verarbeiten die Probe bei 5,5 m / s für 30 s. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 14000 × g für 5 min und Wiederherstellen 700 ul Überstand in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Fügen Sie 700 ul Bindematrix verdünnt 1: 5 mit 6 M guanidinium Thiocyanat und mischen bei RT 5 min. Zentrifuge bei 14.000 × g für 1 min, Überstand verwerfen. </li><li> Zugabe von 800 ul Ethanolwaschsalz (70% Ethanol, 0,1 M Natriumacetat), vortexen, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist. Waschen für 5 min bei RT, Zentrifuge bei 14.000 · g für 1 min und Überstand verwerfen. Stellen Sie sicher, alle Überstand entfernt worden ist, mit einer Mikropipette bei Bedarf dann an der Luft trocknen lassen für 5 Minuten. </li><li> Das Pellet in 200 &amp; mgr; l Matrix TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,6) durch Auf- und Abpipettieren. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. Zentrifuge bei 14.000 × g für 3 min und Transfer 160 ul der eluierten DNA in einem sterilen Röhrchen. Führen Sie einen aliquoten Teil der genomischen DNA-Extraktion auf einem 2% w / v Agarosegel, um die Ausbeute und die Integrität der DNA-Extraktion zu überprüfen. Die gereinigte genomische DNA wird bei -20 ° C gelagert und auf Eis aufgetaut, wenn für die PCR-Tests erforderlich. </li></ol> 6. Diagnostische PCR und DNA-Sequenzierung HINWEIS: Derin Abschnitt 5 hergestellte genomische DNA wird für alle diagnostischen PCR verwendet werden, und um den positiven Test für Klasse 1 Integrons bestätigen. <ol><li> Auftauen genomischer DNA auf Eis, die DNA-Probe und Impuls Spin Vortexen bei 14.000 · g für 20 sec. Wiederholen Sie die PCR für die Klasse 1 Integron-Integrase-Gens unter Verwendung HS463a / HS464 (Tabelle 1), was bestätigt, dass das Isolat positiv für das 471 bp Amplikon (Abschnitt 3.2). </li><li> Identifizierung positiver Kulturen zur Art wird durch Analyse des kleinen rRNA-Untereinheit-Gens (16S rDNA) erreicht. Verstärken die 16S-Gens unter Verwendung von Primern F27 / r1492 (Tabelle 1). Überprüfen Sie die PCR-Produkte mit Hilfe der Elektrophorese. Alle bakterielle Ziele sollten einen 16S Amplikon von etwa 1450 bp zu erzeugen. </li><li> Sequenz des 16S-rRNA-Gen-Amplikons zu Spezies Identität zu bestimmen, da es jedoch wahrscheinlich mehrere positive PCRs aus Stufe 6.2 werden, und viele von diesen werden die gleichen positiven bakteriellen Spezies, werden wir zuerst unterscheiden verschiedene Arten using Restriktionsverdau der 16S-PCR-Produkt. <ol><li> Verdauen ein Aliquot der PCR-16S mit dem Restriktionsenzym Hinf 1. Jedes Enzym, das erkennt 4 bp Spaltstellen werden zu tun, aber Hinf 1 erzeugt gute Vielfalt von 16S-Ziele, und ist eine zuverlässige, kostengünstige Enzym. </li></ol></li><li> Bis 30 &amp; mgr; l Restriktionsmengen verdauen Mastermix (Tabelle 2) in einem sterilen Röhrchen und fügen Sie 20 ul un-purfied 16S-PCR-Produkt. Inkubieren in einem 37 ° C Wasserbad O / N. Überprüfen des Digests auf einem 2% Agarosegel. </li><li> Ergebnis der von Hinf 1 hergestellt Verdauung Mustern. Isolate mit derselben 16S Restriktionsprofil sind wahrscheinlich die gleichen Spezies. Anstatt Sequenzierung jedes 16S PCR-Produkt, Sequenz höchstens drei Vertretern jeder Hinf 1 Restriktionsmuster. </li><li> Aufreinigung der 16S-PCR-Produkte unter Verwendung eines kommerziellen Kits. Ein Einzelstrang-Exonuklease-Kit kann verwendet werden, aber anhand Spalte oder Fällungsverfahren auch gut zu entfernen unincorporated Primer und Einzelstrang-DNAs. Sequenz, die das 16S Amplicons unter Verwendung von Primer R910 (Tabelle 1), die Einrichtung, die Reaktionen, wie durch die Sequenzierung Anlage festgelegt. </li><li> Verwenden Sie das resultierende DNA-Sequenz, die NCBI DNA-Datenbank mit dem blastn Funktion (verhören <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). Mehr als 97% Nukleotid-Identität wird in der Regel als Arten Identität gemacht. </li></ol> 7. Kartierung und Charakterisierung von Integrons und Kassetten-Arrays HINWEIS: Klasse 1 Integrons von Menschen dominierten Ökosystemen ausgeh sind wahrscheinlich die häufigsten Integrons in allen Proben sein. Diese Integrons alle einen letzten einzigen Ursprung, und haben daher eine hoch konservierte DNA-Sequenz 5. <ol><li> Unterscheiden zwischen einer Klasse 1 Integrons aus menschlichen Quellen ausgehen und die, die in Umweltproben natürlich vorkommen, indem einPCR mit Primersatz intI1F165 / intI1R476 10 (Tabelle 1). HINWEIS: Klasse 1 Integrons von klinischen oder kommensalen Bakterien ein ~ 300 bp-Produkt zu erzeugen, während der Umweltklasse 1 Integrons wird jedes Produkt erstellen. </li><li> Charakterisierung der klinischen Integrons durch Verstärken der Kassette Array mit Primer-Set HS458 / HS459. Dieses PCR wird die Region zwischen intI1 und konservierten Segment der 3&#39;an der Endstation der meisten Kassetten Arrays zu verstärken. Da die Anzahl und die Identität der Kassetten variabel ist, wird die Größe des PCR-Produkts variieren. </li><li> Reinige Amplicons und Reihenfolge der DNA unter Verwendung jeder der Amplifikationsprimer. Verwenden Sequenzen DNA-Datenbanken mit dem blastn Funktion (verhören <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li><li> Stellen Sie sicher, die Benennung von Kassetten folgen standardisierte Nomenklatur 9, da viele Daten Abscheidungen für Integron Genkassettes verwenden inkonsistent oder nicht eindeutige Namen. Sie besonderes Augenmerk auf neue Gen-Kassetten, da diese neue Phänotypen kodieren, darunter Gene, die erhöhte Durchlässigkeit, Pathogenität oder Virulenz 8,21 verleihen. HINWEIS: Präklinische Formen des Klassen 1 Integron zirkulieren immer noch in der natürlichen Umwelt. Insbesondere diejenigen, die aktive Transposons Tn 402 verbunden sind, sind von besonderem Interesse 26. Die Kassette Arrays dieser Integrons nicht mit Primer-Set HS458 / HS459 verstärken, kann aber mit dem MRG284 / MRG285 Primer-Set (Tabelle 1) amplifiziert werden, erzeugen Amplikons variabler Größe abhängig von Kassetteninhalt. PCR-Produkte sollten gereinigt und DNA sequenziert, wie in 7.2 beschrieben. </li></ol>

<ol><li>Bush, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tackling antibiotic resistance.</a> Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).</li>
<li>Davies, J., Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+evolution+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Origins and evolution of antibiotic resistance.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).</li>
<li>Costa, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+is+ancient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance is ancient.</a> Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+consequences+of+antibiotic+use+for+the+resistome%2C+mobilome+and+microbial+pangenome%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome.</a> Front. Microbiol. 4, 4(2013).</li>
<li>Gillings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+class+1+integrons+and+the+rise+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance.</a> J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).</li>
<li>Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+relative+strength+of+tandem+promoters+for+the+antibiotic-resistance+genes+of+several+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons.</a> Gene. 142 (1), 49-54 (1994).</li>
<li>Partridge, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+attI1+site+of+class+1+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Definition of the attI1 site of class 1 integrons.</a> Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrons%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Integrons: Past, Present, and Future.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).</li>
<li>Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+cassettes+and+cassette+arrays+in+mobile+resistance+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).</li>
<li>Gillings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+class+1+integron-integrase+gene+as+a+proxy+for+anthropogenic+pollution%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution.</a> ISME J. In press, (2014).</li>
<li>Gaze, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impacts+of+anthropogenic+activity+on+the+ecology+of+class+1+integrons+and+integron-associated+genes+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment.</a> ISME J. 5, 1253-1261 (2011).</li>
<li>Gerzova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microbiota+composition+and+presence+of+selected+antibiotic+resistance+genes+in+carriage+water+of+ornamental+fish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish.</a> PLoS ONE. 9, e103865(2014).</li>
<li>Power, M., Emery, S., Gillings, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Into+the+wild%3A+dissemination+of+antibiotic+resistance+determinants+via+a+species+recovery+program%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program.</a> PLoS ONE. 8, e63017(2013).</li>
<li>Stokes, H. W., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+flow%2C+mobile+genetic+elements+and+the+recruitment+of+antibiotic+resistance+genes+into+Gram-negative+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).</li>
<li>Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+diversity+of+conjugative+plasmids+in+integron-carrying+bacteria+from+wastewater+environments%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments.</a> FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).</li>
<li>Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+and+composition+of+a+plasmid+metagenome+from+a+wastewater+treatment+plant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant.</a> J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).</li>
<li>Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+systems%3A+maintaining%2C+mixing+and+mobilising+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22TREE%22%5BJournal%5D)">Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance.</a> TREE. 26 (6), 278-284 (2011).</li>
<li>Stalder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+impact+of+hospital+effluent+on+dissemination+of+the+integron+pool%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool.</a> ISME J. 8, 768-777 (2014).</li>
<li>Allen, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Call+of+the+wild%3A+antibiotic+resistance+genes+in+natural+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments.</a> Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).</li>
<li>Wellington, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+natural+environment+in+the+emergence+of+antibiotic+resistance+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria.</a> Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).</li>
<li>Gillings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+a+Tn402-like+class+1+integron+with+a+novel+cassette+array+via+flanking+miniature+inverted-repeat+transposable+element-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures.</a> Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).</li>
<li>Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underappreciated+role+of+regionally+poor+water+quality+on+globally+increasing+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance.</a> Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).</li>
<li>Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibiotic+resistome%3A+what%27s+new%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The antibiotic resistome: what's new.</a> Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+PCR-Competent+DNA+from+Recalcitrant+Environmental+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples.</a> Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).</li>
<li>Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+class+1+integron+with+a+complete+Tn402-like+transposition+module%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module.</a> Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).</li>
<li>Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+in+the+environment%3A+A+link+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic.</a> Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).</li>
<li>Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+1+integrons+predating+the+association+with+Tn402.-like+transposition+genes+are+present+in+a+sediment+microbial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community.</a> Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).</li>
<li>Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+DJ+%22Nucleic+Acid+Techniques+in+Bacterial+Systematics%22">Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics</a>. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).</li>
<li>Holmes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+activity+of+a+distinctive+integron-gene+cassette+system+associated+with+stutzeri.+populations+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil.</a> Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren relevant.

Die Identifizierung von Integrons und ihre zugehörigen Gen-Kassetten ist potentiell ein Schlüsselschritt bei der Vorhersage der Entstehung von neuen opportunistischen Erregern, Tracking Wege für Krankheitserreger in die menschliche Nahrungskette, und die Identifizierung neuer Widerstand und Virulenzdeterminanten 8,21,26. Das Ziel dieser Arbeit war es, einen optimierten Ansatz für das Screening von Proben für die Klasse 1 Integrons, Charakterisierung ihrer Kassette Arrays und Identifizierung der Bakterien-Spez...

Die Entdeckung der Antibiotika war eine der größten wissenschaftlichen Errungenschaften des 20. Jahrhunderts. Allerdings hat der Gebrauch und Missbrauch von Antibiotika, um der raschen Entwicklung von Antibiotika-resistenten Bakterien geführt, und diese nun eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheit in das 21. Jahrhundert. Der Aufstieg der Bakterienstämme resistent gegen die meisten Behandlungsmöglichkeiten eröffnet die Möglichkeit, betreten wir eine Ära, in der antimikrobiellen Arzneimitteln nicht mehr wirksam sind 1,2. Die genetische Maschinerie, die Antibiotika-Resistenz ist ein altes System, Zeit vor Menschen und antibiotischen Selektionsdruck durch Millionen von Jahren 3. Mobile genetische Elemente, wie Plasmiden, Transposons, genomische Inseln integrative konjugativen Elemente und Integrons kann Antibiotikaresistenzgenen (ARG) innerhalb und zwischen den Bakterienspezies 4 verbreiten. Von diesen wurden Integrons eine zentrale Rolle bei der Verbreitung von ARG trotz der spielte,Tatsache, dass sie verlassen sich auf Plasmide und Transposons für die Mobilisierung und das Einsetzen in bakterielle Genome 5. Integrons erfassen Genkassetten mit einem Integron-Integrase und dann zum Ausdruck Kassetten unter Verwendung eines Promotors codiert Integron 6,7 (Abbildung 1). Integron Genkassetten sind kleine mobile Elemente aus einzelnen offenen Leserahmen (ORF), deren Produkte Resistenz gegenüber Antibiotika oder Desinfektionsmittel 8. Klasse 1 Integrons die Integrons am häufigsten aus klinischen Isolaten 5, wo sie zusammen über 130 verschiedene Antibiotikaresistenzgen Kassetten 9 erfasst gewonnen. Die Verbreitung der Klasse 1 Integrons in menschliche assoziierten kommen und pathogenen Bakterien erzeugt menschlichen Abfallströme, die eine große Zahl von diesen genetischen Elemente 10 enthalten. Schätzungsweise 10 19 Bakterien, die Klasse 1 Integrons enthalten, werden über Klärschlamm pro Jahr i freigegebenn Großbritannien 11. Es ist daher nicht verwunderlich, dass der Klasse 1 Integrons verleihen Antibiotikaresistenzen werden nun in Mikrobiota von wilden Vögel, Fische und andere einheimische Tierwelt 12-14 erkannt. Loslassen Integrons wieder an die Umgebung stellt eine erhebliche Bedrohung der öffentlichen Gesundheit, da Akquisition neuer Gen-Kassetten und komplexe Umlagerungen mit anderen mobilen Elementen auftritt weiterhin, insbesondere in Kläranlagen und anderen Gewässern 15-18. Die natürliche Umwelt wird dann zu einem fruchtbaren Rekrutierungsfeld für neue Resistenzdeterminanten und opportunistische Infektionen 19,20. Novel Integron haltigen Bakterien und neue ARG zurück in die menschliche Gemeinschaft durch verunreinigtes Wasser und Lebensmittel 21,22 umrunden. Überwachung der Umwelt ARG ist eine Schlüsselstrategie für das Verständnis und die Verwaltung Antibiotikaresistenz in der Zukunft 23. Insbesondere sollten ihr Augenmerk auf Nahrungsmittel zu achten, die roh gegessen werden oderleicht gekocht, denn diese stellen die größte Bedrohung für die Übertragung von neuen mobilen Elementen und Krankheitserreger. In diesem Protokoll einen optimierten Ansatz zur Erfassung, Identifizierung und Charakterisierung der Klasse 1 Integrons und ihre zugehörigen Genkassetten in Lebensmitteln werden skizziert (Abbildung 2). Verwendung einer Kombination von Kultivierung und Polymerasekettenreaktion (PCR) kann Integrons schnell komplexe Bakteriengemeinschaften und individuellen Isolaten nachgewiesen werden. Verfahren zum Identifizieren der Arten von Bakterien und die Konformation und die Identität der Integron assoziierten Genkassetten werden angegeben. Das Verfahren eignet sich für eine breite Palette von pflanzlichen und tierischen Lebensmitteln, und Beispiele für typische Arbeitsabläufe sind für jede dieser Arten von Lebensmitteln gegeben.

<table><tbody><tr><td>GoTaq Colourless Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>Wird in allen PCRs</td></tr><tr><td>RNAse (Ribonuklease A aus der bovinen Bauchspeicheldrüse)</td> <td>verwendet: Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>Wird in allen PCRs verwendet</td>:</tr><tr><td>HinFI-Restriktionsenzym</td><td>Promega</td><td>R6201</td>: <td>Wird verwendet, um 16S rDNA, PCR-Produkte zu verdauen. Das Enzym wird mit optimalem Puffer und BSA</td></tr><tr><td>100 bp Leiter</td> geliefert <td>GE Healthcare</td><td>27400701</td><td>Wird als Größenstandard für alle Agarosegele verwendet</td></tr><tr><td>GelRed DNA-Färbung</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>ACHTUNG: Beim Umgang mit diesem Material muss ein persönlicher Schutz getragen werden</td></tr><tr><td>Guanidiniumthiocyanat</td><td>Life Technologies</td><td>AM9422</td><td>ACHTUNG: Beim Umgang mit diesem Material muss ein persönlicher Schutz getragen werden</td></tr><tr><td>CLS-TC Lösung</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540409</td><td>Resuspensionslösung, die zu Beginn der genomischen DNA-Extraktion verwendet wird</td></tr><tr><td>Lysing Matrix E FastPrep Röhrchen</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914500</td><td>Röhrchen, das für den mechanischen Aufschluss von bakteriellen Zellwänden erforderlich ist. Dieser Code wird für Packungen mit 500 Tuben verwendet, kleinere Mengen sind verfügbar.</td></tr><tr><td>Bindungsmatrix</td><td>MP Biomedicals</td><td>116540408</td><td>1:5 mit 6 M Guanidiniumthiocyanat verdünnt und in der genomischen DNA-Extraktionsmethode verwendet.</td></tr><tr><td>Fast Prep Maschine</td><td>MP Biomedicals</td><td>Anzahl der verfügbaren Optionen</td><td>MP Biomedicals bietet eine Reihe von FastPrep Maschinen zum Kauf an. Weitere Informationen finden Sie unter <a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">http://www.mpbio.com</a></td></tr></tbody></table>

screening-lebensmittel, die für klasse 1 und integrons genkassetten

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Antibiotikaresistenz ist eine der größten Bedrohungen für die Gesundheit im 21. Jahrhundert. Der Erwerb von Resistenzgenen durch lateralen Gentransfer ist ein wesentlicher Faktor für die Ausbreitung vielfältiger Resistenzmechanismen. Unter den DNA-Elementen, die den lateralen Transfer erleichtern, sind die Integrone der Klasse 1 weitgehend für die Verbreitung von Antibiotikaresistenzdeterminanten unter gramnegativen Krankheitserregern verantwortlich. Insgesamt haben diese Integrone über 130 verschiedene Antibiotikaresistenzgene erworben und verbreitet. Durch den anhaltenden Einsatz von Antibiotika sind Integrone der Klasse 1 in Kommensalen und Krankheitserregern von Menschen und ihren Haustieren allgegenwärtig geworden. Infolgedessen sind sie heute in allen menschlichen Abfallströmen zu finden, wo sie weiterhin neue Gene erwerben und das Potenzial haben, über die Nahrungskette wieder in den Menschen zurückzukehren. Dieses Protokoll beschreibt einen optimierten Ansatz für den Nachweis von Integronen der Klasse 1 und den damit verbundenen Resistenzgenkassetten in Lebensmitteln unter Verwendung von Kultivierung und PCR. Mit diesem Protokoll sollten Forscher in der Lage sein: Proben zu sammeln und vorzubereiten, um angereicherte Kulturen herzustellen und nach Integronen der Klasse 1 zu suchen; Isolierung einzelner Bakterienkolonien zur Identifizierung von Integron-positiven Isolaten; Identifizierung von Bakterienarten, die Integrone der Klasse 1 enthalten; und diese Integronen und die damit verbundenen Genkassetten zu charakterisieren.

Screening von Mischkulturen und bakteriellen Isolate intI1 Primer-Set HS463a / HS464 PCR kann verwendet werden, um das Vorhandensein von der Klasse 1 Integron-Integrase-Gen, intI1 (Abbildung 1) zu erkennen. Diese Primer-Set eignet sich gut zur Erfassung intI1 in Mischkulturen, und wird auch verwendet, um Bakterienkolonien von Verteilerhaube (Abbildung 2) geerntet Bildschirm. Positive Isolate sollte eine einzige starke Bande bei 471 bp mit dies...

Dieses Protokoll beschreibt den Nachweis von Integronen der Klasse 1 und den zugehörigen Genkassetten in Lebensmitteln.

Screening-Lebensmittel, die für Klasse 1 und Integrons Genkassetten

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen optimierten Ansatz zur Detektion von Klasse-eins-Integronen und ihrer assoziierten Genkassetten aus Lebensmitteln bereitzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine angereicherte bakterielle Kultur aus dem gewählten Lebensmittel hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Kultur mittels PCR auf das Vorhandensein von Klasse-eins-Integronen zu untersuchen und einzelne Kolonien aus der integronpositiven Mischkultur zu isolieren. Nach der Überprüfung einzelner Kolonien auf das Vorhandensein von Integronen bereiten Sie genomische DNA aus den einzelnen Kolonien für diagnostische PCR-Analysen vor, um bakterielle Spezies zu differenzieren und das Vorhandensein von Genkassetten nachzuweisen. Der letzte Schritt besteht darin, die PCR-Produkte zu reinigen und zur DNA-Sequenzanalyse einzureichen. Letztendlich dient die DNA-Sequenzanalyse der Charakterisierung von Genkassetten innerhalb eines Klasse-eins-Integrons und der Identifizierung der Spezies, in denen sie vorkommen.Antibiotikaresistenz ist eines der größten Probleme, mit denen die medizinische Behandlung im 21. Jahrhundert konfrontiert ist. Eine Möglichkeit, Antibiotikaresistenzen zu bekämpfen, besteht darin, Antibiotikaresistenzgene in der Umwelt zu erkennen und ihren Weg vom Menschen zurück in die Umwelt und wieder zurück nachzuverfolgen. Dieses Protokoll zeigt Ihnen, wie man Antibiotikaresistenzen nachweisen kann.Gene in Lebensmitteln, die wir roh oder mit minimaler Verarbeitung verzehren könnten. Das Verfahren wird von Leet Waldron, einem Postdoktoranden in meinem Labor, demonstriert. Lebensmittel, die roh oder leicht gegart verzehrt werden, wie Obst, Gemüse und Schalentiere, stellen für die menschliche Gesundheit die größte Bedenken dar.Hier wird nur die Herstellung angereicherter Kulturen aus Meeresfrüchten demonstriert. Für die Herstellung von Kulturen aus Obst und Gemüse siehe den Protokolltext. Um eine angereicherte Kultur aus Meeresfrüchten herzustellen, dissectieren Sie zunächst mit sterilen Pinzetten den Verdauungstrakt aus Garnelen.Das dissezierte Material in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen geben, das 200 Mikroliter eines Natriumphosphatpuffers enthält. Die Probe mit einem Stößel zerstoßen, um ein Homogenat herzustellen, und anschließend verwirbeln. Kurzzeitig jeweils fünf Milliliter LB-Brühe in zwei sterile Fünf-Milliliter-Röhrchen abgeben und jedes mit dem Meeresfrüchte-Homogenat beimpfen.Schütteln Sie beide Reagenzgläser über Nacht bei 200 OPM und inkubieren Sie am folgenden Tag ein Reagenzglas bei 25 Grad Celsius und das andere bei 37 Grad Celsius. Lagern Sie die Kulturen bis zur weiteren Verwendung bei vier Grad Celsius, um einzelne Kolonien aus einer PCR-positiven Mischkultur zu gewinnen. Verdünnen Sie die Kultur zunächst zehnfach in Natriumphosphatpuffer, indem Sie ein Milliliter der Mischkultur zu neun Milliliter Natriumphosphatpuffer geben und durch Vortexen mischen.Geben Sie ein Milliliter der Verdünnung zu weiteren neun Millilitern Natriumphosphatpuffer und wiederholen Sie dies, bis eine serielle Verdünnung von 10 hoch minus acht erreicht ist. Verteilen Sie 100 Mikroliter der Verdünnung von 10 hoch minus vier bis 10 hoch minus acht der verdünnten Kultur auf LB-Agar. Inkubieren Sie die Platten in Duplikat über Nacht bei der gleichen Temperatur, die für die anfängliche Mischkultur am folgenden Tag verwendet wurde.Einzige Kolonien können aus den Verdünnungsplatten ausgewählt werden. Für die DNA-Präparation stellen Sie sicher, dass alle Platten und Probenröhrchen vor Versuchsbeginn eindeutig beschriftet sind. Berühren Sie mit einem sterilen Zahnstocher eine einzelne Kolonie und übertragen Sie diese anschließend in ein PCR-Röhrchen, das 100 Mikroliter sterilem Wasser enthält.Drehen Sie den Zahnstocher zwischen den Fingern, um einige der Zellen in das Wasser zu lösen; verwenden Sie denselben Zahnstocher, um eine LB-Platte mit einem Strich jeder ausgewählten Kolonie zu beimpfen. Große Mengen von Kolonien können auf beschrifteten Platten aufbewahrt werden. Wenn jeder Strich etwa einen Zentimeter lang ist, schließen Sie den Deckel unverzüglich, um Kontaminationen zwischen den Proben zu verringern.Wählen Sie mithilfe von Kriterien wie Koloniengröße, -form und -farbe so viele verschiedene Kolonietypen wie möglich aus. Inkubieren Sie die LB-Platten über Nacht bei derselben Temperatur wie für die anfängliche angereicherte Kultur verwendet. Die Kulturen können anschließend bei vier Grad Celsius gelagert werden, bis sie benötigt werden, um DNA aus den bakteriellen Suspensionen zu gewinnen.Erhitzen Sie die Proben mithilfe eines Thermocyclers auf 99 Grad Celsius für 10 Minuten und zentrifugieren Sie sie anschließend in einer Mikrozentrifuge bei 14.000 ×g für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um zellulären Abfall zu pelletieren; danach wieder auf Eis stellen. Danach screenen Sie die DNA mittels PCR mit den Primern HS 4 63 A und HS 4 64. Wie in dem Protokolltext beschrieben, ist es wichtig, jegliche potenziellen Quellen von kontaminierender DNA zu vermeiden, wenn die PCR durchgeführt wird, um die Ergebnisse der Amplifikation mittels Elektrophorese auszuwerten.Sieben Mikroliter jedes PCR-Produkts auf einem 2 %igen Agarosegel, das in TBE-Puffer gegossen und durchlaufen wurde, nachdem das Gel mit dem DNA-Farbstoff nachgefärbt wurde. Sichtbaren Sie die DNA mithilfe eines UV-Transilluminationssystems. Isolate, die ein Klasse-eins-Integrin tragen, erzeugen eine starke einzelne Bande bei 471 Basenpaaren. Genomische DNA, die aus Isolaten gewonnen wurde, die eine positive PCR-Reaktion zeigen, wird für diese Analysen verwendet. Tauen Sie die genomische DNA auf Eis auf und wirbeln Sie sie kurz an, anschließend zentrifugieren Sie sie kurz für 20 Sekunden bei 14.000 × g.Die Primersequenzen und PCR-Bedingungen, die für diagnostische PCR-Analysen verwendet werden, sind in Tabelle eins des Manuskripts dargestellt. Wiederholen Sie zuerst die PCR für das Integrase-Gen der Klasse eins, um zu bestätigen, dass der Isolat für das 471 Basenpaar lange Amplikon positiv ist. Identifizieren Sie anschließend die positiven Kulturen auf Speziesebene durch Amplifikation des Gens für die kleine Untereinheit der ribosomalen RNA, 16S-rDNA.Alle bakteriellen Zielstrukturen sollten ein 16S-Amplicon von etwa 1.450 Basenpaaren erzeugen, da viele dieser positiven Kulturen identisch sein werden. Bakterielle Arten werden durch Restriktionsverdau des 16S-PCR-Produkts unterschieden. Das Restriktionsenzym HIF one wird empfohlen, da es eine gute Diversität aus 16S-Zielsequenzen erzeugt und ein zuverlässiges, kostengünstiges Enzym ist.Richten Sie eine 30-Mikroliter-Schnittstellaufreinigungsmastermischung in einem sterilen Gefäß ein und geben Sie 20 Mikroliter des unreinen 16S-PCR-Produkts hinzu. Inkubieren Sie die Mischung am folgenden Tag über Nacht in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Überprüfen Sie den Schnittansatz in einem 2 %igen Agarosegel. Anschließend werden ausgewählte 16S-PCR-Produkte mithilfe eines kommerziellen Kits aufgereinigt und zur DNA-Sequenzierung an ein Sequenzierzentrum gesandt. Verwenden Sie die erhaltene DNA-Sequenz, um die NCBI-DNA-Datenbank mittels der BlastN-Funktion zu durchsuchen; eine Übereinstimmung von mehr als 97 % an Nukleotididentität wird gewöhnlich als Hinweis auf Identität auf Speziesebene gewertet.Mischkulturen antibakterieller Isolate werden mittels PCR auf das Vorhandensein des Integrasegens der Klasse eins untersucht. Mit den Primern HS 4 63 A und HS 4 64 erzeugen positive Kolonien eine starke einzelne Bande bei 471 Basenpaaren. Genomische DNA aus reinen Isolaten wird zur Charakterisierung der Interkassetten-Arrays verwendet; die Amplifikation von Kassetten-Arrays aus TN 4 0 2-Integronen unter Verwendung der Primer HS 4 58 und HS 4 59 ergibt variable Produktgrößen, abhängig von der Identität und Größe der einzelnen Kassetten im Array.Die Identifizierung dieser Kassetten erfordert eine DNA-Sequenzierung. Umweltklasse-eins-Integronen sind häufig in bakterielle Chromosomen eingebettet. Ihre konservierten Bereiche können mit den Primern MG 2 84 und MG 2 85 amplifiziert werden, die gezielt die proximalen und am weitesten distalen Rekombinationsstellen ansprechen. Diese PCR erzeugt zudem variable Produktgrößen, die von der Identität und Größe der einzelnen Kassetten im Array abhängen.Jedoch ist es bei Kassetten in Umweltarrays unwahrscheinlich, dass sie Antibiotikaresistenz vermitteln. Bakterienarten werden identifiziert, indem 16S-rDNA amplifiziert und die PCR-Produkte durch Verdauung analysiert werden. Mit HIF erzeugt eine einzelne Art charakteristische Muster, sodass Isolate derselben Art leicht identifiziert und durch DNA-Sequenzierung bestätigt werden können.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun eine gute Vorstellung davon haben, wie man Klasse-eins-Ingramme und ihre Antibiotikaresistenzkassetten aus alltäglichen Lebensmitteln isoliert.

screening-foodstuffs-for-class-1-integrons-and-gene-cassettes

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Eine schnelle und effiziente Methode, um Fremd-DNA von Interesse in vorgefertigte Akzeptor Stämme, sogenannte Landing-Pad-Stämme, die Integration beschrieben wird. Das Verfahren erlaubt eine ortsspezifische Integration eines DNA-Kassette in die gentechnisch Landeplatz Ort einer gegebenen Dehnung, durch Konjugation und Expression des ΦC31 Integrase.

Site-spezifische bakterielle Chromosom Engineering: ΦC31 Integrase vermittelte Cassette Exchange (IMCE)

Bakterien produzieren sezernierten Verbindungen, die das Potenzial, die Physiologie der Mikroorganismen ihre Nachbarn beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Co-Kultur Bildschirm, der Nachweis solcher chemisch vermittelte Inter Wechselwirkungen durch Mischen von Bodenmikroben mit fluoreszierenden Reporter-Transkriptions Stämmen von Bacillus subtilis auf festen Medien ermöglicht.

Mit Cokultur zur Erkennung chemisch vermittelte Interspezies-Interaktionen

Diese Arbeit stellt eine Methode des Hochdurchsatz-Screenings unter Verwendung eines universellen genetischen Enzym-Screening-Systems vor, das theoretisch auf über 200 Enzyme angewendet werden kann. Dabei identifiziert das Single-Screening-System drei verschiedene Enzyme (Lipase, Cellulase und alkalische Phosphatase) durch einfaches Wechseln des verwendeten Substrats (p-Nitrophenylacetat, p-Nitrophenyl-β-D-Cellobiosid und Phenylphosphat).

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Salmonella SPP /Shigella spp. sind häufige Erreger Durchfall zugeschrieben. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp., mittels Real-Time PCR kombiniert mit geführten Kultur.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von bereits bestehenden antibiotische Resistenz-Kassette Löschung Konstrukte als Grundlage für die Herstellung von Löschung Mutanten in anderen E. Coli -Stämme. Solche Löschung Mutationen können mobilisiert und in den entsprechenden Locus eines Empfängers Stamm mit P1 Bakteriophagen Transduktion eingefügt.

Herstellung von Gen-Deletionen in Escherichia coli durch P1 Transduktion mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotikaresistenz Kassetten

Loop-vermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) ist ein isothermer Nukleinsäure-Amplifikationstest (iNAAT), der ein breites Interesse am Nachweisvon Erreger geweckt hat. Hier präsentieren wir ein multilaboriertes Salmonella LAMP-Protokoll als schnelle, zuverlässige und robuste Methode zum Screening von Salmonellen in Tierfutter und zur Bestätigung mutmaßlicher Salmonellen aus der Kulturisolierung.

Loop-vermittelte isotherme Amplifikation zum Screening von Salmonellen in Tierfutter und Bestätigung von Salmonellen aus der Kulturisolierung

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Wir beschreiben ein einfaches Verfahren zur chromosomalen Einzelkopie-Komplementierung eines Efflux-Pumpengens unter Verwendung eines mini-Tn7-basierten Expressionssystems in einen gentechnisch veränderten Efflux-defizienten Stamm von Acinetobacter baumannii. Dieses präzise genetische Werkzeug ermöglicht eine kontrollierte Genexpression, die für die Charakterisierung von Effluxpumpen in multiresistenten Krankheitserregern von entscheidender Bedeutung ist.

Charakterisierung von Multidrug-Efflux-Systemen in Acinetobacter baumannii unter Verwendung eines Efflux-defizienten Bakterienstamms und eines Single-Copy-Genexpressionssystems

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Screening und Isolierung von C-Glykosid-spaltenden Darmbakterien

Erfahren Sie, wie Sie Klasse-1-Integrons und Antibiotikaresistenz-Gene in Lebensmitteln mit PCR und DNA-Sequenzierung nachweisen. Dieses Protokoll ermöglicht die Überwachung von Resistenzgenen in der Nahrungskette.

Screening-Lebensmittel, die für Klasse 1 und Integrons Genkassetten

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