Name: Induktion und Beurteilung der Ischämie-Reperfusion Injury in Langendorff-perfundierten Rattenherzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Lernen Sie die Modellierung von Ischämie-Reperfusionsverletzungen ex vivo am isolierten Rattenherzen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Ereignisse und myokardialer Funktion.

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Diese Veröffentlichung wurde von der South Carolina Clinical &amp; Translational Research (SCTR) Institute unterstützt, mit einem akademischen Heimat an der Medizinischen Universität von South Carolina, NIH / NCATS Statt Anzahl UL1 TR000062. Weitere Unterstützung wurde von VA Merit Award BX002327-01 DRM zur Verfügung gestellt. DJH wurde von NIH / NCATS Statt Anzahl TL1 TR000061 von NIH Zuschusses Anzahl T32 GM008716 unterstützt. SEA wurde vom NIH Zuschusses Anzahl T32 HL07260 unterstützt.

Alle hier aufgeführten Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Medizinischen Universität von South Carolina genehmigt. Die hier beschriebenen Experimente sind akute, nicht-Überlebensexperimente. Als solche gibt es keine Verwendung von Augensalbe und eine sterile OP-Bereich nicht erforderlich ist. Sterbehilfe wird durch Ausbluten bei der Ernte des Herzens erreicht. 1. Versuchsvorbereitung <ol><li> Bis entweder einen konstanten Druck oder konstanten Fluss Langendorff Perfusion 4 Stellen. </li><li> Herstellung von 4 L modifizierte Krebs-Henseleit-Puffer (in mM: 112 NaCl, 5 KCl, 1,2 MgSO 4, 1 K 2 HPO 4, 1,25 CaCl 2, 25 NaHCO 3, 11 D-Glucose, 0,2 Octansäure, pH = 7,4). <ol><li> Machen 10x stock Puffer. <ol><li> Aufzulösen NaCl, KCl, MgSO 4 und K 2 HPO 4 in 3 L Reinstwasser. </li><li> Löse CaCl 2 in 500 ml Reinstwasser with 40 ml 1 N HCl. </li><li> Langsam CaCl2-Lösung in den Puffer in 1.2.1.1 vorgenommen. Fügen Sie genug hochreinem Wasser auf insgesamt 4 L. Lassen Sie für 1 Stunde vor dem Filtrieren durch ein 0,8 um Filter zu rühren. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Löse NaHCO 3 in 4 L Reinstwasser. Man lässt 1 h, bevor es durch einen Filter an 0,8 um-Filter rühren. Lagerung bei 4 ° C </li></ol></li><li> Kombinieren Sie 400 ml 10x Krebs Henseleit-Puffer mit 400 ml 10x NaHCO3-Puffer. Fügen Sie genug hochreinem Wasser auf insgesamt 4 L. auflösen Glukose und Oktansäure unter Rühren. Man filtriert durch 0,8-um-Filter. </li></ol></li><li> Bereiten System für Herz. <ol><li> In 2 l gefiltert Puffer zu einem 4-l-Flasche 38 in platziert über dem Hahn an die Aortenkanüle angebracht. Dadurch wird ein Perfusionsdruck von 70-80 mmHg in das Herz, die die empfohlene Perfusionsdruck 4 zu liefern. </li><li> Legen Gasdispersions bubbler in den Puffer in der Flasche. </li><li> Führen Sie den Puffer durch das System, dass auf jeden Fall alle Blasen aus dem Inneren der Rohrleitung zu beseitigen. </li><li> Einzuschalten Gas (95% O 2/5% CO 2) mindestens 30 min vor Herz ist auf dem System platziert werden. Verwenden Sie ein Gasstrom-Sonde und Blutgasanalysegerät, um die Sauerstoffsättigung zu überprüfen. </li></ol></li><li> Bereiten chirurgisches Material und Ballon. <ol><li> Für die Ernte von Herz, bereiten ein Paar von 6,75 &quot;chirurgische Schere, ein Paar von 4.5&quot; Schere, zwei Paare von Hämostatika, zwei Sätze von Karamellenmalz Zange zwei Spritzen mit 27 G Nadeln, 2 Stück von 0-Gauge-Seidenfaden (ca. 15 cm in der Länge), einer 1/16 inch Stacheldraht Kanüle und eine Trachealkanüle. </li><li> Um Trachealkanüle montieren, kleben Sie ein kurzes Stück von 1/16 Zoll Durchmesser Kunststoffschlauch mit einem Y-Verbinder. </li><li> Um Ballongerät montieren: fügen Sie eine Sondennadel an ein Stück 1/16 Zoll Schlauch, dann bringen Sie Schlauch an Druckwandlergehäuse. Eine kleine Spritze zu der anderen Seite des Druck tr befestigtansducer Gehäuse wird Aufblasen und Entleeren des Ballons zu ermöglichen. <ol><li> Schneiden Sie ein Quadrat der Plastikverpackung und Platz Spitze einer Magensonde Nadel in der Mitte. Wickeln Sie die Plastikfolie um die Sondennadel. </li><li> Füllen Ballon mit Kochsalzlösung und binden mit zwei Nähten. Blasen Sie Ballon, um sicherzustellen, keine Lecks vorhanden sind. Das Volumen der Salzlösung innerhalb des aufgeblasenen Ballons sollte ungefähr 200 &amp; mgr; l, kann aber abhängig von der Größe der Ratte variieren. </li><li> Alternativ können Sie einen Latex Fingerling anstelle der Plastikfolie. Platzieren Sie eine Magensonde Nadel innerhalb Fingerling, füllen mit Kochsalzlösung und Krawatte ab. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Ernte das Herz <ol><li> Restrain eine Sprague Dawley-Ratte mit einem decapicone oder andere manuelle Rückhaltevorrichtung. Wiegen Ratte. </li><li> Verabreichen Ketamin / Xylazin-Mischung (0,85 mg / kg Ketamin und 0,15 mg / kg Xylazin) durch intraperitoneale Injektion an Ratten anästhesiert. Diese Dosis des Anästhetikums ausreichend für Anästhesie liefern20-40 min, aber das Verfahren sollte möglichst schnell nach der Narkose wird bestätigt, durchgeführt werden. </li><li> Bestätigen richtigen Grad der Anästhesie durch Tests toe Prise Reflex. </li><li> Tracheotomie <ol><li> Entfernen pelt von Mitte Vorderpfote auf Basis des Kiefers, mit Gefäßklemmen, um Fell und Schere zu erheben, um Einschnitt zu machen. Halten Sie das Fell angehoben, um es von der darunter liegenden Muskeln zu trennen, so dass man auf dem Fell schneiden und entfernen. </li><li> Verwendung hemostats, heben Drüsengewebe und machen einen horizontalen Schnitt in Faszie schlechter als das Drüsengewebe. Verwenden hemostats zu Einschnitt spreizt, kümmert sich nicht um nick die Halsvenen. </li><li> Verwendung Hämostaten pinch Muskeldarüberliegenden Luftröhre, und mit einer Schere einen Quereinschnitt im Muskel genau unter der Spitze der Hämostatika. Verwendung hemostats, verbreiten Gewebe auseinander, um die Luftröhre zu offenbaren. </li><li> Gefäßklemmen vorsichtig unter Luftröhre, Clearing Faszie, während voran durch leichtes Vor- und Zurück hemostats. </li><li>Sobald hemostats erfolgreich hinter der Luftröhre gelegt, kneifen 0-0 Seidennaht mit Gefäßklemmen und hemisect die Luftröhre mit einem kleinen, scharfen Schere. </li><li> Legen Trachealkanüle in die Trachea hemiseziert, ziehen Naht hinter der Luftröhre, und binden Sie den Faden um die Kanüle eingeführt Luftröhre, die Verankerung des Nahtmaterials zu der Y-Leiste der Kanüle mit einem Chirurgen Knoten. </li><li> Unter Verwendung einer 27 G Nadel injizieren 1.000 U / kg Heparin in die Halsschlagader und lassen Sie sie für 30 Sekunden zu zirkulieren. </li></ol></li><li> Thorakotomie <ol><li> Entfernen pelt von Mitte Bauch bis Mitte Vorderpfote Region durch Kneifen mit Gefäßklemmen und Schneiden mit einer Schere. </li><li> Machen Sie eine ¾-Zoll-Quereinschnitt in die Bauchmuskelwand, direkt unterhalb des Zwerchfells. </li><li> Machen Sie eine vertikale Inzision bis die Bauchdecke und Brustwand, Schneiden entlang dem Brustbein. </li><li> Schneiden Sie die Blende wieder auf bilateraler Ebene, dann verbreiten Brustkorb zu Herzen, Klemmbrustkorb mit Gefäßklemmen, um sicherzustellen, bleibt es verbreitet zu offenbaren. </li&gt; <li> Verwendung hemostats, entfernen Sie vorsichtig Thymus, Aussetzen der aufsteigenden Aorta. </li><li> Necken hemostats durch Aorten-Schleife, Vorschieben und Zurückziehen hemostats und sanft Verbreitung Faszie zu Spitze Gefäßklemmen ermöglichen durch. </li><li> Verwenden hemostats zu 0-0 Seidennaht hinten aufsteigenden Aorta zu ziehen, binden Naht zu einem lockeren Halb quadratischen Knoten. </li><li> Schalten Hahn, um den Fluss von Perfusionspuffer, hemisect Aorta beginnen und sofort legen Kanüle in Aortenlumen. Schnell cinch eine Halbkreuzknoten und füllen Sie die Knoten, Anziehen gründlich. </li><li> Mit einer Schere Herzen weg von den großen Gefäßen zu sezieren, Herz aus der Brust zu entfernen und um die Perfusion Spalte. </li><li> Abschneiden von überschüssigem Lungengewebe und lassen Herz auf der Säule für etwa 15 min vor dem Einsetzen des Ballons äquilibrieren. Verwenden Sie einen normalen Durchflussrate von Puffer durch das Herz von 10-20 ml / min. </li></ol></li></ol> 3. Langendorff-Perfusion und Ischämie-Reperfusionsverletzung <ol><li> Platzierung der LV vorssure Ballon <ol><li> Lassen Sie die Luft Ballon beim Rollen in eine Kegelform und schalten Hahn, um sicherzustellen, Ballon bleibt entleerten. </li><li> Excise linken Vorhof mit einer kleinen Schere, um den Zugang zu Mitralklappe aussetzen. </li><li> Legen Ballon durch linken Vorhof und Mitralklappe in den linken Ventrikel. </li><li> Startdruck-Monitoring-Software (LabChart Pro). </li><li> Blasen Sie Ballon durch Öffnen Absperrhahn und sanft zunehmende Menge an Kochsalzlösung in Ballon, bis der diastolische Druck Lesung aus Mikromanometer Null übersteigt. </li><li> Auf Länge-Spannung Antwort überprüfen, aufblasen Ballon langsam zu einer diastolischen Druck von 75 mmHg, entleeren langsam, einmal zu wiederholen. </li><li> Eingestellt diastolische Druck 10 mmHg durch Modulieren der Menge von Salzlösung in den Ballon. Schalten Hahn zu Ballon auf diesem Niveau der Inflation zu versiegeln und zu pflegen geschlossenen Drucksystem zwischen LV Ballon und Druckwandler. </li><li> Unteren Herzkammer in die erhitzt und Abdeckung mit Kunststoffkammer. </li></ol></li><li> AnzeigeDienst der Ischämie-Reperfusionsverletzung <ol><li> Stecker die Unterseite der erwärmten Kammer und erlauben Kammer mit ergossenen Puffer zu füllen. </li><li> Als Puffer Herzen unter Wasser, drehen Hahn, den Fluss von Puffer in das Herz zu stoppen, zu induzieren globale Ischämie. Ischämie Zeit kann je nach den Zielen des Experiments variieren. </li><li> Nach 30 Minuten der Ischämie, schalten Hahn, um die Strömung des Puffers in das Herz wiederherzustellen, Initiierung der Reperfusion. </li><li> Lassen Sie Reperfusion des Herzens für 1 h vor Beendigung des Experiments. Verwenden variable Reperfusion Zeiten, abhängig von den Zielen des Experiments. </li></ol></li><li> Kündigung Experiment und Ernten von Tissue <ol><li> Verwendung Seitenöffnung des Absperrhahns verabreichen 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung bei 4 ° C in das Herz mit einer Rate von 10 ml / min, um das Herz anzuhalten. </li><li> Herz entfernen Perfusion Spalte wegschneiden restlichen Vorhofgewebe. </li><li> Zeigen Herz in einen Edelstahlgewebe Schneidematrix, Deckel mit Parafilm und Stelle bei -80 ° C für 8 Minuten, oder bis das Herz hat einen Marshmallow artige Konsistenz. </li><li> Entfernen Block vom Gefrierschrank und legen Sie in Rasierklingen schneiden Matrix zu Herzen in 2 mm dicke Scheiben schneiden. Gewebeblöcke können auch mit anderen als 2 mm Scheibe Größen erworben werden. </li><li> Scheiben entfernen ein zu einer Zeit und fallen in flüssigem Stickstoff auf Blitzeis für biochemische Untersuchungen. Bewahren Sie den dritten Ventrikel Scheibe von der Spitze zur Infarkt Färbung. </li><li> Entfernen Gewebe aus flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis zur Verwendung in biochemischen Experimenten. </li></ol></li><li> Infarkt-Färbung <ol><li> Inkubieren des dritten ventrikulären Scheibe in 10 ml 1% w / v Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) bei 37 ° C für 15 min. Anmerkung: Die Inkubation in TTC kann für 15 oder 30 Minuten bei unveränderter Wirksamkeit 15 durchgeführt werden. </li><li> Übertragen Gewebeschnitt von TTC zu 10% Formalin und lassen Sie sie bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Für optimale Ergebnisse zu hörents sollte von Formalin aufgenommen und innerhalb von 24 Stunden 4 abgebildet werden. </li><li> Fotografie Buntscheibe und Verwendung Software wie ImageJ zu Infarktgröße schätzen, nach dem Protokoll des Herstellers. Fotografieren so bald wie möglich nach der Fixierung, da der Farbstoff im Laufe der Zeit verblassen. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Isoliert perfundierten Rattenherzen erfolgreich eingesetzt werden kann, um die Wirkung von pharmakologischen Intervention Herz Präkonditionierung Reperfusionsverletzung 9 untersuchen. Es gibt jedoch einige wesentliche Schritte der Prozedur, die um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten standardisiert werden müssen. Aufrechterhalten einer Temperatur von 37,4 ° C innerhalb des Systems ist entscheidend, denn auch milder Hypothermie und Hyperthermie kann Herz Präkonditionierung 10,11 führen. Die G...

Aufklärung der Ereignisse des Herz Reaktion auf sowohl Ischämie und Reperfusion zugrunde liegen weiter zu verbessern die Behandlung von Herzinfarkt und Herz 1 operative Eingriffe, die Aorten-Querspann 2 erfordern. Während in vivo Modellen von Ischämie-Reperfusionsverletzung ermöglichen sehr nützlich Endpunktanalyse, sind sie nicht so wirksam für die Untersuchung der funktionellen Auswirkungen von Ischämie-Reperfusionsverletzung akut in Echtzeit. Zusätzlich kann in vivo Ischämie-Reperfusion-Modelle erzeugen im Allgemeinen zu signifikanten Schwankungen in der Infarktgröße und die direkte Abgabe von Arzneimittel an das Herz zum Zeitpunkt der Reperfusion ist eine Herausforderung. Die Verwendung einer Langendorff-Herzen isoliert System für die Untersuchung ischämischen Reperfusionsschäden ermöglicht Echtzeit-funktionelle Bewertung der pharmakologischen Behandlungen, gleichmäßige Flächen infarzierten Gewebe und momentane Abgabe von Arzneimittel direkt in den Herzmuskel. Zuerst beschrieben by Oscar Langendorff 1895 3 ist der Langendorff-Herz isoliert ein robustes Modell für die Untersuchung ischämischen Reperfusionsschäden, nachdem er in Ischämie-Reperfusion Forschung für den letzten 40 Jahren 4,5 verwendet. Hier werden einige Modifikationen vorgenommen, um das isolierte Herz zur Funktionsanalyse zu optimieren. In situ Kanülierung der Aorta, während das Herz schlägt, wird sichergestellt, dass das Herz nicht ischämischen Präkonditionierung, die die Ergebnisse der Ischämie-Reperfusion den Versuchen 6 verändern würden auftreten. Um dies zu erleichtern, wird ein Luftröhrenschnitt durchgeführt, so dass Belüftung und gewährleisten physiologische Stabilität der Ratte während der Operation. Das Herz wird dann auf eine Glaswassermantel spiral Säule, durch die Krebs-Henseleit-Puffer wird durch retrograde Perfusion direkt in die Aorta geliefert befestigt. Eine Kochsalzlösung gefüllten Ballon wird in den linken Ventrikel eingeführt und mit einem Druckwandler, der für die Echtzeit-Messung von Drücken von innerhalb der Herzkammer ein ermöglicht befestigtd Berechnung mehrerer funktioneller Parameter. Am Ende des Experiments wird das Herz mit kalter Kochsalzlösung gespült, um die Kontraktion und in flüssigem Stickstoff eingefroren, um Downstream-Analyse von DNA, RNA und Protein-Ebene ermöglichen verhaften. So modifizierte, dient der Langendorff-perfundierten Herzen als ein wirksames System für die direkte Überwachung der physiologischen Wirkung von pharmakologische Interventionen zu jeder Zeit während des akut ischämischen Reperfusionsschäden.

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>203726</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20765-A7</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid Dihydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Bicarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Oktansäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2875</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Medizinischer Druckmessumformer</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Schlauchpumpe</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07521-40</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Easy Load Pumpenkopf</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Beheiztes Umlaufwasserbad</td><td>Lauda</td><td>M3</td><td></td></tr><tr><td>Schlauch Durchflussmodul</td><td>Transsonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>Modulare Forschungskonsole</td><td>Transsonic</td><td>T402</td><td></td></tr><tr><td>Inline-Durchflusssensor</td><td>Transsonic</td><td>ME2PXN</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab Datenerfassungsgerät</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>LabChart Datenerfassungssoftware</td><td>AD Instruments</td><td>MLU60/8</td><td></td></tr></tbody></table>

induktion und beurteilung der ischämie-reperfusion injury in langendorff-perfundierten rattenherzen

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Die biochemischen Ereignisse im Zusammenhang mit Ischämie-Reperfusionsschäden im akuten Bereich sind von großer Bedeutung für die Förderung neuer Behandlungsoptionen für Myokardinfarkt und kardiale Komplikationen der Thoraxchirurgie. Die Fähigkeit bestimmter Medikamente, das Myokard gegen Ischämie-Reperfusionsschäden zu präkonditionieren, hat zu mehreren klinischen Studien mit wenig Erfolg geführt. Das isolierte Herzmodell ermöglicht die akute Beobachtung der funktionellen Auswirkungen einer Ischämie-Reperfusionsverletzung in Echtzeit, einschließlich der Auswirkungen verschiedener pharmakologischer Interventionen, die zu einem beliebigen Zeitpunkt vor oder innerhalb des Zeitfensters der Ischämie-Reperfusionsverletzung verabreicht werden. Da kurze Perioden der Ischämie das Herz gegen ischämische Verletzungen präkonditionieren können, wird eine In-situ-Aortenkanüle durchgeführt, um eine funktionelle Beurteilung des nicht präkonditionierten Myokards zu ermöglichen. Ein mit Kochsalzlösung gefüllter Ballon wird in den linken Ventrikel eingeführt, um eine Echtzeitmessung der Druckerzeugung zu ermöglichen. Eine ischämische Schädigung wird durch die Beendigung des Perfusionspufferflusses simuliert, gefolgt von einer Reperfusion. Die Dauer sowohl der Ischämie als auch der Reperfusion kann moduliert werden, um biochemische Ereignisse zu einem bestimmten Zeitpunkt zu untersuchen. Obwohl das Langendorff-isolierte Herzmodell keine Berücksichtigung systemischer Ereignisse ermöglicht, die Ischämie und Reperfusion beeinflussen, ist es ein hervorragendes Modell für die Untersuchung akuter funktioneller und biochemischer Ereignisse im Zeitfenster der Ischämie-Reperfusionsverletzung sowie der Wirkung pharmakologischer Interventionen auf die kardiale Prä- und Postkonditionierung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu demonstrieren, wie eine in situ Aortenkanüle und Herzexzision mit anschließender Ischämie/Reperfusionsverletzung im Langendorff-Modell durchgeführt werden kann.

Die linke Kammerballon Vorrichtung ermöglicht eine Echtzeitüberwachung des Drucks durch den Auftraggeber linken Ventrikel (Abbildung 1) entwickelt. Wie zuvor 7 beschrieben, kann diese Druckspur verwendet, um viele der Parameter der Herzfunktion zu berechnen. Diese Berechnungen können in der Basisphase als auch der Reperfusionsphase gemacht werden, gemittelt über mehrere Spuren in jeder Gruppe, und verglichen, um zu bestimmen, ob die pharmakologische Intervention ergab Herz Vorbehandlung, wie ...

Das isolierte Rattenherz ist ein dauerhaftes Modell für Ischämie-Reperfusionsschäden. Hier beschreiben wir den Prozess der Entnahme des schlagenden Herzens von einer Ratte mittels in situ Aortenkanüle, der Langendorff-Perfusion des Herzens, der simulierten Ischämie-Reperfusionsverletzung und der Infarktfärbung, um das Ausmaß des ischämischen Insults zu bestätigen.

Induktion und Beurteilung der Ischämie-Reperfusion Injury in Langendorff-perfundierten Rattenherzen

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Ischämie und Reperfusionsverletzung ex vivo zu modellieren. Dazu wird zunächst eine Ratte anästhesiert und der Brustkorb geöffnet, um die Aorta in C zwei zu kanülieren und so eine ischämische Präkonditionierung des Myokards zu verhindern. Anschließend wird das Herz entfernt und an eine Langendorff-Perfusionsapparatur angeschlossen.Der letzte Schritt besteht darin, eine Ischämie-Reperfusionsschädigung durch Anhalten des Pufferflusses für einen bestimmten Zeitraum und anschließende Wiederherstellung des Flusses auszulösen. Letztendlich wird die ventrikuläre Druckerzeugung verwendet, um die Wirkung der Ischämie-Reperfusionsschädigung auf die myokardiale Funktion darzustellen. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der kardialen Ischämie-Reperfusion zu beantworten, beispielsweise welche molekularen Vorgänge während der dynamischen ersten Stunden der Ischämie-Reperfusionsschädigung ablaufen.Berechnen Sie zunächst die erforderliche Anästhetika-Menge, nachdem bestätigt wurde, dass die Ratte narkotisiert ist. Beginnen Sie die Tracheotomie, indem Sie zuerst die Haut von den mittleren Vorderpfoten bis zur Unterkieferbasis öffnen. Verwenden Sie eine Hämoclip-Zange, um das Gewebe zur Seite zu legen und die Muskulatur freizulegen.Dann mit einer Klemme das Drüsengewebe anheben und mit einer Schere einen unteren Einschnitt in die Faszie vornehmen. Das freigelegte Gewebe mit einem weiteren Paar Klemmen auseinanderziehen. Achten Sie darauf, die Vena jugularis nicht zu verletzen.Führen Sie nun mit einer Schere und unter Zuhilfenahme von Hämorrhagieklemmen einen Querschnitt in dem Muskel über der Luftröhre durch. Verwenden Sie dann die Hämorrhagieklemmen, um die Luftröhre freizulegen, und positionieren Sie die Klemmen vorsichtig unter der Luftröhre, wobei Sie gleichzeitig die Faszie entfernen. Klemmen Sie danach eine 0-0-Seidennaht mit den Hämorrhagieklemmen hinter der Luftröhre fest.Als Nächstes verwenden Sie eine Schere, um zu hemiesen. Dissezieren Sie die Luftröhre entlang der Luftröhre. Setzen Sie die Luftröhrenkanüle ein und befestigen Sie sie mit der Naht, jedoch nicht die Naht am Y-Schenkel der Kanüle.Jetzt mit einer Spritze und einer 27-Gauge-Nadel 1000 Einheiten Heparin pro Kilogramm in die Vena jugularis injizieren. Vor dem Fortfahren mit der Thorakotomie 30 Sekunden warten. Die Thorakotomie beginnen, indem man die Haut zwischen dem mittleren Abdomen und dem mittleren vierten Rippenbogen mit Hämorrhagieklemmen und einer Schere entfernt.Dann führen Sie einen dreiviertel Zoll langen Schnitt in die Bauchdecke direkt unterhalb des Zwerchfells durch. Setzen Sie den Schnitt vertikal entlang des Brustbeins fort. Schneiden Sie anschließend das Zwerchfell beidseitig durch, um den Rippenkorb freizulegen.Jetzt spreizen Sie den Rippenkorb und klammern Sie ihn mit Hämostasen zur Seite, um so das Herz freizulegen. Die korrekte Positionierung der Kanüle in der Aorta ist der kritischste Schritt des Verfahrens. Die Kanüle muss präzise eingeführt und rasch fixiert werden, um zu verhindern, dass das Herz einer kurzen Ischämiephase ausgesetzt wird, was die Ergebnisse der anschließenden Ischämie-Reperfusion beeinflussen würde.Experimentieren Sie mit Hämostasen. Entfernen Sie vorsichtig den Thymus, um die aufsteigende Aorta freizulegen. Führen Sie die Hämostasen durch die Aortenschleife hindurch durch die Faszie.Dann führen Sie eine 0-0-Seidennaht durch die Öffnung ein und binden einen lockeren Überhandknoten. Starten Sie nun den Durchfluss des Perfusionspuffers durch die Kanüle. Danach hämen Sie die Aorta, dissezieren sie und setzen die Kanüle unverzüglich in das Aortalumen ein.Befestigen Sie die Kanüle, indem Sie den Knoten zuziehen und zu einem Doppelknoten vervollständigen. Lösen Sie mit einer Schere das Herz von den großen Gefäßen. Befreien Sie es vollständig, nehmen Sie es heraus und befestigen Sie es an der Perfusionskolonne.Entfernen Sie das überschüssige Lungengewebe. Nach etwa 15 Minuten ist das Herz mit dem normalen Pufferfluss zwischen 10 und 20 Milliliter pro Minute ausgeglichen. Sobald das Herz an die Säule angepasst ist, kann der Ballon eingeführt werden.Zuerst entleeren Sie den Ballon, indem Sie ihn zu einer kegelförmigen Struktur zusammenrollen. Sperren Sie den Fluss zum Ballon, sobald dieser entleert ist. Zweitens gelangen Sie über die Exzision des linken Vorhofs des Herzens zur Mitralklappe.Drittens wird der Ballon über die Mitralklappe in den linken Ventrikel eingeführt. Nun beginnen Sie mit der Überwachung des systolischen und diastolischen Drucks mithilfe der Lab-Chart-Pro-Software und pumpen den Ballon auf, bis der Druck größer als null ist. Anschließend überprüfen Sie die Längen-Spannungs-Beziehung.Die Ballonkatheter langsam aufblasen, bis der Druck 75 Millimeter Quecksilbersäule erreicht. Anschließend langsam wieder entleeren und den Vorgang wiederholen. Den Druck durch Veränderung der Salzlösung im Ballon auf 10 Millimeter Quecksilbersäule absenken.Sperrt dann den Ballon bei diesem Druck und hält ein geschlossenes Drucksystem zwischen Ballon und Wandler aufrecht. Senkt abschließend das Herz in eine beheizte Kammer ab und verschließt es mit Plastikfolie. Die Kammer sollte verstopft sein, sodass sie sich mit einem gepufferten Medium füllt.Sobald das Herz untergetaucht ist, stoppen Sie den Pufferfluss. Dies induziert eine globale Ischämie für den erforderlichen Zeitraum. In diesem Fall 30 Minuten.Nach 30 Minuten beenden Sie die Ischämie, indem Sie den Pufferfluss zum Herzen wiederherstellen und die Kammer abkoppeln. Lassen Sie die Reperfusion so lange wie gewünscht andauern und beenden Sie dann das Experiment, in diesem Fall nach einer Stunde Reperfusion über den Seitenhahn. Geben Sie 10 Milliliter eiskaltes PBS innerhalb einer Minute zu.Dadurch wird das Herz stillgelegt. Entfernen Sie anschließend das Herz von der Säule und schneiden Sie das verbleibende Vorhofgewebe ab. Tupfen Sie das Herz trocken, überführen Sie es in eine Schneidematrize und bedecken Sie es mit Perfil.Gefrieren Sie das Herz bei minus 80 Grad Celsius für acht Minuten oder bis es die Konsistenz eines Marshmallows aufweist. Schneiden Sie das Herz mit Rasierklingen in zwei Millimeter dicke Schnitte; alternativ kann jede Scheibe einzeln entnommen und in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Für biochemische Untersuchungen sollten die gefrorenen Schnitte anschließend bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.Für die Infarktfärbung eine Schnittfläche ungefroren in flüssigem Stickstoff belassen. Mit dem beschriebenen Protokoll. Die Ballonapparatur für das linke Ventrikel ermöglicht die Echtzeitüberwachung des Drucks, der durch das kontrahierende linke Ventrikel erzeugt wird.Im normalen Herzen liegt der entwickelte Druck zwischen 70 und 130 Millimeter Quecksilbersäule. Nach einer ischämischen Schädigung ist der entwickelte Druck vermindert und der enddiastolische Druck erhöht, wenn Tiere behandelt werden. Bei Gabe eines präkonditionierenden Wirkstoffs wie des Klassen-eins- und zwei-B-HDAC-Inhibitors SAHA vor der Entnahme kann der Basisdruck variieren, und die Auswirkungen der Ischämie-Reperfusionsschädigung sind abgeschwächt.Weitere Parameter der linksventrikulären Funktion können ebenfalls direkt aus der Softwareausgabe abgeleitet oder berechnet werden. Bei der Untersuchung des verletzten Herzens mit TTC, das metabolisch aktives Gewebe rot anfärbt, zeigte sich deutlich, dass die Herzen nach Ischämie-Reperfusionsschaden deutlich geringere metabolische Aktivität aufwiesen, was darauf hindeutet, dass sie infarziertes Gewebe enthielten, nachdem dieses Verfahren durchgeführt worden war. Techniken wie die Echtzeit-quantitative PCR, die Western-Blot-Analyse und die Massenspektrometrie können verwendet werden, um Fragen zu beantworten, beispielsweise: Welche biochemischen und genetischen Auswirkungen haben Ischämie, Reperfusionsschaden und pharmakologische Behandlung auf das Herz?

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieser Artikel beschreibt ein hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung Technik optisch Bild Aktionspotential Bewegung auf der Oberfläche von Langendorff-perfundierten Rattenherzen mit einem potentiometrischen Farbstoff (di-8-ANEPPS).

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