Name: Direkte Induktion von Hemogenic Endothel und das Blut durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren in der Personal pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Induktion von hämogenem Endothel und Blutzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen durch Überexpression von Transkriptionsfaktoren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der endothelialen hämatopoetischen Transition.

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Wir danken Matt Raymond für die redaktionelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde mit Mitteln des National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221 und P51 RR000167) und der Charlotte Geyer Foundation unterstützt.

1. Viruspräparate und Transcription Factor Kombinationen <ol><li> Die Lösungen mit pSIN-EF1 lentiviralen Expressionsplasmid, das Protein-kodierende DNA für ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 und LMO2 (Tabelle 1). </li><li> Messung der Konzentration und Reinheit von Plasmid-Präparationen durch die Aufzeichnung der UV-Absorption mit einem Spektrophotometer bei 230 nm, 260 nm und 280 nm für lentivirale Produktion verwendet. Hinweis: zeigen DNA-Präparationen A260 / 280 und A260 / 230-Werte größer als 1,8 werden im Allgemeinen als guter Qualität. Unter A260 / 280-Werte können Protein-Kontamination anzuzeigen, während niedrigere A260 / 230-Werte zeigen Verunreinigungen mit Salzen oder einem Lösungsmittel, wie Phenol. Empfehlens Plasmidkonzentration 1-3 ug / ul. </li><li> Erzeugen Lentiviren für Transduktionen wie in zuvor veröffentlichten Protokollen 11 beschrieben. Induktion von ER mit pan-myeloischer Wirkung bedarf Co-Expression von ETV2 und GATA1 oder ETV2 und GATA2.Induktion von ER mit erythro- und Megakaryozyten Potential erfordert GATA2 und TAL1. Die Zugabe LMO2 die Ausbeute an erythro-Megakaryozyten-Zellen aus hPSCs in Gegenwart GATA2 und TAL1 10 deutlich verbessert. </li></ol> 2. hPSCs Kultur Protocol <ol><li> Wachsen pluripotente Stammzellen in engen Kolonien mit scharfen Kanten zu 70-80% Konfluenz vor Subkultivierung. Mark und entfernen sich spontan vor Passagieren Zellen differenziert Kolonien. </li><li> Verdünnter kommerziellen extrazellulären Matrix-Gel (siehe Tabelle 2) gemß den Anweisungen des Herstellers und Mantel 6-Well-Platten über Nacht bei 4 ° C oder für mindestens eine Stunde bei 37 ° C vor der Verwendung. Vor der Passage-Zellen, saugen Sie den Matrix 2 ml frischem kommerziellen kompletten Kulturmediums (siehe Tabelle 2) und halten Platten bei 37 ° C, 5% CO 2, bis die Zellen bereit für die Aussaat. </li><li> Passage hPSCs <ol><li> Aspirate Medium aus einem konfluenten Vertiefung einer 6-Well-Platte mit hPSCs und fügen Sie 1,5 ml vorgewärmten Dispase II-Lösung (2 mg / ml in DMEM / F12, durch Filtration durch 0,22 um Filter sterilisiert). Inkubation für 5-7 Minuten bei 37 ° C, 5% CO 2, bis die Ränder der Kolonien beginnen, von der Oberfläche zu heben. </li><li> Saugen Sie Dispase II Lösung und vorsichtig waschen die Kolonien zweimal durch Zugabe und Absaugen von 2 ml frischem DMEM / F12-Medium. Dann, mit einem 5 ml serologische Glaspipette, distanzieren hPSCs mit 3 ml frisches kommerziellen komplettem Kulturmedium (siehe Tabelle 2) durch Pipettieren Zellsuspension nach oben und unten mehrere Male. </li><li> 0,5 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen, die 1,5 ml handelsüblicher vollständigen Kulturmedium (siehe Tabelle 2). Agitieren Platte hin und her, und von rechts nach links mehrmals, um eine gleichmäßige Zellverteilung gewährleisten, wenn situieren die Platte in den Inkubator. Halten Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 18-24 Std. </li><li> Am nächsten Tag Änderungsmedium an die frische kommerziellen komplettem Kulturmedium (siehe Tabelle 2) und untersuchen hPSCs Morphologie. Erfolgreiche Passagieren Ergebnisse in kleinen, gut befestigt Kolonien Halte HPSC Morphologie. hPSCs müssen 2,5-3 ml freshmedium pro Well täglich gefüttert und alle 4-5 Tage passagiert bei nicht mehr als 70-80% Konfluenz. HINWEIS: Wenn hiPSCs wurden auf embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) erhalten, müssen sie, um Feeder-freien Bedingungen übertragen und 2-3 mal passagiert, bevor eine effiziente Transduktion Differenzierung gewährleisten. </li></ol></li></ol> 3. Induktion von Hematoendothelial Pprecursors von hPSCs (Tag 0, Transduktion hPSCs) <ol><li> Zur Herstellung von Reaktionsmedium kombiniert 1,3 ml kommerziellen komplette Serum-freiem Medium (siehe Tabelle 2), Viren, Polybren und Y27632 ROCK-Inhibitor (Tabelle 1): in 1,3 ul 10 mM ROCK-Hemmer zu 1,3 ml Medium zu einer endgültigen Konzentrationention von 10 uM und Polybren bis zu einer Endkonzentration 6 ug / ml. <ol><li> Hinzufügen einer geeigneten Menge an Viruskonzentrat (e) in einer Endkonzentration von 0,5-1,0 MOI (multiplicity of infection) von jedem Virus pro Zelle. Halten Reaktionsmedium auf Eis oder bei 4 ° C, bis die Einzelzellsuspension bereit ist. HINWEIS: Die gleiche Menge des MOI für jeden Virus im GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1 und GATA2 / TAL1 / LMO2 Reaktionsmischungen ist optimal für die Induktion der Differenzierung. Doch in ETV2 / GATA2 transduzierten Kulturen verdoppelt MOI für GATA2, bezogen auf ETV2 verbessert Differenzierung. Daher ist für diesen Kulturen im Verhältnis 1: 2 zur MOI von ETV2 und 1 MOI von GATA2 empfohlen (zB wenn Viruskonzentrat etwa 6,8 x 10 7 Partikel / ml geschätzt, mit 10 ul ETV2 und 20 ul GATA2 viralen Konzentrate 0,68 x 10 6 Zellen pro ETV2 / GATA2 Reaktion in einem 35-mm-Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen). </li></ol></li><li> Bereiten hPSCs in einer einzelnen Zelle suspension. <ol><li> Wachsen hPSCs in Feeder-freien Bedingungen, wie in Kapitel 2 beschrieben Am Tag 4 nach der letzten Durchgang, beachten Zelldichte und Morphologie unter einem inversen Mikroskop. hPSCs sollte in engen Kolonien mit scharfen Kanten ohne spontane Differenzierung am Tag der Transduktion wachsen und ~ 60-70% Konfluenz. </li><li> Absaugen Medium, fügen Sie 1,5 bis 2 ml kommerziellen Zelldissoziation Reagenz (Tabelle 1) pro Vertiefung und bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 5-7 min. </li><li> Sammeln Zellen in gleichen Volumina von kommerziellen Vollmedium (siehe Tabelle 2) mit 10 &amp; mgr; M von ROCK-Hemmer, zählen Sie die Zellen und Lebensfähigkeit zu bestimmen. Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 min und anschließend hat ein Resuspendieren Zellen in kommerziellen Komplettmedium mit 10 &amp; mgr; M von ROCK-Inhibitor in einer Konzentration von 3.4-5 x 10 6 Zellen pro ml. BEACHTEN SIE: Die Zelllebensfähigkeit ist entscheidend für eine erfolgreiche virale Transduktion und nachfolgende Differenzierung.In der Regel sollte die Lebensfähigkeit der Zellen vor der Transduktion 90% überschreiten. </li></ol></li><li> Fügen Sie 200 ul der Zellsuspension, enthaltend 0,68 bis 1 x10 6 Zellen, in 1,3 ml der nach 3.1 hergestellten Reaktionsmedium. </li><li> Saugen Sie das Matrix-Lösung aus der Nacht beschichtete Platte mit 6 Vertiefungen in 2.2 vorbereitet. Transfer der Reaktionsmischung auf eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und zu verteilen Zellen gleichmäßig. Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 24 Std. Nach 24 Stunden mindestens 80% der Zellen sollte die Matrix gebunden werden. </li></ol> 4. Die Induktion von Hematoendothelial Vorstufen aus hPSCs (Tag 1-7) <ol><li> 24 Stunden nach der Transduktion, entfernen virushaltige Medium und waschen anhaftenden Zellen mit kommerziellen unvollständige Zellkulturmedium (siehe Tabelle 1) und fügen Sie dann 3 ml pro Vertiefung der Handels unvollständige Zellkulturmedium, das hämatopoetische Zytokine: SCF 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml bFGF 20 ng / ml (im folgenden als 3F-Medium bezeichnet). </li><li> Ersetzen Gesamt Medium durch frisches 3F-Medium an den Tagen 2, 3 und 4. Tag, um tote Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Tag 4, als schwimmende blutbildenden Zellen entstehen, ersetzen Sie die Hälfte der 3F-Medium jeden zweiten Tag, während das Gesamtvolumen bei 4 ml. HINWEIS: pSIN-EF1 &amp; agr; lentiviralen Expressionsplasmiden beinhalten Puromycinresistenzgen wodurch eine positive Selektion von transduzierten Zellen. Die 1 ug / ml Puromycin kann während der ersten 1-2 Tage der Differenzierung zu Medium zugegeben werden, um die zurückbleibende undifferenzierte hPSCs eliminieren. </li><li> Beachten Zellmorphologie am Tag 4 unter einem inversen Mikroskop: tight Cluster von Zellen mit typischen endotheliale Morphologie beginnen zu erscheinen (2A, 3A). Runde Blutkörperchen scheint von Tag 5 bis Tag 7 der Differenzierung, während einige Bereiche können hPSCs Morphologie beibehalten. Analyse HE und hämatopoetische Differenzierung wie unten beschrieben. ANMERKUNG: Erfolgreiche hematoendothelial verschiedeneniation führt zu der Produktion von Blutzellen, die lose auf die zugrunde liegenden flachen Endothelzellen gebunden als lichtbrechenden Rundzellen angezeigt. Diese Zellen aktiv vermehren Bildung kleiner Aggregate und schließlich lösen und Schwimmer (2A und 3A). Live Blutkörperchen kann visuell von den toten und sterbenden Zellen auf ihre Fähigkeit, das Licht zu reflektieren und in Kulturbedingungen zu erweitern. </li></ol> 5. Analyse der Hemogenic Endothel (HE) Stadium der Differenzierung. <ol><li> Detektieren die Bildung von HE zwischen den Tagen 3 und 4 der Differenzierung durch mikroskopische Beobachtung der Zellen mit endothelialen Morphologie. Es gibt keine schwimmBlutZellen in der Kultur in diesem Stadium der Differenzierung. Die Anwesenheit von HE kann durch Immunfluoreszenzfärbung bestätigt und durchflusszytometrische Analyse unter Verwendung von VE-Cadherin, CD73, CD226 und CD43 Antikörper. <ol><li> Um HE Bildung durch Durchflusszytometrieanalyse Verwendung Zellen an Tag 3 zu bewertenTag und 4 von einem Experiment. Sammeln Zellen durch Inkubation der Kulturen mit kommerziellen Zelldissoziation Reagenz (siehe Tabelle 1) für 5-10 min bei 37 ° C, 5% CO 2 und dann mit bis zu 1 x 10 5 Zellen pro Farbreaktion (Durchflusszytometrie beschrieben Färbeverfahren 12). HINWEIS: VE-Cadherin + HE-Zellen die Expression von frühen hämatopoetischen Marker CD226 zu erwerben, aber nicht über die Expression von CD73 und CD43 6. Im Gegensatz dazu nicht-HE-Zellen exprimieren CD73 (2B, 3B). </li></ol></li><li> Immunfluoreszenzfärbung für HPSC stamm er. <ol><li> Wäscht den beigefügten Monoschicht von Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und dann zu fixieren Zellen in 4% Paraformaldehyd bei 30 bis 60 min bei Raumtemperatur. </li><li> Wasche die Zellen einmal mit PBS und dann permeabilisiert mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Zellen in PBS zwei bis drei Mal und dann in inkubierenBlockierungspuffer, bestehend aus PBS mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), für 30 bis 120 min. </li><li> Vorbereitung Färbelösung, enthaltend sowohl primären Antikörper (1: 1000 Verdünnung) Maus-Anti-Human-CD43 und Kaninchen-Anti-Human-VE-Cadherin in PBS mit 5% FBS, (Tabelle 1). </li><li> Saugt den Blockierungspuffer von den Zellen und mit 1 ml pro Vertiefung Färbepuffer mit den zugesetzten primären Antikörper; inkubieren 3 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Durch Zugabe von 2 ml PBS mit 5% FBS wasche die Zellen dreimal. </li><li> Vorbereitung einer zweiten Färbepuffer mit sekundären Antikörper bei einer 1: 500 Verdünnung in PBS mit 5% FBS: Esel-Anti-Kaninchen mit grün fluoreszierenden Farbstoff und Anti-Maus mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff (Tabelle 1) konjugiert. 1 ml pro Vertiefung Sekundär Färbepuffer und bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Dreimal mit PBS ohne Serum zu waschen. Stain-Zellen mit 300 nM DAPI-Arbeitslösung in dH2 O für 10-15 min. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und fügen Sie 2-3 ml PBS in gut mit gefärbten Zellen. Beachten Fluoreszenz mit grünen, roten und blauen Mikroskop Filter. </li></ol></li></ol> 6. Analyse von induzierten hämatopoetischen Präkursoren <ol><li> Pflegen Differenzierungskulturen bis zum schwimmenden Zellen deutlich zu erweitern, bis zu 10-14 Tage, wechselnde Hälfte des 3F-Medium, wie in 3.1 beschrieben, alle zwei Tage. </li><li> Dissoziieren und sammeln Differenmonoschichten von Zellen, die durch Behandlung von Zellen mit einem kommerziellen Zelldissoziation Reagens (siehe Tabelle 1) für 5-10 min bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Führen Durchflusszytometrie unter Verwendung anti-VE-Cadherin, CD43 und CD45 Antikörper gegen die Blutbildung in Kulturen 12 zu bewerten. Beachten Sie, dass ein großer Anteil der Zellen, bis zu 40% der ETV2 und GATA2 transduzierten Zellen koexprimiert VE-cad und CD43. Die folgenden Antikörper können verwendet werden, um spezifische Zelllinien folgende E erfassenxpansion oder Differenzierung von induzierten Blutvorläuferzellen: CD235a (Erythrozyten), CD41a (Megakaryozyten), CD32 (alle Arten von Knochenmarkzellen), CD66b (Neutrophile) und CD163 (Makrophagen). </li><li> Zuführen CFC-Assay unter Verwendung eines kommerziellen klonogenen Medium (Tabelle 1) nach den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Transfer 1-2 × 10 4 Zellen in 3 ml handelsüblicher klonogenen Medium (siehe Tabelle 3), um die Anzahl der koloniebildenden Zellen und Arten von hämatopoetischen Kolonien zu bewerten. Optimale Aussaatdichte ermöglicht die Identifizierung und Isolierung von einzelnen Kolonien, die getrennt voneinander wachsen und sich nicht überlappen. Aussaatdichte kann zwischen den Experimenten abhängig von Differenzierung Effizienz variieren, aber sollte 1 x 10 4 Zellen pro 1 ml kommerziellen klonogenen Mediums nicht übersteigt. </li><li> Mischen Sie Zellen in kommerziellen klonogenen Medium durch sanftes Vortexen, und übertragen 3 ml Suspension zu zwei 35 mm Ultra-Low-Befestigungs Gerichtefür CFC-Assay wurden 1,5 ml der Suspension in jede Schale. Medium gleichmäßig verteilen und bei 37 ° C, 5% CO 2 für 14 Tage. Vermeiden Sie das Geschirr zu stören; beobachten, Koloniebildung am Tag 7 und Tag 10 des Tests. </li><li> Zu identifizieren und zu zählen hämatopoetischen Kolonien nach ihrer Morphologie am Tag 14. </li></ol></li></ol>

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</ol>

IS ist Gründungsaktionär und Berater für Cynata.

Das oben beschriebene Verfahren zur hämatopoetischen Differenzierung hPSCs durch Überexpression von TFs, stellt ein schnelles und effizientes Konzept für die Erzeugung von HE und myeloiden und erytho-magakaryocytic Progenitoren aus HES und iPSCs, wodurch die Produktion von bis zu 30 Millionen Blutzellen aus Million pluripotenten Stammzellen 10. Diese Methode zeigte konsequente Differenzierung in mehreren hESC und iPSCs Leitungen 10. Während der Differenzierung von ETV2 und GATA2, GATA1 Faktoren sow...

Die einzigartige Fähigkeit des menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sich selbst zu erneuern und sich in Zellen der drei Keimblätter, einschließlich Blut zu unterscheiden, machen sie ein wertvolles Werkzeug für die mechanistische Studien von hämatopoetischen Entwicklung, Modellierung von Blutkrankheiten, Wirkstoff-Screening, Toxizitätsstudien und die Entwicklung von Zelltherapien. Da die Blutbildung im Embryo Erlöse aus hemogenic Endothel (HE) durch eine endotheliale hämatopoetischen Gangs 1,2, die Erzeugung von HE in Kulturen wäre sehr wichtig, um die molekularen Mechanismen, die zur Regelung der Endothelzellen zu hämatopoetischen Übergangs und hämatopoetischen Spezifikation zu studieren. Derzeitigen Methoden für die Untersuchung der ER auf der Induktion von Differenzierung in hematoendothelial Aggregate (EVG) mit dem Zusatz von hämatopoetischen Cytokinen 3-5 und Cokultur hPSCs mit Hämatopoese-stützende Stromazellen 6,7 oder zweidimensionalen Kulturen mit extrazellulären basierend Matrizen und cytokines 8,9. Diese klassischen Differenzierung Methoden basieren auf der Einführung von Schauspiel an der Zelloberfläche und die Einleitung Kaskaden von molekularen Signalwege, die schließlich zur Aktivierung von Transkriptionsprogramm Führungs hematoendothelial Entwicklung führen externe Signale. Somit stützt sich der Wirkungsgrad hPSCs Differenzierungen in diesen Systemen auf einem effektiven Induktion von jenen Signalen, die Signaltransduktion in den Zellkern und die resultierende Aktivierung spezifischer Transkriptionsregulatoren. Darüber hinaus ist die Untersuchung von HE in herkömmlichen Differenzierungskulturen erfordert den zusätzlichen Schritt der Isolierung von HE-Zellen unter Verwendung der Zellsortierung. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die direkte Induktion von HE und Blut durch die Überexpression von hämatopoetischen Transkriptionsfaktoren. Dieses Verfahren ermöglicht die effiziente Induktion HE in eine Schale und eine direkte Beobachtung der endothelialen hämatopoetische Übergang ohne die Notwendigkeit zur Isolierung von HE mit einem umständlichen Zellsortierungsverfahren. Bildung HE und Blut von menschlichen pluripotenten Stammzellen können effizient durch Überexpression nur wenige Transkriptionsfaktoren (TFs) induziert werden. Die optimale Kombination von Transkriptionsfaktoren, die zur Induktion robust pan-myeloischer Blutbildung aus hPSCs umfasst ETV2 und GATA1 oder GATA2. Im Gegensatz dazu Kombination GATA2 und TAL1 induziert erythromegakaryocytopoiesis 10. Programmieren hPSCs durch Überexpression dieser Faktoren unterscheidet hPSCs direkt an das VE-cad + CD43 - CD73 - HE Zellen, die stufenweise den hämatopoetischen Phänotyp durch Expression von frühen hämatopoetischen Marker CD43 7 definiert erhalten. Diese lentiviralen basierendes Verfahren für die direkte Programmierung der menschlichen pluripotenten Stammzellen Verfahren ist anwendbar zur Erzeugung von HE und Blutzellen für mechanistische Studien, Studien endothelialer hämatopoetische Übergang und transkriptionale Regulation der hämatopoetischen Entwicklung und Spezifikation. Obwohl der current Protokoll beschreibt die Blutbildung mit konstitutiver Expression der Transgene, könnten ähnliche Ergebnisse unter Verwendung von modifizierten mRNA 10 erhalten werden.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Table 1. Induktion der Differenzierung von hPSCs mit Transkriptionsfaktoren und Analyse von hämogenem Endothel und Blutzellen.</p</td>></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61061</td><td>Lentiviraler Vektor</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61063</td><td>Lentiviraler Vektor</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61062</td><td>Lentiviraler Vektor</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61062</td><td>Lentiviraler Vektor</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61064</td><td>Lentiviraler Vektor</td></tr><tr><td>Hexadimethrinbromid (Polybrene)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Kationisches Polymer zur Steigerung der Effizienz von Infektionen</td></tr><tr><td>Y-27632 (Dihydrochlorid) ROCK-Inhibitor</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td>RHO/ROCK-Signalweg-Inhibitor Hemmt ROCK</td></tr><tr><td>StemPro Accutase-Zelldissoziationsreagenz</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/ stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>A11105-01</td><td>Zelldissoziationsreagenz</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>unvollständiges (wachstumsfaktorfreies) Kulturmedium &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; mTeSR1 Kundenspezifische Formulierung&nbsp;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>MCF</td><td><a name="REICHWEITE! D12">Serumfreies mTeSR1-Medium ohne bFGF und TGFb&nbsp; </a></td></tr><tr><td>human SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>Premium</td></tr><tr><td>grade human TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>Research grade</td></tr><tr><td>human FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Premium</td></tr><tr><td>grade CD144 (VE-cad) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>560411</td><td>Endothelial marker (FACS)</td></tr><tr><td>CD226 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>338305</td><td>Hämatopoetisch ( FACS)</td></tr><tr><td>CD43 PE</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>560199</td><td>Hämatopoetika (FACS)</td></tr><tr><td>CD73 APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB5795A</td><td>Endothelmarker (FACS)</td></tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555485</td><td>Hämatopoetika (FACS)</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Life Technologies</td><td>A1310</td><td>Lebend-/Tot-Assay (FACS)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Zellfixierung&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML&nbsp;</td><td>Permeabilisierung&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>Scientific SH3007003</td><td>Fötales Rinderserum</td></tr><tr><td>Maus Anti-Human-CD43</td><td>BD Biosciences</td><td>551457</td><td>Reiner, primärer Antikörper für die Immunfluoreszenz (IF)-Färbung</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Human-VE-Cadherin</td><td>BenderMedSystem</td><td>BMS158</td><td>Primär (IF)</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488-konjugiert</td><td>JacksonResearch</td><td>715-486-152</td><td>Sekundär (IF)</td></tr><tr><td>Anti-Maus Alexa Fluor 594-konjugiert</td><td>JacksonResearch</td><td>715-516-150&nbsp;</td><td>Sekundär (IF)</td></tr><tr><td>DAPI-Nukleinsäure-Färbung</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>D1306&nbsp;</td><td>Lebend-/Tot-Assay (IF)</td></tr><tr><td>Klonogenes Medium MethoCult H4435 Angereicherte</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>4435</td><td>CFC-Assay</td></tr><tr><td>Wright Färbelösung</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>32857</td><td>Färbung von Cytospins</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table 2. hPSCs culture.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs)&nbsp;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>hESCs (WA01, WA09) humane embryonale Stammzellen; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgenfreie induzierte pluripotente Stammzellen</td><td>hPSCs sind in der Lage, sich selbst zu erneuern und sich in Zellen aus drei Keimblättern zu differenzieren</td></tr><tr><td>Vollständiges serumfreies Medium für die Kultivierung von hPSCs &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; mTeSR1 Medien&nbsp; &nbsp;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>M500&nbsp;</td><td>Serumfreies Medium mit Wachstumsfaktoren für die feederfreie Kultur von ESC/iPSCs</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences/ Corning&nbsp;</td><td>356234</td><td>Matrix zur Konservierung von humanen ESC/iPSCs</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, Pulver&nbsp;</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>12500-062</td><td>Basalmedium&nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's PBS Pulver</td><td>Fisher Scientific</td><td>dSH30013.04</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Dispase II, pulver</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>17105-041</td><td>Neutrale Protease, Zelldissoziation</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer's Name</td><td><stark>Vorwärts (Fwd)&nbsp; 5' -->3' </td><td>Rückwärtsgang (Rev) 5'-->3' </stark></td><td><stark>Beschreibung&nbsp; </td></tr><tr><td>pSIN EF1a Fwd</td><td>TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA-</td><td>-</td><td>EF1a Promotorsequenz</td></tr><tr><td>GATA1 Rev</td><td>--</td><td>TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC</td><td>&nbsp; Codierungsregion&nbsp;</td></tr><tr><td>GATA2 Rev</td><td>--</td><td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG</td><td>&nbsp; Codierungsregion&nbsp;</td></tr><tr><td>TAL1 Rev</td><td>--</td><td>AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT</td><td>&nbsp; Codierungsregion&nbsp;</td></tr><tr><td>LMO2 Rev</td><td>--</td><td>GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC</td><td>&nbsp; Codierungsregion&nbsp;</td></tr><tr><td>ETV2 Rev</td><td>--</td><td>GAA CTT CTG GGT GG GCA GTA AC&nbsp;</td><td>&nbsp; Codierungsregion&nbsp;</td></tr></tbody></table>

direkte induktion von hemogenic endothel und das blut durch die Überexpression von transkriptionsfaktoren in der personal pluripotenten stammzellen

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Während der Entwicklung von einer Fachuntergruppe von Endothelzellen entstehen hämatopoetischen Zellen, hemogenic Endothel (HE). Modellierung HE Entwicklung in vitro ist für mechanistische Studien der endothelialen-hämatopoetischen Übergangs und blutbildenden Spezifikation. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die effiziente Induktion von HE aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) durch Überexpression von verschiedenen Sätzen von Transkriptionsfaktoren. Die Kombination von ETV2 und GATA1 oder GATA2 TFs wird verwendet, um die er mit pan-myeloischer Potential zu induzieren, während eine Kombination von GATA2 und TAL1 Transkriptionsfaktoren können zur Herstellung von SE mit erythroiden und megakaryozytischen Potential. Die Zugabe von LMO2 zu GATA2 und TAL1 Kombination wesentlich beschleunigt Differenzierung und erhöht erythroiden und Megakaryozyten-Zellen-Produktion. Dieses Verfahren stellt eine effiziente und schnelle Möglichkeit HE Induktion aus hPSCs und ermöglicht die Beobachtung des Endothel-hematopoietic Übergang in der Kulturschale. Das Protokoll enthält hPSCs Übertragungsverfahren und nach der Transduktion Analyse von HE und Blutvorläuferzellen.

Die schematische Darstellung des HE und Blut Induktion aus hPSCs durch Überexpression von Transkriptionsfaktoren ist in Abbildung 1 ETV2 mit GATA1 oder GATA2 Kombination gezeigt, induziert pan-myeloischer Blutbildung, während ein GATA2, TAL1 +/- LMO2 Kombination induziert vorwiegend erythro-megakaryozytären Hämatopoese. Beide TF-Kombinationen direkt induzierte HE-Zellen, die anschließend in Blutvorläuferzellen mit einem ausgeprägten Spektrums von hämatopoetischen Differenzierung verwandelt. Differenzier...

Dieses Protokoll beschreibt die effiziente Induktion von hämogenem Endothel und multipotenten hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen durch die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren.

Direkte Induktion von Hemogenic Endothel und das Blut durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren in der Personal pluripotenten Stammzellen

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, erythroide und myeloide Blutzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen durch die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren zu erzeugen. Diese Methode eignet sich zur Erzeugung homogener Endothelzellen in Blutzellen für Untersuchungen zum endothelialen Übergang zur Hepar-Entwicklung sowie zur transkriptionellen Regulation der Hepar-Entwicklung und -Differenzierung. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine ineffiziente, aber schnelle Methode zur Induktion homogener Endothelzellen aus humanen Vorläufer-Stammzellen bietet und die Beobachtung des endothelialen hämatopoetischen Übergangs in einer Zellkulturschale ermöglicht.Dr. Bruske, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin im Labor von Dr. Lin, wird die Prozedur demonstrieren. Bevor Sie beginnen, beschichten Sie sechswellige Platten mit einer extrazellulären Matrix wie Matrigel, indem Sie diese gemäß den Herstelleranweisungen verdünnen und in die Vertiefungen geben. Inkubieren Sie die Platten 30 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius. Für das Transduktionsmedium bereiten Sie zunächst Lentiviral-Aliquots für jeden Transduktionssatz vor, sodass die geschätzte Multiplizität der Infektion (MOI) von Virus zu Zellen eins Virus pro Zelle beträgt, und bewahren Sie diese bei vier Grad Celsius auf.Als Nächstes das komplette serumfreie Medium für hbsc-Viren poly brain mit einer Endkonzentration von sechs Mikrogramm pro Milliliter und den ROCK-Inhibitor Y 2 7 6 3 2 mit einer Endkonzentration von 10 Mikromolar in einem Gesamtvolumen von 1,3 Milliliter für jeden Transduktionssatz mischen und die Ansätze auf Eis stellen, um die Zellen vorzubereiten. Beginnen Sie mit einer gesunden Charge von pluripotenten Stammzellen bei 70 % Konfluenz, etwa vier Tage nach dem letzten Passieren. Falls humane pluripotente Stammzellen in MAPS kultiviert wurden, müssen sie zwei bis drei Passagen vor den Transduktionsexperimenten auf bedienerfreie Bedingungen umgestellt werden und gesunde Kulturen pluripotenter Stammzellen darstellen.Frei von spontaner Differenzierung. Das HPSC-Medium absaugen und zwei Milliliter Salzlösung zur Ablösung, wie beispielsweise Accutase, pro Vertiefung einer Sechs-Vertiefungs-Platte hinzufügen. Die Platte für fünf bis sieben Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Anschließend zwei Milliliter komplettes Medium mit 10 Mikromolar ROCK-Inhibitor hinzufügen und die abgelösten Zellen sammeln.Nach der Herstellung einer homogenen Zellsuspension eine kleine Aliquotprobe entnehmen und die lebensfähigen Zellen mit der Trypanblau-Ausschlussmethode zählen. Anschließend die Zellen bei 200 × g für fünf Minuten zentrifugieren und das Pellet in komplettem Medium mit 10 µM ROCK-Inhibitor in einer Endkonzentration von 3,4 × 10⁶ lebenden Zellen pro Milliliter resuspendieren. Danach 200 µL Zellsuspension, die 0,68 × 10⁶ Zellen enthalten, zu jedem der zuvor hergestellten 1,3 mL Transduktionsmedium hinzufügen.Entfernen Sie die mit Matrix beschichtete Sechswellplatte von 37 °C. Anschließend saugen Sie die Matrixlösung ab und geben jede der Transduktionsmischungen in einen Brunnen. Schwenken Sie die Platte, um die Zellen gleichmäßig im Brunnen zu verteilen. 24 Stunden.Nach der Transduktion die Wells unter dem Mikroskop visualisieren, um sicherzustellen, dass mindestens 80 % der Zellen angeheftet sind. Die Viruslösung verwerfen und die angehefteten Zellen mit unvollständigem Medium ohne Wachstumsfaktoren waschen. Anschließend drei Milliliter des mit Zytokinen ergänzten Mediums, das als drei F. Medium bezeichnet wird, zu den Zellen geben.Inkubieren Sie die Zellen am folgenden Tag über Nacht. Ersetzen Sie das Medium durch frisches Drei-F-Medium, das ein Mikrogramm pro Milliliter Puromycin enthält, um die verbleibenden nicht transduzierten Zellen zu eliminieren.Ersetzen Sie dieses Medium alle 24 Stunden, um abgestorbene Zellen zu entfernen. Nach 48 Stunden der Behandlung stellen Sie die Zugabe von Puromycin ein und verwenden ab Tag vier nur frisches Drei-F-Medium. Beobachten Sie die Zellen nach der Transduktion unter dem Mikroskop auf das Auftreten von Zellhaufen mit endothelialer Morphologie, um die Bildung von hemoendothelialen Zellen zu beurteilen.Bringen Sie die Zellen zwischen Tag drei und vier aus der Kulturschale zunächst mit der Zellablösungslösung in Verbindung. Sammeln Sie die abgelösten Zellen in komplettem Medium und zentrifugieren Sie diese, resuspendieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur in maximalem Puffer und zählen Sie die Zellen in einem Hämozytometer. Inkubieren Sie anschließend jeweils 1 × 10⁵ Zellen pro Anfärbereaktion mit geeigneten Antikörpern zum Nachweis von Vimentin, CD226, CD73 und CD43. Oberflächenmarker von Zellen.Die Durchflusszytometrie wird im Textprotokoll ab Tag vier beschrieben. Nach der Transduktion setzen Sie die Differenzierung der Zellen fort, indem Sie alle 48 Stunden zwischen fünf und sieben Tagen jeweils die Hälfte des Mediums in jeder Vertiefung erneuern. Runde Blutzellen erscheinen dann locker aggregiert und schweben über der endothelialen Zellschicht. Pflegen Sie die Kulturen bis zu 14 Tage lang, wobei sich die schwebenden Zellen in dieser Zeit deutlich vermehren sollten.Durchflusszytometrische Analyse von ETV zwei, gata eins und ETV zwei. Gata zwei-transduzierte Zellen zeigen die Bildung von Ter119-positivem Häm-Endothel, das durch die Expression von CD 2 26 und das Fehlen der CD 73-Expression am Tag drei bis vier der Differenzierung identifiziert werden kann. Durchflusszytometrische Analyse von ETV zwei, gata eins und ETV zwei. Gata zwei-transduzierte Zellen zeigen die Induktion von CD 43-exprimierenden Blutzellen am Tag sieben.Nach der Transduktion zeigt die Durchflusszytometrie-Analyse von gata zwei TAL eins LMO zwei induzierten Zellen am Tag 14 nach der Transduktion die Bildung von Blutzellen, die CD 2 35 A und CD 41 A exprimieren. Rechts gefärbte Zytosinpräparationen der gata zwei TAL eins lmo zwei induzierten hämatopoetischen Zellen zeigten erythroide, Makrophagen- und Megakaryozyten-artige Zellmorphologien in Kolonie-bildenden Zell-Assays. Die Transduktion menschlicher pluripotenter Stammzellen kann in weniger als einer Stunde durchgeführt werden, während des Transduktionsverfahrens. Es ist wichtig, stets die Stammzell-Vitalität zu berücksichtigen, den ROCK-Inhibitor in das Reaktionsgemisch einzuschließen und eine optimale Virusmenge pro Zelle nach den ersten drei Tagen zu verwenden.Nach der Transduktion können Methoden wie Immunfärbungen, Koloniebildungsassays und Durchflusszytometrie durchgeführt werden, um Fragen bezüglich der Differenzierungseffizienz und der Art der induzierten hämatologischen Erkrankung zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane pluripotente Stammzellen isoliert und infiziert, und was in den differenzierenden Kulturen innerhalb der ersten sieben bis zehn Tage zu erwarten ist. Nachdem Transkriptionsfaktoren erfolgreich in humane pluripotente Stammzellen eingeführt wurden, verlieren die Zellen ihre Pluripotenz und verpflichten sich schrittweise einem hämatopoetischen Schicksal.Daher verfügen Forscher über ein praktisches In-vitro-Modell, um die molekularen Mechanismen des Übergangs von endothelialen zu hämatopoetischen Zellen zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lentiviren, die Regionen enthalten, äußerst gefährlich sein kann, und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzausrüstung und die ordnungsgemäße Entsorgung von Viren, die solche Regionen enthalten, zu beachten sind, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

direct-induction-hemogenic-endothelium-blood-overexpression

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Induktion eines hämogenen Programms in embryonalen Fibroblasten der Maus durch Überexpression eines minimalen Satzes von Transkriptionsfaktoren. Diese Technologie kann auf das menschliche System übertragen werden, um Plattformen für zukünftige Studien zur Hämatopoese, zu hämatologischen Erkrankungen und hämatopoetischen Stammzelltransplantationen bereitzustellen.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

Wir schlagen ein Protokoll zur Reprogrammierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) vor. Durch das Plattieren der transduzierten Blutzellen auf matrixbeschichtete Platten mit Zentrifugation werden iPS-Zellen erfolgreich aus schwimmenden Zellen induziert. Diese Technik schlägt ein einfaches und effektives Reprogrammierungsprotokoll für Zellen wie PBMCs und CBMCs vor.

Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur effizienten Erzeugung integrationsfreier iPSCs aus menschlichen adulten peripheren Blutzellen. Durch die Verwendung von vier oriP/EBNA-basierten episomalen Vektoren zur Expression der Reprogrammierungsfaktoren KLF4, MYC, BCL-XL oder OCT4 und SOX2 können Tausende von iPS-Kolonien aus 1 ml peripherem Blut gewonnen werden.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Hier präsentieren wir menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC) Kultur Protokolle verwendet, um hPSCs in CD34 unterscheiden+ hämatopoetischen Vorläuferzellen. Diese Methode nutzt Bühne-spezifische Manipulation von kanonischer WNT signalisieren Zellen ausschließlich entweder die definitive oder primitive hämatopoetischen Programm angeben.

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

Hier stellen wir ein Protokoll zur präzisen Bildung hämogenen Endothelaus aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien Zustand vor. Diese Methode wird breite Anwendungen bei der Modellierung von Krankheiten und beim Screening auf therapeutische Verbindungen haben.

Hämogene Endotheldifferenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien definierten Zustand

Dieses Protokoll demonstriert die Induktion eines hämogen Programms in humanen dermalen Fibroblasten durch erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren GATA2, GFI1B und FOS zur Erzeugung hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen.

Hämogene Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten durch erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren

Hier wird ein einfaches Protokoll für die gezielte Differenzierung von hämogenen Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen in ca. 1 Woche vorgestellt.

Gerichtete Differenzierung hämogener Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von selbstorganisierenden Blutgefäßen aus humanen pluripotenten und induzierten pluripotenten Stammzellen. Diese Blutgefäßnetzwerke weisen ein ausgedehntes und verbundenes Endothelnetzwerk auf, das von Perizyten, Aktin der glatten Muskulatur und einer durchgehenden Basalmembran umgeben ist.

Erzeugung menschlicher Blutgefäß-Organoide aus pluripotenten Stammzellen

Hier wird ein einfacher Arbeitsablauf zur Unterscheidung von Endothelzellen von humanen pluripotenten Stammzellen beschrieben, gefolgt von einem detaillierten Protokoll für ihre mechanische Stimulation. Dies ermöglicht die Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie von Endothelzellen. Dieser Ansatz ist kompatibel mit nachgeschalteten Assays von lebenden Zellen, die nach mechanischer Stimulation aus dem Kulturchip entnommen wurden.

In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie

Erfahren Sie die effiziente Induktion von hämogenem Endothel und Blutzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen durch Überexpression von Transkriptionsfaktoren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der endothelialen hämatopoetischen Transition.

Direkte Induktion von Hemogenic Endothel und das Blut durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren in der Personal pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal

Direkte Induktion von Hemogenic Endothel und das Blut durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren in der Personal pluripotenten Stammzellen

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