Immunhistochemische Visualisierung von Hippocampus-Aktivität nach Spatial Learning in einem Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Veränderungen in der Phosphorylierung des Hippocampus nach räumlichem Lernen bei Grailed zwei Knockout-Mäusen als Modell für neurologische Entwicklungsstörungen zu detektieren. Dies wird erreicht, indem zunächst sowohl Wildtyp- als auch im Gral zwei Knockout-Mäuse im Morris-Wasserlabyrinth getestet werden. In einem zweiten Schritt werden die Gehirne der Mäuse entnommen und Schnitte von Wildtyp- und Knockout-Mäusen durch Viome-Cutting präpariert.

Als nächstes werden Hirnschnitte von Wildtyp- und Knockout-Mäusen für die Immunhistochemie aufbereitet und zum Nachweis von Phosphorylierungsänderungen im Hippocampus verwendet. Die Ergebnisse zeigen Unterschiede in der hippokampalen RC-Phosphorylierung zwischen Wildtyp- und in Grals-Zwei-Knockout-Mäusen, basierend auf der lichtmikroskopischen Visualisierung der immunhistochemischen Färbung. Diese Methode ermöglicht es, spezifische Untergruppen von Hippocampus-Neuronen zu identifizieren, die nach einer Hippocampus-abhängigen speziellen Lernaufgabe wie dem Maurice-Wasserlabyrinth aktiviert werden.

Wir fügten die Idee für diese Methode hinzu, als wir uns entschieden, die molekulare Kaskade zu untersuchen, die das molekulare Defizit bei Knockout-Mäusen zweiten Grades unterstreicht, einem Mausmodell für Autismus-Spektrum-Störungen. Zu Beginn trainieren Sie Mäuse mit unterschiedlichem Hintergrund in einer räumlichen Lernaufgabe wie der Morris Water Mae. Befolgen Sie am Ende der Trainingszeit das Trainingsschema, wie es im begleitenden Textprotokoll beschrieben ist, euthanasieren Sie die Mäuse und reparieren und entfernen Sie dann ihre Gehirne.

Wenn Sie bereit sind, mit dem Eingriff fortzufahren, verwenden Sie ein Skalpell, um das Kleinhirn zu entfernen. Klebe dann den Rest des Gehirns aufrecht auf die Halterplatte des Vibratos. Schneiden Sie das Gehirn in 20 bis 40 Mikrometer dicke serielle Abschnitte durch den dorsalen Hippocampus.

Übertragen Sie jede Scheibe in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die mit einem Milliliter 0,1 molaren PBS gefüllt ist, und übertragen Sie drei bis fünf dorsale Hippocampus-Schnitte für jede Maus in die Vertiefungen einer 24-fachen Multi-Well-Platte, die jeweils 500 Mikroliter 0,1 molare PBS enthält. Waschen Sie die in jeder Vertiefung enthaltenen Abschnitte gut mit 500 Mikrolitern 0,1 molaren PBS; führen Sie alle Wäschen und Inkubationen bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren durch, sofern nicht anders angegeben. Unter einem Abzug werden die Schnitte 20 Minuten lang in 40 % Methanol und 1 % Wasserstoffperoxid in 0,1 molar PBS inkubiert, um die endogene Peroxidaseaktivität zu löschen.

Nach drei weiteren Waschgängen in 0,1 molaren PBS permieren Sie die Schnitte, indem Sie sie fünf Minuten lang in 500 Mikrolitern 0,2 % Triton X 100 inkubieren, während die Schnitte inkubieren, und bereiten Sie genügend Blockierungspuffer für das gesamte Experiment vor. Entfernen Sie dann die durchlässige Lösung und fügen Sie jeweils 100 Mikroliter des Blockierungspuffers hinzu. Inkubieren Sie die Abschnitte eine Stunde lang.

Entfernen Sie anschließend den Blockierungspuffer und bedecken Sie die Abschnitte mit phosphorylierter extrazellulärer regulierter Kinase. Der Primärantikörper wurde um eins bis 500 in Blockpuffer verdünnt. Inkubieren Sie die Schnitte am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren, nachdem Sie die Schnitte dreimal fünf Minuten lang in 0,1 molaren PBS gewaschen haben.

Inkubieren Sie die Abschnitte jeweils mit einem Biotin-konjugierten Sekundärantikörper, der während der Inkubation eine Stunde lang bei Raumtemperatur um eins bis 250 in Blockpuffer verdünnt wurde. Bereiten Sie das A BC-Reagenz mindestens 30 Minuten vor der Verwendung vor, damit sich der Aden- und Biotin-Komplex bilden kann. Nachdem Sie die Schnitte noch dreimal mit 0,1 molaren PBS gewaschen haben, fügen Sie das Reagenz A, B, C hinzu und lassen Sie es 45 Minuten lang mit der Probe inkubieren.

Bereiten Sie während des nächsten Satzes von drei Wäschen in PBS die DAB-Arbeitslösung im Abzug gemäß den Herstellerangaben vor und aliquotieren Sie die DAB-Arbeitslösung in der Platte. Übertragen Sie dann die Abschnitte in die Vertiefungen, die die DAB-Arbeitslösung enthalten, und schwenken Sie die Platte langsam, um eine maximale Exposition der Abschnitte mit der Lösung zu ermöglichen. Überwachen Sie die DAB-Reaktion am Mikroskop, bis sich ein ausreichendes Signal entwickelt.

Stoppen Sie die Reaktion in etwa zwei bis fünf Minuten bei der gewünschten Farbintensität, indem Sie das Gewebe in 0,1 molaren PBS waschen. Nach drei weiteren Wäschen in PBS montieren Sie die Abschnitte auf gelatinebeschichtete Objektträger und trocknen Sie sie mindestens drei bis vier Stunden lang bei Raumtemperatur. Sobald die Luft getrocknet ist, werden die Objektträger in den Abzug übertragen und die Abschnitte dehydriert, indem sie nacheinander zwei Minuten lang in integrierten Ethanollösungen platziert werden, und dann die Objektträger fünf Minuten lang in 100 % Xylol reinigen.

Decken Sie die Objektträger ab, schieben Sie sie mit Eindeckmedium auf und lassen Sie sie über Nacht im Abzug, um sie trocken in ein Hellfeldmikroskop zu übertragen, das mit einer Kamera und einem 20-fach-Objektiv ausgestattet ist. Erfassen Sie mehrere Hellfeldbilder von jedem Abschnitt mit 200-facher Vergrößerung, die das dorsale Hippocampus-Bild abdecken. Drei bis fünf Abschnitte von jedem Tier.

Hier sind Schnitte aus den dorsalen Hippo-Campi-Regionen einer Wildtyp-Maus und einer Grailed-Maus mit zwei Knockouts zu sehen, die für phosphoryliert gefärbt sind. Extrazellulär reguliert eine zuverlässige molekulare Auslesung der lernabhängigen neuronalen Aktivierung. Beide Mäuse hatten vor der Tötung ein klassisches hippocampusabhängiges räumliches Lernaufgabenregime, das Morris-Wasserlabyrinth, durchlaufen.

Am letzten Testtag zeigten die Grailed Two-Knockout-Mäuse ein signifikantes räumliches Lerndefizit im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen. Um die Hirnschnitte der Mäuse zu analysieren, wurde die Gesamtzahl der positiven Zellen in den verschiedenen Regionen des Hippocampus gezählt. In der CA-Drei-Parameter-Schicht wiesen Wildtyp-Mäuse signifikant mehr phosphorylierte RK-positive Zellen pro Fläche auf als in den Knockout-Mäusen.

Gegenteilige Ergebnisse wurden in der Hili- und Körnerzellschicht (GCL) gefunden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Phos-Formulierung auf Gehirnschnitten aus dem Hippocampus sowohl genetischer als auch pharmakologischer Mausmodelle für neurologische Entwicklungsstörungen untersuchen können, die durch kognitive Defizite gekennzeichnet sind. Diese Technik kann auch verwendet werden, um Veränderungen der Irk-Kraftformulierung in anderen Gehirnbereichen zu untersuchen und kognitive Verhaltensaufgaben zu verfolgen, die sich vom Maurice-Wasser-Labyrinth unterscheiden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit DIA-Benzin extrem desertieren kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen geeigneter Schutzmaßnahmen.