Leichte und effiziente Herstellung von Tri-Komponente Fluorescent Glycopolymere über RAFT-kontrollierte Polymerisation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die gut kontrollierte Synthese fluoreszenzmarkierter statistischer linearer Glykopolymere unter Verwendung der reversiblen Additions-Fragmentierungs-Kettenübertragungspolymerisation (RAFT-Polymerisation). Dies wird erreicht, indem zunächst das Glycomonomer 2-Lactobiose-Ethylmethacrylamid, oder L-A-E-M-A, synthetisiert wird. Im zweiten Schritt erfolgt die RAFT-Polymerisation von L-A-E-M-A mit N-(2-Aminoethyl)methacrylamid (AEMA) und N-(2-Hydroxyethyl)acrylamid oder AGAA, um das entsprechende Glykopolymer mit niedriger Dispersität herzustellen.

Anschließend wird das Glycopolymer an einem seiner primären Amine durch Umsetzung mit Carboxyfluorescein-Xitomittelester modifiziert, um ein fluoresceinmarkiertes Glycopolymer herzustellen. Im letzten Schritt wird das fluoresceinmarkierte Glycopolymer an Lectin-beschichtete Agarosekügelchen mit bekannter Kohlenhydrat-Bindungsspezifität gebunden. Abschließend kommt die Fluoreszenzmikroskopie zum Einsatz, um die Bindung der Glycopolymere an die Agarosekügelchen zu analysieren und damit zu bestätigen, dass das Glycopolymer das gewünschte Kohlenhydrat enthält und mit einem fluoreszierenden Marker versehen ist.

Der Vorteil der RAF-Polymerisation gegenüber etablierten Methoden, die konventionelle Radikalpolymerisationen verwenden, liegt darin, dass das WRATH-Verfahren eine kontrollierte Polymerisationstechnik ist, die die Anzahl der von Initiatoren abstammenden Ketten minimiert. Dies führt zu Polymeren mit vorbestimmten Molmassen und einer sehr engen Polydispersität. Die Polymerisationen können auf eine definierte Monomerenmischung angewendet werden, um spezifische fluoresezierende Glycopolymere herzustellen.

Diese Glycopolymere weisen definierte Bindungseigenschaften auf, die mithilfe von mit Lektinen beschichteten Kügelchen überprüft werden können. Die effiziente Herstellung fluoreszierender Glycopolymere dürfte für die Glykobiologieforschung in Zukunft von großem Wert sein. Geben Sie zunächst zwei Gramm Lactobionsäure in drei Milliliter wasserfreies Methanol ein.

Fügen Sie anschließend langsam absolutes Ethanol tropfenweise zur Lösung hinzu, bis diese gerade trüb wird. Entfernen Sie alle Lösungsmittel mittels eines Rotationsverdampfers. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, um 1,94 Gramm Lacto Bioo One Five Lacton mit einer Ausbeute von 98 % zu erhalten.

Geben Sie eine Lösung von einem Gramm Lacto-Bio-Lacton in drei Milliliter Methanol zu einer Lösung von AEMA und MEHQ in zwei Milliliter Methanol hinzu. Fügen Sie anschließend ein Milliliter Triethylamin hinzu und rühren Sie das Gemisch bei Raumtemperatur. Nach 48 Stunden geben Sie 20 Milliliter entionisiertes Wasser zum Gemisch hinzu und überführen es in einen Rotationsverdampfer.

Verdampfen, bis vollständig trocken. Das Rückstandsmaterial in 20 Milliliter deionisiertem Wasser lösen und die Lösung auf die Säule einer 10 mal 20 Millimeter großen Anionenaustauschersäule auftragen. Unter den Auslass ein Becherglas mit einem Milligramm MEHQ stellen und die Säule in dieses Becherglas eluieren.

Nachdem die Lösung im Rotationsverdampfer eingebracht wurde, lösen Sie den Rückstand in 20 Milliliter deionisiertem Wasser und geben Aliquote von jeweils einem Milligramm Ionenaustauscherharz hinzu. Führen Sie Hydrant-Tests durch, bis der Test negativ ausfällt, indem Sie jeweils ein Mikroliter der Lösung entnehmen und auf eine Dünnschicht-Chromatographie-Platte auftragen. Besprühen Sie die Platte mit einer 2 %igen Anhy-Lösung in Ethanol und erhitzen Sie sie eine Minute lang auf einer Heizplatte bei 90 Grad Celsius.

Der Endpunkt ist erreicht, wenn sich keine blaue Farbe mehr bildet. Danach filtrieren Sie die Lösung durch ein Glasfilter in ein Reagenzglas. Gefrieren Sie die Lösung bei minus 80 Grad Celsius und überführen Sie sie anschließend in einen Gefriertrockner, um sie zu lyophilisieren.

Lösen Sie den Rückstand in einer minimalen Menge Methanol auf und fällen Sie das Produkt durch Zugabe von minus 20 Grad Celsius kaltem und wasserfreiem Aceton ab. Sammeln Sie das ausgefällte L-A-E-M-A durch Filtration über einen Glasfrittentrichter. Überführen Sie den Trichter mit dem Niederschlag in einen Vakuumexsikkator zur Trocknung, zunächst mit 0,5 Gramm etwa 150 Mesh großer Aluminiumoxid-Nanopartikel in ein Milliliter handelsübliches HEAA in einem Zwei-Milliliter-Reagenzglas.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 ×g für 30 Sekunden und verwenden Sie die obere Schicht als inhibitorfreies HEAA. Lösen Sie vorsichtig 32,8 Milligramm L-A-E-M-A, 1,7 Milligramm eines EMA und 27,5 Mikroliter inhibitorfreies HEAA sowie 0,4 Milliliter entionisiertes Wasser auf und überführen Sie die Lösung in ein gut gereinigtes 1-Milliliter-Flankröhrchen. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter Raft-Reagenz und 50 Mikroliter Initiator-Reagenz zu dem Röhrchen hinzu und mischen Sie durch vorsichtiges Antippen der Röhrchenwand bei geschlossenem Ventil. Schließen Sie das Röhrchen an eine Vakuumleitung an und gefrieren Sie den Inhalt mithilfe eines Trockeneis-Ethanol-Bades ein.

Danach den Druck im Rohr mit einer Pumpe vorsichtig auf etwa 50 Millitorr senken und das Ventil schließen. Das Trockeneisbad entfernen und den Inhalt auftauen lassen. Den Gefrier-, Vakuum- und Auftauzyklus noch zweimal sorgfältig wiederholen.

Überprüfen Sie das Röhrchen, um sicherzustellen, dass sich der Inhalt vollständig aufgelöst hat, und wirbeln Sie es bei Bedarf vorsichtig um. Bevor Sie das Röhrchen lagern, nehmen Sie es von der Vakuumleitung ab und stellen es in einen transparenten Kunststoff-Vakuumbeutel. Entfernen Sie die Luft aus dem Beutel mit einer manuellen Kunststoffpumpe.

Danach den Beutel 24 Stunden lang in ein geschlossenes Wasserbad bei 70 Grad Celsius stellen. Anschließend das Röhrchen aus dem Beutel nehmen und dessen Inhalt in einen Dialysebeutel mit einer molekularen Durchlassgrenze von 3.500 Dalton überführen. Den Dialysebeutel in einen Becher geben und gegen zwei Liter entionisiertes Wasser 24 Stunden dialysieren.

Überführen Sie den Inhalt der Dialysebeutel in ein Reagenzglas und stellen Sie dieses bei minus 80 Grad Celsius in einen Gefrierschrank. Nach dem Einfrieren überführen Sie es in einen Gefriertrockner und trocknen es gefriergetrocknet. Um zunächst das fluffige weiße Glycopolymer PMA LA EMA zu erhalten, bereiten Sie eine Lösung von fünf Milligramm PMA LA EMA in 0,9 Milliliter PBS vor.

Fügen Sie anschließend langsam 0,6 Milligramm Carboxyfluorescein-cin, middle eter in 100 Mikrolitern Dimethylformamid zu der schnell gerührten Lösung im Mikroröhrchen unter Aluminiumfolie hinzu und rühren Sie 16 Stunden lang langsam bei Raumtemperatur. Überführen Sie die Lösung in einen Dialysebeutel mit einer Molekulargewichts-Cutoff-Grenze von 3.500 Dalton. Stellen Sie den Beutel in ein Becherglas und dialysieren Sie gegen zwei Liter entionisiertes Wasser für 16 Stunden, wobei Sie den Beutel vor Licht geschützt halten. Überführen Sie den Inhalt des Dialysebeutels in ein Reagenzglas.

Nachdem die Lösung bei minus 80 Grad Celsius eingefroren wurde, gefriertrocknen. Um das fluffige, gelbe, fluoreszenzmarkierte P-M-A-L-A-E-M-A-Glykopolymer zu erhalten, bestimmen Sie das zahlenmittlere Molekulargewicht, das gewichtsmittlere Molekulargewicht und die Dispersität der Glykopolymere mit einem HPLC-System. Geben Sie zunächst 1,5 Milliliter PBS zu einer 50-Mikroliter-Suspension aus Erythra-Galactose-Lektin-beschichteten Aro-Perlen in einem Zentrifagenröhrchen.

Danach die Probe bei 300 ×g eine Minute lang zentrifugieren. Anschließend die Überstände verwerfen und die Waschung insgesamt dreimal wiederholen, bevor abschließend 0,5 Milliliter PBS zugegeben werden. Eine Lösung von drei Mikrogramm des mit Fluorescein markierten PMA LA EMA in sechs Mikroliter PBS zum Reagenzgefäß mit den Lectin-beschichteten Kügelchen hinzufügen.

Verwenden Sie fluoresceinmarkiertes P-M-A-G-A-E-M-A als Negativkontrolle. Wickeln Sie die Röhrchen anschließend in Aluminiumfolie ein und inkubieren Sie sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie das Röhrchen eine Minute lang und entfernen Sie den Überstand.

Wieder verwende man, suspendiere die Perlen in 1,5 Milliliter frischem PBS und wiederhole die Waschung dreimal. Abschließend suspendiere man die Perlen erneut in 0,2 Milliliter PBS. Übertrage vier Mikroliter der suspendierten Perlen in eine Vertiefung einer Immunfluoreszenzmikroskopieplatte, platziere sie auf einem Objektträger und decke sie mit einem Deckglas ab. Dokumentiere die Probe.

Bilder des Objektträgers mit einem fluoreszierenden Mikroskop, das mit einem 10x-Objektiv, FITC-Filter und Kamera ausgestattet ist. Die Glykopolymere wurden mittels Gelpermeationschromatographie analysiert. Polymere, die ohne Verwendung von RAFT synthetisiert wurden, weisen eine deutlich höhere Dispersität auf als solche, die unter Verwendung von RAFT hergestellt wurden.

Wenn mit Fluorescein markiert, ändert sich das physikalische Erscheinungsbild des Glykopolymers von weiß zu einer intensiven gelben Farbe, die unter UV-Licht sichtbar ist. Eine Lösung des unmarkierten Polymers bleibt dunkel, während das mit Fluorescein markierte Polymer hellgrün leuchtet. Die spezifische Bindung an mit Lektin beschichtete Kügelchen tritt nur bei Polymeren auf, die seitlich angebundene Zuckerreste tragen. Die Kügelchen leuchten grün, wenn sie gebunden sind, während sie dunkel bleiben, wenn sie mit Polymeren behandelt werden, die keine seitlich angebundenen Zuckerreste aufweisen. Diese auf Rafts basierende Polymerisationstechnik ermöglicht eine große Flexibilität hinsichtlich der Art der herstellbaren Glykopolymere.

Die nachfolgende Markierung der Glykopolymere kann ebenfalls mit einer Vielzahl fluoreszierender Reagenzien erfolgen, die in der Lage sind, in wässriger Umgebung mit primären Aminen zu reagieren. Forscher im Bereich der Glykobiologie können mithilfe dieser Technik leicht hochgradig vielseitige und definierte Glykopolymere erhalten. Diese Glykopolymere können als Werkzeuge verwendet werden, um die Bindungsspezifitäten von Kohlenhydraten zu untersuchen, wie sie beispielsweise in den Atemwegen von Patienten mit Mukoviszidose oder bei zahlreichen Arten menschlicher Krebserkrankungen beobachtet werden.