Leichte und effiziente Herstellung von Tri-Komponente Fluorescent Glycopolymere über RAFT-kontrollierte Polymerisation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die gut kontrollierte Synthese von fluoreszierenden statistischen linearen Glykopolymeren mittels reversibler Additionsfragmentierung, Kettentransfer oder Raftpolymerisation. Dies wird erreicht, indem zunächst das Glykomonomer mit zwei Lacto-Bioethylmeth-Acrylamid oder L-A-E-M-A synthetisiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Raft-Polymerisation von L-A-E-M-A-N, zwei Aminoethylmethacrylamid oder A EMA und N zwei Hydroxyethylacrylamid oder einem GAA zu verwenden, um das entsprechende Glykopolymer mit geringer Dispersität zu synthetisieren.

Als nächstes wird das Glykopolymer an einem seiner primären Amine durch Reaktion mit dem Carboxyfluorescein Xitomittelester modifiziert, um ein fluoreszeiniertes Glykopolymer herzustellen. Der letzte Schritt besteht darin, das fluoresceinnative Glykopolymer an mit Lektin überzogene Rose-Kügelchen mit bekannter Kohlenhydratbindungsspezifität zu binden. Letztendlich wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Bindung der Glykopolymere an die entstandenen Kügelchen zu analysieren und zu bestätigen, dass das Glykopolymer das gewünschte Kohlenhydrat besitzt und mit einem Fluoreszenztag markiert ist.

Der Vorteil der RAF-Polymerisation gegenüber bestehenden Methoden, die herkömmliche Polymerisationen mit freien Radikalen verwenden, besteht darin, dass es sich bei dem Wrath-Verfahren um eine Kontrollpolymerisationstechnik handelt, die die Anzahl der vom Initiator abgeleiteten Ketten minimiert. Das Ergebnis sind Polymere mit vorgegebenen Molekulargewichten und einem sehr schmalen Polydispersitätsgestell. Polymerisationen können auf ein definiertes Gemisch von Monomeren zur Herstellung spezifischer fluoreszierender Glykopolymere angewendet werden.

Diese Glykopolymere haben definierte Bindungsfähigkeiten, die durch die Verwendung von lektinbeschichteten Kügelchen überprüft werden können. Die effiziente Herstellung von fluoreszierenden Glykopolymeren sollte sich in Zukunft als sehr wertvoll für die Glykobiologie erweisen. Lösen Sie zunächst zwei Gramm Lacto-Bionsäure in drei Millilitern wasserfreiem Methanol auf.

Geben Sie dann langsam tropfenweise absolutes Ethanol in die Lösung, bis sie nur noch trüb wird. Verwenden Sie einen Rotationsverdampfer, um alle Lösungsmittel zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, um 1,94 Gramm Lacto Bioo und fünf Lacton mit einer Ausbeute von 98 % herzustellen.

Eine Lösung von einem Gramm Lacto-Biolacton in drei Millilitern Methanol wird zu einer Lösung von A, EMA und MEHQ in zwei Millilitern Methanol gegeben. Als nächstes fügst du einen Milliliter Triethylamin hinzu und rührst die Mischung bei Raumtemperatur um. Nach 48 Stunden fügen Sie der Mischung 20 Milliliter entionisiertes Wasser hinzu und geben Sie es in einen Rotationsverdampfer.

Verdampfen, bis es vollständig trocken ist. Lösen Sie den Rückstand in 20 Millilitern entionisiertem Wasser auf und tragen Sie die Lösung auf eine 10 x 20 Millimeter große Anionenaustauschersäule auf. Stellen Sie ein Becherglas mit einem Milligramm MEHQ unter den Auslass und eluieren Sie die Säule in das Becherglas.

Nachdem die Lösung in einem Rotationsverdampfer gezogen wurde, lösen Sie den Rückstand in 20 Millilitern entionisiertem Wasser auf und fügen Sie ein Milligramm Aliquote Ionenaustauscherharz hinzu. Bis ein Hydrantentest negativ ist, wird er in Hydrantentests durchgeführt, indem ein Mikroliter der Lösung entfernt und auf eine Dünnschichtchromatographieplatte aufgetragen wird. Sprühen Sie die Platte mit einer 2%igen Anhy in Ethanollösung ein und erhitzen Sie sie eine Minute lang bei 90 Grad Celsius auf einer heißen Platte.

Der Endpunkt wurde erreicht, wenn sich keine blaue Farbe bildet. Als nächstes filtrierst du die Lösung durch einen frittierten Glastrichter in ein Reagenzglas. Frieren Sie die Lösung bei minus 80 Grad Celsius ein und geben Sie sie dann zur Gefriertrocknung in einen Gefriertrockner.

Lösen Sie den Rückstand in einer minimalen Menge Methanol auf und fällen Sie das Produkt durch Zugabe von minus 20 Grad Celsius und wasserfreiem Aceton aus. Sammeln Sie das ausgefällte L-A-E-M-A durch Filtration durch einen frittierten Glastrichter. Übertragen Sie den Trichter und den Niederschlag in ein Vakuum-Trockenmittel zum Trocknen zuerst bei 0,5 Gramm von etwa 150 mesh Aluminiumoxid-Nanopartikeln auf einen Milliliter HEAA in handelsüblicher Qualität in einem zwei Milliliter-Reagenzglas.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen 30 Sekunden lang bei 300-fachem G und verwenden Sie die oberste Schicht als inhibitorfreies HEAA. Lösen Sie vorsichtig 32,8 Milligramm L-A-E-M-A, 1,7 Milligramm eines EMA und 27,5 Mikroliter inhibitorfreies HEAA und 0,4 Milliliter deionisiertes Wasser und geben Sie die Lösung in ein gut gereinigtes Ein-Milliliter-Flankenröhrchen. Geben Sie als nächstes 50 Mikroliter Raft-Reagenz und 50 Mikroliter Initiator-Reagenz in das Röhrchen und mischen Sie, indem Sie bei geschlossenem Ventil vorsichtig auf die Seite des Röhrchens klopfen. Schließen Sie das Röhrchen an eine Vakuumleitung an und frieren Sie den Inhalt mit einem Trockeneis-Ethanolbad ein.

Reduzieren Sie dann den Schlauchdruck mit einer Pumpe auf 50 Millitorr und schließen Sie das Ventil. Entfernen Sie das Trockeneisbad und lassen Sie den Inhalt auftauen. Wiederholen Sie den Gefrier-, Vakuum- und Auftauzyklus zweimal vorsichtiger.

Überprüfen Sie das Röhrchen, um sicherzustellen, dass sich der Inhalt vollständig aufgelöst hat, und wirbeln Sie es bei Bedarf vorsichtig auf. Nehmen Sie vor dem Einsetzen das geschlossene Rohr aus der Vakuumleitung und legen Sie es in einen durchsichtigen Kunststoff-Vakuumbeutel. Evakuieren Sie die Luft mit einer Handpumpe aus Kunststoff aus dem Beutel.

Legen Sie den Beutel dann für 24 Stunden in ein abgedecktes Wasserbad bei 70 Grad Celsius. Nehmen Sie anschließend den Schlauch aus dem Beutel und überführen Sie den Inhalt in einen Dialysebeutel mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 3.500 Dalton. Legen Sie den Dialysebeutel in ein Becherglas und dialysieren Sie 24 Stunden lang gegen zwei Liter entionisiertes Wasser.

Füllen Sie den Inhalt des Dialysebeutels in ein Reagenzglas und stellen Sie es bei minus 80 Grad Celsius in einen Gefrierschrank. Nach dem Einfrieren in einen Gefriertrockner umfüllen und gefriertrocknen. Um das flauschige weiße Glykopolymer PMA LA EMA zu erhalten, bereiten Sie zunächst eine Lösung aus fünf Milligramm PMA LA EMA in 0,9 Millilitern PBS vor.

Als nächstes fügen Sie langsam 0,6 Milligramm Carboxyfluoresceincin, mittlere 100, Mikroliter Dimethylformamid zu der schnell gerührten Lösung, dem Mikroröhrchen und der Folie hinzu und rühren Sie 16 Stunden lang bei Raumtemperatur langsam um, überführen Sie die Lösung in einen Dialysebeutel mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 3.500 Dalton. Legen Sie den Beutel in ein Becherglas und dialysieren Sie 16 Stunden lang gegen zwei Liter entionisiertes Wasser, während Sie ihn vor Licht schützen. Übertragen Sie den Inhalt des Dialysebeutels in ein Reagenzglas.

Nachdem Sie die Lösung bei minus 80 Grad Celsius eingefroren haben, gefrieren Sie sie trocken. Um das flauschige, gelb fluoreszierte Glykopolymer mit der Bezeichnung P-M-A-L-A-E-M-A zu erhalten, bestimmen Sie die Anzahl, das durchschnittliche Molekulargewicht, das Gewicht, das durchschnittliche Molekulargewicht und die Dispersität der Glykopolymere mit einem HPLC-System. Zuerst bei 1,5 Millilitern PBS auf eine 50 Mikroliter Suspension von Ery Krista Galeere Lektin beschichteten Aro-Kügelchen in einem Zentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen bei 300 mal G für eine Minute. Entsorgen Sie anschließend den Überstand und wiederholen Sie die Wäsche noch zweimal, bevor Sie schließlich 0,5 Milliliter PBS hinzufügen. Geben Sie eine Lösung von drei Mikrogramm des mit Fluorescein markierten PMA LA EMA in sechs Mikrolitern PBS in das Röhrchen mit den mit Lektin überzogenen Kügelchen.

Verwenden Sie Fluoreszein, markiertes P-M-A-G-A-E-M-A als Negativkontrolle. Wickeln Sie die Röhrchen anschließend in Folie ein und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie das Röhrchen eine Minute lang und entsorgen Sie den Überstand.

Dann wiederverwenden, die Kügelchen in 1,5 Milliliter frischem PBS aufhängen und den Waschgang dreimal wiederholen. Zum Schluss reus suspendieren Sie die Kügelchen in 0,2 Millilitern PBS Übertragen Sie vier Mikroliter der suspendierten Kügelchen in eine Vertiefung eines Immunfluoreszenzmikroskops. Schieben und mit einem Glasdeckglas abdecken.

Bilder des Objektträgers mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem 10-fach-Objektiv-FITC-Filter und einer Kamera ausgestattet ist. Die Glykopolymere wurden mittels Gelpermeationschromatographie analysiert. Polymere, die ohne Verwendung von raft synthetisiert werden, haben eine viel höhere Dispersion als solche, die mit raft hergestellt werden.

Bei der Markierung mit Fluorescein ändert sich das physikalische Erscheinungsbild des Glykopolymers unter UV-Licht von weiß zu einer stark gelben Farbe. Eine Lösung aus unmarkiertem Polymer bleibt dunkel, während das mit Fluorescein markierte Polymer hellgrün leuchtet, was das Vorhandensein der markierungsspezifischen Bindung an mit Lektin beschichtete Kügelchen bestätigt, tritt nur bei Polymeren auf, die hängende Zuckerreste tragen. Kügelchen leuchten grün, wenn sie gebunden sind, während sie dunkel bleiben, wenn sie mit Polymeren behandelt werden, denen hängende Zuckerreste fehlen. Diese Raft-basierte Polymerisationstechnik ermöglicht eine große Flexibilität bei der Art der synthetisierten Glykopolymere.

Die anschließende Markierung der Glykopolymere kann auch mit einer Vielzahl von Fluoreszenzreagenzien erreicht werden, die in der Lage sind, mit primären Mitteln in einer wässrigen Umgebung zu reagieren. Forscher auf dem Gebiet der Glykobiologie können diese Technik nutzen, um auf einfache Weise äußerst vielseitige und definierte Glykopolymere zu erhalten. Diese Glykopolymere können als Werkzeuge verwendet werden, um die Spezifitäten der Kohlenhydratbindung zu untersuchen, wie sie bei Patienten mit Mukoviszidose oder bei vielen Krebsarten beim Menschen beobachtet werden.