Name: Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit In-vitro- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Lernen Sie eine zuverlässige In-vitro-Methode zur Quantifizierung der Endothelialzell-Haftfähigkeit mit fibronektinbeschichteten Deckgläsern. Diese Technik ermöglicht präzise Messungen für die vaskuläre Biologieforschung.

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Wir sind Simon Bouffler sehr dankbar für seine volle Unterstützung und Public Health England für die Unterstützung der Infrastruktur. Diese Arbeit wurde von Public Health England durch den Zuschuss des National Institute for Health Research (NIHR) unterstützt. Dieser Bericht wurde vom NIHR in Auftrag gegeben. Die in dieser Veröffentlichung geäußerten Ansichten sind die der Autoren und nicht unbedingt die des NHS, des NIHR oder des Gesundheitsministeriums. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

1. Herstellung von Deckgläsern <ol><li> Sterilisieren, 12 mm Durchmesser Runddeckgläser durch Einweichen in 70% Ethanol für mindestens 10 Minuten unter gelegentlichem Rühren auf Gesamtengagement aller Deckgläser an den Ethanol zu gewährleisten. Gießen Sie Deckgläser und Ethanol in einen sterilen Zellkulturschale (entweder 6 cm oder 10 cm Durchmesser). </li><li> Mit einem Paar von sterilen feinen Pinzette 5B, abholen und legen jedes einzelne Deckglas in eine Vertiefung einer 24-Well-Clusterplatte. Achten Sie darauf, dass die Deckgläser sind nicht die Seiten der gut zu berühren und sind etwa in der Mitte des Brunnens. </li><li> Verlassen Sie die un-überdachte 24 Clusterplatte mit Deckgläsern in der Flussschrank trocknen. Dieser Vorgang dauert ca. 10 min </li><li> Während dieser Zeit bereiten die Beschichtungsmischung durch Verdünnen von 10 mg / ml humanem Fibronectin in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) mit 0,1 mg / ml. </li><li> Wenn die Deckgläser trocken sind, Pipette 100 ul Beschichtungslösung auf jedes Glas Coverslip so dass die Lösung nur den Glas ohne Bündelung auf der Außenseite der Wanne. Legen Sie die überdachte 24 Clusterplatte in einem Zellkulturbrutschrank für mindestens eine Stunde. </li><li> Kurz vor der Verwendung das Beschichtungslösung. Die gleiche Beschichtungslösung kann in ein steriles Röhrchen überführt und bis zu dreimal ohne sichtbaren Verlust der Wirksamkeit verwendet werden. </li></ol> 2. Herstellung von endothelialen Zellschicht <ol><li> Kultur menschlicher Koronararterien-Endothelzellen (EC) in Medium bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid. </li><li> Absaugen Kulturmedien und spülen EC-Monoschicht mit 10 ml HBSS </li><li> Absaugen HBSS und 2 ml 0,5% Trypsin, 0,2% EDTA-Lösung. Inkubieren bei Raumtemperatur für ca. 5 min. </li><li> Bei EC kann durch einen Wasserhahn an der Seite des Kolbens verdrängt werden 5 ml Sojabohnen-Trypsininhibitor und mit Pipette spritzen die Oberfläche der Kolben weiter zu verdrängen die Zellen. </li><li> Transfer Zellen in ein 15 ml Zentrifugenrohr und das Rohrbei 200 · g für 5 min. </li><li> Absaugen des Überstandes und Resuspendieren der EC Pellet in 5 ml Medium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und stellen Sie die Zellkonzentration zu 50.000 EC pro ml EC Medien. </li><li> Verzichtet werden 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung der 24 Well-Platte mit beschichteten Deckgläser. Zellen O / N in Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid. </li><li> Die Zellen sind bereit für den Einsatz in Experimenten, wenn ein konfluenter Monolayer gebildet wird, innerhalb von 3 Tagen. </li></ol> 3. Herstellung von Monozyten <ol><li> Übertragen HL-60-Zellen, die in RPMI kultiviert, das mit 10% fötalem Kälberserum, als Suspensionskultur in eine 15 ml Röhre. Zentrifugieren der Zellen bei 200 g für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellen in 5 ml Medium und stellen Sie die Zellkonzentration mit Medien zu 2 Millionen Zellen / ml. Wenn die Fluoreszenzmarkierung der HL-60 erwünscht ist, Resuspendieren der Zellen in RPMI ohne Serum und proceed, wie in Kapitel 4 beschrieben. </li><li> 0,5 ml von HL-60-Zellsuspension in jede Vertiefung der 24-Well-Clusterplatte, die EC-Monoschicht und Inkubieren der Platte in einem Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid für eine gewählte feste Zeitperiode zwischen 1 und 3 hr. Kaum einen Unterschied zwischen 1 Stunde und 3 Stunden Zeitpunkt, an dem Bindungssättigung erreicht wird beobachtet. </li><li> Bereiten Sie sich auf Zellwasch / Ernte: Füllen Sie einen 120-ml-Tube mit 100 ml HBSS. Dispense 1 ml Formalin in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen frisch. </li><li> Nach der Inkubationszeit, verwenden Sie ein Paar scharfe Pinzette und holen sich das Deckglas aus dem Brunnen und halten Sie die Deck vertikalen und tupfen Sie den Rand des Deckglases auf einem Stück Gewebe auf der Bank für 3 Sekunden, dabei nicht zur Note Zelle bedeckten Oberfläche des Deckglases mit dem Gewebe. </li><li> Halten Sie das Deckglas fest mit einer Zange, tauchen sie das Deckglas in die und aus den HBSS fünfmal. </li><li> Nach dem fünften dunkin HBSS, dab die Kante des Deckglases auf dem Gewebe für 3 sec. </li><li> Wiederholen Sie die in 3.6 und 3.7 beschrieben Dunking und Abtupfen Verfahren, so dass insgesamt drei Sätze von 5 Dunks, gefolgt von einem DAB. </li><li> Übertragen der Deck in eine Vertiefung, die 10% Formalin, um die Zellen bei Raumtemperatur zu fixieren. Das Deckglas ist bereit für Aufzählung für langfristige Lagerung oder zu anderen nachfolgend beschriebenen Verfahren unterzogen werden. </li></ol> 4. Kennzeichnung von HL-60-Zellen mit Zell Tracker (optional) <ol><li> Zählen und übertragen entsprechende Menge an HL-60-Zellen (beispielsweise 10 Millionen) in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge HL-60-Zellen bei 200 g für 5 min. Überstand entfernen. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in Cell Tracker in RPMI-Medium ohne Serum in einer Konzentration von 1 Million Zellen / ml. Zellen in Zellkulturbrutschrank für 1 Stunde. </li><li> Centrifuge Zellen bei 200 xg für 5 min und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Zellpellet in Medium auf eine Konzentration von 2 Mio cEllen / ml. </li><li> 0,5 ml der Zell Tracker-markierten HL-60 in jede Vertiefung enthält Endothelzellen auf Deckglas aufgewachsen. Weiterhin bei 3,3. </li></ol> 5. Enumeration von Adhesive Endothelzellen <ol><li> Berg Deckgläser auf Objektträger mit DAPI Gegenfärbung, einzelne Zellen zu identifizieren. </li><li> Mit einem inversen Mikroskop mit einer 4X oder 10X-Objektiv erwerben Bilder aus mehreren Feldern (zB 5-Felder) und zähle die höchste Anzahl von Monozyten, die auf nicht-bestrahlte Endothelzellen aggregieren (Dies sollte in der Regel 3-5 sein). </li><li> Stellen Sie zweimal diese Zahl als die Schwelle von Monozyten auf Endothelzellen zu werden, dass als Cluster definiert. Falls erforderlich, kann ein anderes Kriterium für die Definition eines Clusters je nach Art des Experiments verwendet werden. </li><li> Zählen die Anzahl der Cluster und die Anzahl der Endothelzellen in dem Feld. Unterteilen den ersteren durch den letzteren, um den Prozentsatz von Klebstoff endothelialen Zellen zu erhalten. Ergebniszahlreichen Bereichen, um einen Mittelwert und Standardabweichung der Grafen zu erhalten. </li></ol> 6. Gegenfärbung mit Antikörpern <ol><li> Nachdem der Adhäsionstest und Zellen auf dem Deckglas in 10% Formalin für 15 min bei RT fixiert worden ist, zu unterwerfen, die Deckgläser der Immunfluoreszenz unter Verwendung von Standardverfahren 10 und Antikörper der Wahl. </li><li> Hinzufügen und die verschiedenen Lösungen zu entfernen sehr vorsichtig, um zu vermeiden, verdrängen Monozyten, die gebunden sind an Endothelzellen. </li></ol> 7. Gegenfärbung für Seneszenz-assoziierte Beta-Galactosidase-Aktivität <ol><li> Nachdem der Adhäsionstest und Zellen auf dem Deckglas in Formalin für 15 min Färbung für Seneszenz-assoziierte &amp; beta; -Galactosidase-Aktivität fest, wie in den Anweisungen, die Färbekit begleiten beschrieben. Hinzufügen und die verschiedenen Lösungen zu entfernen sehr vorsichtig, um zu vermeiden, verdrängen Monozyten, die gebunden sind an Endothelzellen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die oben beschriebene Monozytenadhäsion Assay wurde erfolgreich in Experimenten entwickelt, um die biologischen Wirkungen von ionisierender Strahlung auf endothelialen Monoschichten 10 Studie verwendet. Obwohl dies nicht die einzige Methode zur Verfügung, um die Haftfähigkeit einer endothelialen Monoschicht zu bewerten, ist es das einzige Verfahren, das die Quantifizierung der Anteil oder Prozentsatz der Endothelzellen in einer Monoschicht, die Klebemittel ermöglicht. Dies ist ein wichtiger Unterschied, als globale quantitative Änderung der Haftung der Monozyten kann durch andere Methoden gemessen, entweder auf eine allgemeine Erhöhung der Haftfähigkeit aller Zellen der endothelialen Monoschicht oder auf die Erhöhung Haftfähigkeit einer Teilpopulation von Endothelzellen zurückzuführen in der Monoschicht, wie im obigen Beispiel gezeigt. Der Wert der mit diesen Daten wird durch die Tatsache veranschaulicht, dass die Fähigkeit der Anteil der Endothelzellen, die eine verbesserte Haftfähigkeit zeigte quantifizieren nach Bestrahlung führte zu den inesfähig Schlussfolgerung, dass dieser Effekt nicht auf genetische Mutation eines bestimmten Gens als der Prozentsatz von Zellen, die Klebstoff waren, waren wesentlich höher (mehr als 1000-mal mehr), was aus zufälligen Mutation eines Gens durch Röntgenstrahlung bei dieser Dosis zu erwarten wäre, . Der Faktor, der eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ermöglicht, ist die Waschregime. Als Waschverfahren beinhaltet das Eintauchen des Glasdeckglases in Waschpuffer, gefolgt von Abtupfen auf einem Gewebe, wird die Variabilität in der Puffer Turbulenz, die zwangsläufig entsteht aus der alten Methode der Zugabe der Waschpuffer in ein Bohrloch vermieden. Tatsächlich war es die Beobachtung der übermäßigen Variabilität zwischen Wiederholungen mit der Pipettierverfahren die uns gezwungen, einen Waschvorgang, der die Variabilität Element aus dem Waschschritt entfernt ersinnen erhalten. Zugegeben, die Grenzen dieses Tests liegen in der Notwendigkeit zur Durchführung von manuellen Zählung der Monozyten-Cluster, die n tunot damit sie angepasst werden für die Hochdurchsatzanalysen. Zweitens hat die Entscheidung darüber, wie viele Monozyten bilden ein Cluster bis halb willkürlich festgelegt werden und der Pegel zu hoch eingestellt und führen zum Ausschluss von einigen echten Cluster werden. Der Mangel an Schubkraft in diesem Verfahren kann auch als eine Beschränkung in Experimenten, in denen grob verbesserte Haftfähigkeit von Endothelzellen induziert (zB + TNFa) betrachtet werden. In anderen Situationen ist jedoch die mangelnde Scherkraft ein Vorteil, da es den Nachweis von weniger triebene Steigerung des Haftvermögens ermöglicht. Moderaten Anstieg der Monozyten Haftfähigkeit besonders wichtig und relevant sein. In vivo würde Monozyten nicht (in einer typischen Versuchszeit) erwartet, in großer Zahl anzubringen, um Zellen mit moderaten Anstieg der Haftfähigkeit, vor allem aufgrund einer Scherkraft endotheliale werden. In der Zeit jedoch würden wahrscheinlich einen Monozyten, und dies ist eher die Umgebung der chronischen Entzündung dar. Als solche,die Abwesenheit von Scherkraft kann ein Vorteil sein, da es die Möglichkeit bietet geringen Anstieg des endothelialen Zellhaftfähigkeit in Versuchszeitrahmen, die typischerweise kurz und möglicherweise zu flüchtig, um zu ermöglichen bescheidene Erhöhung der Haftfähigkeit unter Scherbeanspruchung beobachtet werden offenbart werden. Die Fähigkeit, die Zellen nach diesem Test zu anderen Analysen wie Seneszenz Assays und Immunfluoreszenz-Färbung unterwerfen erhöht die Nützlichkeit dieses Verfahrens, wie es erlaubt die Assoziation von Haft spezifischer Endothelzellen an bestimmten zellulären Proteinen oder Zellzuständen, wie oben gezeigt, eine Funktion, die ist nicht verfügbar, mit den älteren Adhäsionsassays. Dieses Verfahren wurde mit est2 immortalisierte menschliche koronare Endothelzellen und ähnlichen Ergebnissen verwendet wurden auch mit primären menschlichen Koronar-Endothelzellen 10 erhalten, was zeigt, dass es nicht spezifisch für nur eine bestimmte Zelllinie. Auch die adoption dieses Verfahren zum Testen der Haftfähigkeit Endothelzellen nicht entgegenWerfen der gleichen Zellen auf die Standard Adhäsionsassay die Fluoreszenz von markiertem Immunzellen mißt. Gemeinsam dieser Bericht zeigt, dass diese Methode ist vielseitig, inclusive und bietet viel mehr Informationen als die Standard Adhäsionsassay.

Infiltration von Immunzellen, wie Monozyten durch die endotheliale Zellschicht, die Blutgefäße auskleiden, ist ein wichtiger Schritt im Entzündungsprozess 1. Dies ermöglicht die Referenzierung von Immunzellen (Immunzellen) zu einem Ort der Verletzung. In anderen Fällen und Orten wie der koronaren Arterie und Carotis Arterie kann die Infiltration von Monozyten durch Endothel um das unerwünschte langfristiger Aufenthalt dieser Zellen in die Wand der Arterie führen, was möglicherweise zur Bildung von Plaques 2 führt. In allen Fällen der Immunozyt Infiltration, beinhaltet der erste Schritt der Aktivierung der Endothelzellen in einem lokalisierten Bereich des Blutgefäßes. Endothelzellen werden durch proinflammatorische Zytokine wie TNF-α und IL-6, um die Expression von Zelloberflächenproteinen, wie VCAM, ICAM und E-Selectin, welche die Einstellung und Befestigung des Immunozyten auf die Endothelzelloberfläche 3- erleichtern erhöhen aktivierten 6. 7 endotheliale halten durchgeführt. Die Grenzen dieses Verfahrens in Bezug auf Genauigkeit führte zur Verwendung von radioaktiv markierten Lymphozyten oder Monozyten, gefolgt von Quantifizierung der radioaktiven Materials, das Lymphozyten oder Monozyten Adhäsion 4 entspricht. Dieses Verfahren wurde schließlich durch eine auf Fluoreszenz basierende Methode, wobei die Immunozyten von Interesse wurden mit Fluoreszenzfarbstoff, wie oben mit dem Unterschied, dass die Fluoreszenz anstelle von Radioaktivität markiert und mit demselben Verfahren gemessen, 8 ersetzt. Derzeit ist diese Methode als die bequemste entstanden und wird als Bausatz von mehreren kommerziellen Anbietern vertrieben. Während dieser Assay relativen Grade der Haft zwischen Kontrollen und Versuchsproben zu messen, ist es nicht erkennen, ob eine Veränderung der Fluoreszenz ist auf eine gleichmäßige Veränderung der Haftfähigkeit über die gesamte Endothelial Zellpopulation oder wenn die Änderung auf Grund einer Differenz des Haftvermögens innerhalb einer Subpopulation von Zellen. Es ist auch offensichtlich, dass die Stringenz der Wasch übt einen großen Einfluss auf das Ergebnis, und was noch wichtiger ist, wird die Gleichförmigkeit der Abspülen ungebundenen Monozyten zwischen verschiedenen Endothelzell-Monoschichten stark vom Grad der Übereinstimmung der Ergebnisse von Wiederholungsversuchen und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zwischen den Proben auswirken . In jüngerer Zeit mehrere Systeme, die Monozyten auf eine endotheliale Zellschicht Pumpe in Medien wurden verwendet, um dieses Problem anzugehen 9. Darüber hinaus sind diese Flusssysteme die Wirkung der Scherkraft auf den Endothelzellen rekapitulieren auch. Während die Vorteile dieser Systeme sind klar und sehr attraktiv ist, ist es auch wichtig zu erkennen, dass, während endothelialen Zellhaftfähigkeit kann stark erhöht werden, wie es bei akuten Entzündungen der Fall ist, die durch Faktoren wie TNF &amp; einigen anderen Aktivatoren, wie ionisierende Strahlung 10 entlocken ändert that nicht ohne weiteres in in vitro Versuchszeitrahmen von diesen sehr strengen Systemen erkannt. Während solche kurzfristigen Änderungen der endothelialen Zellhaftfähigkeit nicht leicht zu entdecken oder in vitro entlassen, ist es nicht in vivo, wenn diese kleinen Änderungen innerhalb eines Lebenszeit, die charakteristisch für die chronische Entzündung ist, kann auch Resultate ausüben notwendigerweise gutartig. Daher ist eine robuste und zugleich empfindliche und spezifische Verfahren zum Nachweis und zur Messung von Endothelzellen Klebrigkeit erforderlich ist. Hier berichten wir ein Verfahren zur Haftfähigkeit der Endothelzellen direkt zu messen. Dieses Verfahren hängt nicht von der Fluoreszenzmessung angewiesen als indirekter Indikator Surrogat endothelialer Zellhaftfähigkeit. Es offenbart, ob Änderungen in Haftfähigkeit durch einheitliche Änderung in allen Zellen oder zu einer Teilpopulation beschränkt sind. Ferner ermöglicht es co-Färbung von Endothelzellen mit Markern wie Seneszenz-assoziierte &amp; beta; -Galactosidase, die Lebensfähigkeit der Zellen marker, Calcien AM und Antikörper gegen Zelloberfläche und intrazellulären Proteinen, so dass die Zuordnung der einzelnen Klebstoff Endothelzellen an bestimmte Zellzustände oder Expression spezifischer Proteine.

<table><tbody><tr><td>Hepes gepufferte Kochsalzlösung (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser aus Glas Rund 12 mm Durchmesser</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Cluster-Platte</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Meso-Endo-Zellmedien</td><td>Zellanwendungen</td><td>212-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Sojabohne Trypsin-Inhibitor</td><td>Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Green</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Life Technologies</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Glasctosidase-Assay-Kit&nbsp; &nbsp;</td><td>CellSignaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td></td></tr></tbody></table>

die quantifizierung der endothelial cell haftfähigkeit<em&gt; in-vitro-</em

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Einen der wesentlichen Prozesse der Entzündung ist die Infiltration von Immunzellen aus dem Lumen des Blutgefäßes zu dem umgebenden Gewebe. Dies geschieht, wenn Endothelzellen, die die Blutgefäße auskleiden, werden Klebstoff auf zirkulierenden Immunzellen, wie Monozyten. In vitro-Messung der Haftfestigkeit wurde bis jetzt durch die Quantifizierung der Zahl der Monozyten, die einer Endothelschicht haften entweder als direkte Zählung geschehen oder durch indirekte Messung der Fluoreszenz der anhaftenden Monozyten. Während solche Maße tun gibt die durchschnittliche Haftfestigkeit der endothelialen Zellpopulation, werden sie von einer Reihe von Faktoren, wie beispielsweise Zellzahl verwechselt werden, und der Anteil der Endothelzellen, die tatsächlich Klebstoff nicht verraten. Hier beschreiben wir und zeigen ein Verfahren, das die Zählung von Haftzellen innerhalb eines Versuchspopulation der endothelialen Monoschicht ermöglicht. Endothelzellen werden auf Deckgläsern gezüchtet und nach WunschBehandlung mit Monozyten in Frage gestellt (das fluoreszenzmarkierte werden kann). Nach der Inkubation einer Spülprozedur, die mehrere Runden des Eintauchens und Entleeren werden die Zellen fixiert. Klebstoff Endothelzellen, die durch Monozyten, umgeben sind, leicht identifiziert und aufgezählt, so dass eine Haftindex, den tatsächlichen Anteil der Endothelzellen in der Population, die Klebe, offenbart.

Dieses Verfahren erlaubt den Nachweis von einzelnen Klebstoff Endothelzellen innerhalb einer Population. Während beispielsweise eine Monoschicht von nicht-bestrahlten Endothelzellen beibehalten einige sporadische HL-60-Monozyten nach Inkubation und Waschen, endothelialen Monoschicht nach 7 Tagen post-10Gy Bestrahlung vor der Inkubation mit Monozyten wurden durch Monozyten in Clustern um einzelne Endothelzellen gebunden ( Abbildung 1). Obwohl dieses Phänomen ist unter Phasenkontrastmikroskopie leicht beobachtbar, Fluoreszenzmikroskopie zeigt ein noch klareres Bild von den Monozyten-Clustern. Nach Durchführung des beschriebenen Adhäsionstest, ist es möglich, bis zu Färbung der Zellen für Membran cytoplasmatische oder Kern (Abbildung 2) von Proteinen unter Verwendung geeigneter Antikörper, die mit Standard-Immunfluoreszenz-Methoden vorgehen. Weiterhin kann enzymbasierten Assay wie Seneszenz-assoziierte &amp; beta; -Galactosidase (Figur 3) auch sein performed. Da jeder Monozyten Cluster entspricht einem einzelnen Endothelzellen wird Aufzählung der Cluster die tatsächliche Anzahl der Klebe Endothelzellen in der Monoschicht zeigen (Figur 4) und somit der Klebstoffanteil Endothelzellen innerhalb der Population (Tabelle 1, Abbildung 6) . Dies ist die einzige Methode, um Datum, wie die Quantifizierung von endothelialen Zellhaftfähigkeit ermöglicht. Es ist bemerkenswert, dass die Endothelzellen in den hier beschriebenen Experimenten verwendeten kontaktinhibiert und nicht in Reihe nach dem Erreichen Konfluenz erhöhen. Das beseitigt das Komplexität durch erhöhte endotheliale Zellzahl zu späteren Zeitpunkten gestellt. Falls gewünscht, kann Monozyten an Endothelzellen-Monoschichten angebracht um 0,5% Trypsin-EDTA-Lösung, 0,2% (statt Fixierung 3.9) abgelöst werden und deren Fluoreszenz gemessen unter Verwendung eines Plattenlesegeräts, wie es in der zeitgenössischen Methoden der Fall ist (Abbildung 5). </p&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> Abbildung 1. Adhäsion von Monozyten an Monoschicht von Endothelzellen. Auf nicht-bestrahlte Endothelzellen, Monozyten als Einzelzellen in einer sporadischen und zufällige Weise (linke Felder) und in Clustern auf einzelnen Endothelzellen der 7 Tage nach 10 Gy bestrahlten geklebt Monoschicht (rechte Bilder). Lower Panels sind Fluoreszenzbilder der oberen Platten, die bestätigt, dass die kleinen und hellen Kugelzellen unter Phasenkontrast sichtbar sind in der Tat Monozyten, die mit den Cell-Tracker-Grün vor, markiert waren. Einige der Monozyten Cluster sind durch weiße Pfeile angedeutet. Bilder wurden unter Verwendung eines 10X-Objektiv genommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <html><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> Abbildung 2. Färbung der Endothelzellen für Proteine ​​post-Adhäsionsassay. Nach Durchführung des beschriebenen Adhäsionstest Zellen an den Deckgläsern wurden einer für den Nachweis von (A) Membranprotein (CD44) Immunfluoreszenz, b) cytoplasmatische Protein (Tubulin) oder c) Kernprotein (γ-H2AX). Linke Felder aus (A) und (B) (mit 20x-Objektiv gesehen) mit Handy Tracker Grün und dem ähnlichen Bild auf der rechten Panels zeigen Monozyten vormarkiert offenbaren CD44 und Mikrotubuli (rot) und DAPI-gefärbten Zellkernen (blau). Weiße Pfeile in (C) zeigen Sie bestrahlten Endothelzellen-Kerne, die mit Antikörpern gegen γ-H2AX färbt wurden. Monozyten-Kerne, die ein helleres Blau durch DAPI gefärbt sind, werden leicht von den oval geformten Kernen der Endothelzellen aus. Die Bilder wurden mit 20x-Objektiv genommen.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> Abbildung 3. Seneszenz-assoziierte beta-Galaktosidase-Färbung von Endothelzellen. Nach Adhäsionsassay, Zellen auf Deckgläsern wurden Färbung für Seneszenz-assoziierte beta-Galactosidase, die Lysosomen von alternden Zellen zu blau verursacht unterzogen, wie sich in den Endothelzellen, dass wird selektiv durch zahlreiche Monozyten, die leicht identifiziert werden aufgrund ihrer geringen Grße und Kugelform gebunden. Bild durch 20X Ziel gesehen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4. Bestimmung von Monozyten Clustern einzelner Endothelzellen. Nach Adhäsionsassay, Bilder der Zellen wurden aus verschiedenen Positionen und Monozyten-Cluster identifiziert sind, und eingekreist (grün). Ein Cluster als eine Agglomeration von 10 oder mehr Monozyten auf einer Endothelzelle definiert. Die Anzahl der Monozyten-Cluster und Anzahl von 12 Tagen nach der bestrahlten Endothelzellen (Dotted in rot) im Bild wurden gezählt und der Prozentsatz der adhärenten Endothelzellen berechnet, wie in Tabelle 1. Bild durch 10X-Objektiv genommen gezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Figur.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> Abbildung 5. Quantifizierung der Fluoreszenz von adhärenten Monozyten. Nach adhe<html> sion Assay Zellen auf Deckgläsern wurden mit Trypsin behandelt und die Fluoreszenz der Monozyten voretikettierten mit Celltracker Grün wurde gemessen, wobei ein Fluoreszenz-Plattenlesegeräts, als indirekter Indikator für die Haftfähigkeit der endothelialen Monoschicht. Die Ergebnisse aus diesen Messungen zu festgesetzten Tage nach der Bestrahlung wurden erhalten und flochten in der Grafik oben. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> Abbildung 6. Darstellung der Adhäsionstest Scores aus Tabelle 1. Klebstoff Endothelzellen in fünf verschiedenen Stellen auf drei Glasdeckgläser wurden wie in Figur 4 beschrieben, und die obigen Ergebnisse zeigen, dass 12 Tage nach 10 Gy Bestrahlung, 8 bis 10 Prozent der bestrahlten tabellarisch erzielte Endothelzellen wurde Klebstoff. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; Prozentsatz der Klebstoff Endothelzellen </td></tr><tr><td></td><td> Disc 1 </td><td> Disc 2 </td><td> Disc 3 </td></tr><tr><td> Feld 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> Feld 2 </td><td> 10,44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> Feld 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> Feld 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> Feld 5 </td><td> 10,55 </td><td> 9.4 </td><td> 11,61 </td></tr><tr><td> Durchschnitt </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Adhesion Assay Partituren. Adhesive Endothelzellen in fünf verschiedenen Standorten auf drei Deckgläser wurden wie in F beschrieben hatBBILDUNG 4 und die obigen Ergebnisse zeigen, dass 12 Tage nach 10 Gy Bestrahlung, 8 bis 10 Prozent der bestrahlten Endothelzellen wurde Klebstoff tabelliert.

Wir berichten über eine in vitro Methode, die die Quantifizierung der tatsächlichen Anzahl von Adhäsionszellen innerhalb einer Endothelzell-Monoschicht ermöglicht.

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit<em&gt; In-vitro-</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Adhäsivität von Endothelzellen in vitro zu quantifizieren. Dazu werden zunächst Fibronectin-beschichtete Deckgläser in einer 24-Loch-Platte vorbereitet. Anschließend werden humane koronare endotheliale Zellen auf die Deckgläser aufgebracht und inkubiert, bis sich eine konfluente endotheliale Zellschicht gebildet hat.Nach der Applikation der gewünschten Behandlung auf die endothelialen Zellen werden fluoreszenzmarkierte Monozyten zu den Objektträgern hinzugefügt und mit der endothelialen Zellschicht inkubiert. Im letzten Schritt werden nicht gebundene Monozyten durch ein sorgfältiges Eintauch- und Waschverfahren der Deckgläser von der endothelialen Zellschicht entfernt. Letztendlich ermöglicht diese Methode die Quantifizierung des Prozentsatzes einer endothelialen Zellpopulation, die nach einer bestimmten Behandlung adhesive ist.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die tatsächliche Anzahl oder den Prozentsatz adhäsiver endothelialer Zellen misst, im Gegensatz zur Gesamtadhäsivität einer endothelialen Monoschicht, wie sie von allen gängigen Methoden erfasst wird. Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir versuchten, die ADIs endothelialer Zellen mithilfe der derzeit verfügbaren Methoden zu messen, und dabei auf unannehmbar große Schwankungen in den Ergebnissen stießen, die auf technische Schwierigkeiten dieser Methoden zurückzuführen waren. Sterilisieren Sie 12 mm Durchmesser große runde Glasobjektträger, indem Sie sie mindestens 10 Minuten in 70 % Ethanol einweichen und gelegentlich schütteln, um eine vollständige Benetzung aller Objektträger mit Ethanol sicherzustellen.Danach alle Glasdeckgläser und Ethanol mit einem sterilen feinen Fünf-B-Präzisionspinzette in eine sterile Zellkulturschale geben. Jedes einzelne Glasdeckglas aufnehmen und in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte legen. Darauf achten, dass die Deckgläser die Wände der Vertiefungen nicht berühren und sich ungefähr in der Mitte der Vertiefung befinden. Die unbedeckte 24-Loch-Platte mit den Glasdeckgläsern zum Trocknen im Flusswerk stehen lassen.Das dauert etwa 10 Minuten. Wenn die Deckgläser trocken sind, pipettieren Sie 100 µL der Beschichtungslösung auf jedes Glas-Deckglas, sodass die Lösung nur das Glas bedeckt und sich nicht außen herum am Brunnen verteilt. Stellen Sie die belegte 24-Loch-Platte in einen Zellkultur-Inkubator für mindestens eine Stunde.Kultivieren Sie humane koronare Endothelzellen in Medium bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Aspirieren Sie das Kulturmedium ab und waschen Sie den Endothelzellen-Monolayer mit 10 Milliliter Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) ab. Aspirieren Sie danach die HBSS ab und geben Sie 2 Milliliter einer 0,5 %igen Trypsin-Lösung in 0,2 %iger EDTA-Lösung hinzu. Inkubieren Sie das Gefäß bei Raumtemperatur für etwa fünf Minuten, bis sich die Endothelzellen durch leichtes Anschlagen des Kolbens lösen. Geben Sie dann 5 Milliliter Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor zu, indem Sie die Innenfläche des Kolbens benetzen. Um die Zellen vollständig zu lösen, überführen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie dieses bei 200 × g für fünf Minuten. Aspirieren Sie danach den Überstand ab und resuspendieren Sie das Endothelzell-Pellet in 5 Milliliter frischem Medium.Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und stellen Sie die Zellkonzentration auf 50.000 endotheliale Zellen pro Milliliter Medium ein. Geben Sie je ein Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung der 24-Loch-Platte mit beschichteten Glasdeckplättchen und inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Die Zellen sind nun bereit für die gewünschte Behandlung.Wenn sich innerhalb von drei Tagen eine konfluente Zellschicht gebildet hat, überführen Sie HL-60-Zellen, die in RPMI mit 10 % Fötales Kalbserum kultiviert wurden, in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren die Zellen fünf Minuten lang bei 200 × g. Anschließend entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in fünf Milliliter Medium ohne Serum zur Fluoreszenzmarkierung der HL-60-Zellen. Zählen Sie die Zellen und überführen Sie die entsprechende Zellmenge in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 × g für fünf Minuten. Nach dem Entfernen des Überstandes resuspendieren Sie das Zellpellet in Cell Tracker in unserem PMI-Medium ohne Serum. Bei einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang im Zellkultur-Inkubator. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen erneut bei 200 × g für fünf Minuten und verwerfen den Überstand Reese.Suspendieren Sie die Zellprobe in Medium auf eine Konzentration von zwei Millionen Zellen pro Milliliter. Geben Sie ein Milliliter der mit Zelltracern markierten HL-60-Zellsuspension in jede Vertiefung der 24-Loch-Platte, die die Endothelzellschicht enthält, und inkubieren Sie die Platte in einem Zellkulturschrank bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für einen gewählten festen Zeitraum zwischen einer und drei Stunden. Verwenden Sie ein Paar feiner Fünf-B-Zangen, um die Glasdeckenscheibe aus der Vertiefung aufzuheben, wobei nur der äußere Rand der Deckenscheibe angefasst wird, und tupfen Sie den Rand der Deckenscheibe ab.Ziehen Sie ein Stück Gewebe für drei Sekunden über die Arbeitsfläche. Achten Sie dabei darauf, die mit Zellen bedeckte Oberfläche des Deckgläschens nicht mit dem Gewebe zu berühren, und halten Sie das Deckglas fest mit einer Pinzette. Tauchen Sie das Deckglas nach dem fünften Eintauchen fünfmal nacheinander in und aus dem HBSS. HBSS, tupfen Sie den Rand der Deckglas ab. Legen Sie das Gewebe für drei Sekunden auf. Wiederholen Sie das Eintauchen und Abtupfen insgesamt dreimal, jeweils fünf Eintauchvorgänge gefolgt von einem Abtupfen.Überführen Sie dann den Deckel in eine Mulde mit Tencent-Formulierung, um die Zellen bei Raumtemperatur zu fixieren. Der Farb-Deckel ist nun zur Zählung bereit, kann für die Langzeitlagerung aufbewahrt werden oder einer Gegenfärbung für Antikörper oder die mit Zellalterung assoziierte Beta-Galaktosidase-Aktivität gemäß dem schriftlichen Protokoll unterzogen werden, um adhärente endotheliale Zellen zu zählen. Bringen Sie die Deckel auf Objektträgern mit DPI-Gegenfärbung an, um einzelne Zellen mithilfe eines invertierten Mikroskops mit einem 4x- oder 10x-Objektiv zu identifizieren. Nehmen Sie Bilder mehrerer Felder auf und ermitteln Sie die höchste Anzahl an Monozyten, die sich an nicht bestrahlten endothelialen Zellen ansammeln.Legen Sie bei Bedarf das Doppelte dieser Zahl als Schwellenwert für Monozyten auf einer endothelialen Zelle fest, um einen Cluster zu definieren. Abhängig von der Art des Experiments kann ein anderes Kriterium zur Definition eines Clusters verwendet werden. Zählen Sie die Anzahl der Cluster sowie die Anzahl der endothelialen Zellen im Beobachtungsfeld. Teilen Sie die Form durch Letzteres, um den Prozentsatz adhäsiver endothelialer Zellen zu erhalten. Bewerten Sie mehrere Felder, um einen Durchschnittswert und die Standardabweichung der Zählungen zu ermitteln. Endotheliale Zellschichten sieben Tage nach Graustrahlung vor der Inkubation mit Monozyten wurden von Monozyten in Clustern um einzelne endotheliale Zellen gebunden.Obwohl dieses Phänomen im Phasenkontrast leicht beobachtbar ist, zeigt die Fluoreszenzmikroskopie ein noch deutlicheres Bild der Monozytencluster. Nach Durchführung des beschriebenen ADI-Assays kann man mit der Färbung der Zellen für membranständige, zytoplasmatische oder nukleäre Proteine unter Verwendung geeigneter Antikörper fortfahren. Bei standardmäßigen Immunfluoreszenzmethoden ist Vorsicht bei den Waschschritten geboten, da übermäßiger Druck die Monozyten lösen kann.Außerdem können enzymbasierte Assays wie der seneszenzassoziierte β-Galaktosidase-Assay durchgeführt werden. Dadurch färben sich die Lysosomen seneszenter Zellen blau, wie an der Endothelzelle ersichtlich ist, die selektiv von zahlreichen Monozyten besiedelt wird, die aufgrund ihrer geringen Größe und kugeligen Form identifiziert werden. Da jedem Monozyten-Cluster eine einzelne Endothelzelle entspricht, ermöglicht die Zählung der Cluster die Ermittlung der tatsächlichen Anzahl adhäsiver Endothelzellen innerhalb der Einschicht und damit den Prozentsatz adhäsiver Endothelzellen in der Population.Bislang ist dies die einzige Methode, die bei Bedarf eine Quantifizierung der Adhäsivität von Endothelzellen ermöglicht. An Endothelmonolagen angeheftete Monozyten können mit einer Trypsin-EDTA-Lösung abgelöst werden, und die Fluoreszenz kann anschließend mit einem Plattenreader gemessen werden, wie es bei aktuellen Methoden üblich ist. Nach Beherrschung der Technik kann sie innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden und erfordert nur sehr wenig manuelle Arbeitszeit. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass alle Wasch- und Tauchschritte bei allen Proben in identischer Weise und mit derselben Anzahl von Wiederholungen durchgeführt werden müssen, wenn man diesem Protokoll folgt.Andere Methoden wie Immunfluoreszenz und mit Seneszenz assoziierte Beta-Galaktosid-Assays können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, welche Eigenschaften adhesive Endothelzellen im Vergleich zu nicht-adhesiven aufweisen.

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Research

Forschung

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Biology

Biologie

Dieses Protokoll ist eine einfache bakterielle Adhäsion Assay aus der Zählung die Zahl der bakteriellen Kolonie bildende Einheiten, die auf kultivierten Zellen eingehalten werden. Der Test ist robust, studierte unabhängig von der Adhäsin und zahlreiche Variationen sind in den meisten Labors arbeiten bakterielle Pathogenese.

In-vitro-Assay der bakteriellen Adhäsion auf Mammalian Epithelzellen

Eine Haftung Frequenz-Assay zur Messung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung Kinetik, wenn beide Moleküle auf der Oberfläche der interagierenden Zellen verankert sind beschrieben. Diese mechanisch-basierter Assay wird beispielhaft mit einer Mikropipette unter Druck menschlichen roten Blutkörperchen als Haftvermittler Sensor und Integrin αLβ2 und ICAM-1 als interagierende Rezeptoren und Liganden.

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

In diesem Video demonstrieren wir einen Assay, der Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Adhäsion von Krebszellen an neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) nachzuweisen. In den Testvertiefungen gibt es einen bemerkenswerten Anstieg der Anzahl fluoreszenzmarkierter Krebszellen, die an NETs haften, während Wells, die mit DNase behandelt wurden, eine verminderte Adhäsion von Krebszellen an NETs aufweisen.

In-vitro-Adhäsionsassay zum Nachweis der Adhärenz von Krebszellen an extrazellulären Fallen von Neutrophilen

Neutrophile Einhaltung der aktivierten Endothel an den Standorten der Infektion ist ein integraler Bestandteil des Gastgebers Entzündungsreaktion. Beschrieben in diesem Bericht ist ein neutrophilen Bindungs-Assay, die für das...

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

Leukozyten-Rekrutierung in die Leber tritt innerhalb der spezialisierten Kanäle der Lebersinuskurven, die durch einzigartige hepatischen sinusoidalen Endothelzellen ausgekleidet sind. Phasenkontrast-Mikroskopie von Leukozyten-Rekrutierung über menschliche Lebersinus Endothel unter physiologischen Bedingungen der Schubspannung kann die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die diesen Prozess zugrunde liegen, zu erleichtern.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Verfahren zum Quantifizieren von Adhäsion von Neutrophilen berichtet. Dieses Verfahren erzeugt eine dynamische Fließumgebung ähnlich der in einem Blutgefäß auftreten. Es erlaubt die Untersuchung der Adhäsion von Neutrophilen an entweder gereinigte Adhäsionsmoleküle (Ligand) oder Endothelzell-Substrat (HUVEC) in einem Rahmen ähnlich der in vivo Umgebung mit Scherbeanspruchung.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um kontinuierlich zu quantifizieren Zelladhäsion und de-Klebeprozesse mit hoher zeitlicher Auflösung in eine nicht-invasive Weise durch Zell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging analysiert. Diese Ansätze zeigen die Dynamik der Zelladhäsion / de-Klebeverfahren durch Matrixmodifikation und ihre zeitliche Beziehung, um die Haftung abhängige Signalereignisse ausgelöst.

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Dieser Strömungs Adhäsionsassay stellt eine einfache, hochschlag Modell von T-Zell-epithelialen Zell-Wechselwirkungen. Eine Spritzenpumpe wird verwendet, Scherspannung zu erzeugen, und die konfokale Mikroskopie erfasst Bilder für die Quantifizierung. Das Ziel dieser Studien ist es, um effektiv T Zelladhäsion quantifizieren Strömungsbedingungen.

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Gefäßendothels steuert dicht Leukozyten Rekrutierung. Unzureichende Leukozyte Extravasation trägt zur entzündlichen Krankheiten des Menschen. Daher ist es notwendig, bessere Therapien für entzündliche Erkrankungen zu entwerfen, auf der Suche nach neuartigen regulatorischen Elemente der endotheliale Aktivierung. Hier beschreiben wir eine umfassende Methodik um neuartige endotheliale Regulatoren zu charakterisieren, die Leukozyten während einer Entzündung des Menschenhandels ändern können.

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In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, die erweiterte Endothelzellkulturmethode (EECM), die die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu mikrovaskulären Endothelzellen (BMEC)-ähnlichen Zellen des Gehirns ermöglicht. Diese Zellen zeigen die Expression von Endothelzelladhäsionsmolekülen und sind somit ein humanes Blut-Hirn-Schrankenmodell, das geeignet ist, Immunzellinteraktionen in vitro zu untersuchen.

Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen zu mikrovaskulären Endothelzellzellen des Gehirns mit einem reifen Immunphänotyp

Lernen Sie eine zuverlässige In-vitro-Methode zur Quantifizierung der Endothelialzell-Haftfähigkeit mit fibronektinbeschichteten Deckgläsern. Diese Technik ermöglicht präzise Messungen für die vaskuläre Biologieforschung.

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit

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