Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Auswertung digitaler Tropfenanalysen mithilfe eines herkömmlichen Echtzeit-PCR-Geräts zu vereinfachen, indem die Gesamtfluoreszenz der Analyse gemessen wird. Dies wird erreicht, indem zunächst Amplifikationsreaktionen der interessierenden Proben und zweier Standardproben vorbereitet und Tropfen erzeugt werden, um jede Probe in Tausende von nanolitergroßen Reaktoren zu partitionieren. Der zweite Schritt besteht darin, die Tropfen zu inkubieren, um die Nukleinsäuren innerhalb jedes Tropfens zu amplifizieren.

Anschließend wird die Gesamtfluoreszenz jeder Probe oder jedes Standards mit einem herkömmlichen QPC oder Thermocycler gemessen. Im letzten Schritt erfolgt die Vorhersage des Anteils fluoreszierender Tröpfchen in den Proben von Interesse mithilfe einer Standardkurve, die aus den Standardproben generiert wurde. Um die Leistungsfähigkeit dieser Methode zu überprüfen, kann die fluoreszenzmikroskopische Analyse eingesetzt werden, um die Quantifizierungsleistung des Gesamtfluoreszenz-Assays unabhängig zu bewerten.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Tröpfchenzählung besteht darin, dass keine spezielle Messapparatur erforderlich ist, bevor mit diesem Reparatur-Assay begonnen wird. Alle notwendigen Reagenzien, wie im Protokolltext beschrieben, sowie zwei Standards sind erforderlich. Ein No-Template-Kontrollansatz, beispielsweise nukleasefreies Wasser, und eine hohe Template-Konzentration, beispielsweise Lambda-DNA. Denaturieren Sie jeweils 3,3 Mikroliter jedes Standards mit 3,3 Mikrolitern Denaturierungspuffer in einem A-Q-P-C-R-Röhrchen.

Ansatz bei Raumtemperatur drei Minuten lang inkubieren. Jeden Ansatz mit 3,3 µL Neutralisierungspuffer abklingen lassen. Ebenso 3,3 µL der gewünschten Vorlage mit 3,3 µL Denaturierungspuffer denaturieren, der drei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurde.

Mit 3,3 µL Neutralisierungspuffer abbrechen. Für weniger oder falsch positive Ergebnisse 11 µL Master-Mix pro Probe herstellen. Den Master-Mix vor der Bildung von Tröpfchen UV-Licht aussetzen.

Bereiten Sie zunächst 10 Mikroliter der Vormischung pro Probe in einem klaren 0,5-Milliliter- oder 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis vor. Die Vormischung besteht aus randomisierten Oligos, B-S-A-D-N-A-Polymerase-Reaktionspuffer, dn, NTPs und nukleasefreiem Wasser. Stellen Sie das Röhrchen auf Eis in Wasser und setzen Sie es nach der UV-Bestrahlung UV-Licht aus.

Fügen Sie A-D-S-D-N-A-Bindungsfarbstoff und Referenznahrung zum Premixgemisch hinzu. Fügen Sie zuletzt PHI 29-DNA-Polymerase hinzu, um sicherzustellen, dass die Polymerase keinen pH-Werten deutlich über oder unter 7,5 ausgesetzt wird. Mischen Sie gut. Kombinieren Sie 10 Mikroliter des denaturierten Templates oder Standards mit 10 Mikrolitern der Mastermischung und mischen Sie gründlich.

Da Tröpfchen sehr empfindlich gegenüber statischer Elektrizität und Scherkräften sein können, sollte der Experimentator Kleidung entfernen, die statische Elektrizität verursachen könnte, und sich vor dem Bilden der Tröpfchen erden. Die für diese Demonstration verwendete mikrofluidische Vorrichtung wurde intern hergestellt und verfügt über einen Öleinlass und zwei wässrige Einlässe mit einer Flussfokussierungsstelle zur Erzeugung von Tröpfchen. Verwenden Sie zwei Spritzenpumpen, um die Durchflussraten von 55 µL Öl mit Tensid und 20 µL Reaktionsgemisch durch den mikrofluidischen Chip zu steuern.

Um 20.001 Nanoliter große Tröpfchen zu erzeugen, ist einer der schwierigsten Schritte das Sammeln der Tröpfchen, ohne die Emulsion zu stören. Es ist wichtig, langsam zu pipettieren und vorzugsweise eine Weitmundpipettenspitze zu verwenden.

Sammeln Sie alle Tröpfchen für jede Probe in PCR-Röhrchen. Portionieren Sie 30 Mikroliter Öl mit einer Weitbohrpipettenspitze und sehr langsamen Pipettierschritten in frische PCR-Röhrchen mit optischen Deckeln. Übertragen Sie 20 Mikroliter Tröpfchen auf das Öl.

Die konstanten Volumina gewährleisten eine möglichst hohe Genauigkeit des Assays. Schließen Sie die Röhrchenverschlüsse fest, da lose Verschlüsse die Verdunstung des Öls ermöglichen. Handhaben Sie die Röhrchen mit Emulsion stets am oberen Ende, also so weit wie möglich von der Emulsion entfernt. Für die isothermale Amplifikation kann ein PCR-Thermocycler, ein A-Q-P-C-R-Thermocycler oder eine Heizplatte verwendet werden.

Ein A-Q-P-C-R-Thermocycler wird in dieser Demonstration verwendet. Inkubieren Sie die Proben sieben Stunden lang bei 30 Grad Celsius und inaktivieren Sie sie eine Minute lang bei 75 Grad Celsius. Unmittelbar nach der Reaktion und Aktivierung.

Messen Sie die Fluoreszenzniveaus aller Proben mithilfe des QPCR-Thermocyclers. Teilen Sie für jede Probe die Fluoreszenzintensität des DS-DNA-Bindungsfarbstoffs durch die Fluoreszenzintensität des Referenzfarbstoffs.

Ziehen Sie die Hintergrundfluoreszenz oder die normalisierte Fluoreszenz der No-Template-Kontrolle von allen Proben ab. Erstellen Sie eine lineare Standardkurve unter Verwendung der korrigierten Fluoreszenzmesswerte der Standards. Die No-Template-Kontrollprobe repräsentiert die Fluoreszenz für eine Probe mit 0 % fluoreszierenden Tröpfchen und der hohen Templatekonzentration.

Die Fluoreszenzmessung entspricht der erwarteten Fluoreszenz einer Probe mit 100 % fluoreszierenden Tröpfchen unter Verwendung der entsprechenden Standardkurve. Prognostizieren Sie die intermediären Verhältnisse positiver und negativer Tröpfchen basierend auf deren Gesamtfluoreszenz. Diese Methode verwendet ein konventionelles Echtzeit-PCR-Gerät, um die Gesamtfluoreszenz von tröpfchenbasierten digitalen Assays zu messen.

Fluoreszierende und nicht fluoreszierende Tröpfchen wurden in verschiedenen Verhältnissen vorgemischt, und ein Vergleich zwischen der Gesamtfluoreszenz und dem Anteil positiver Tröpfchen durchgeführt. Wie erwartet skalierten die Gesamtfluoreszenz und die Anzahl der positiven Tröpfchen linear mit dem eingegebenen Anteil fluoreszierender Tröpfchen. Die auf Standards basierenden vorhergesagten Verhältnisse wurden mit den erwarteten Eingabefraktionen fluoreszierender Tröpfchen verglichen.

Die Linie zeigt den erwarteten Wert bei einer linearen Beziehung an. Die Ergebnisse zeigen eine gute Leistung bei der Quantifizierung des Tröpfchenverhältnisses über zwei Größenordnungen des dynamischen Bereichs. Um diese Methode in einem realen quantitativen Whole-Genome-Amplifikations-Assay zu testen, wurden Fluoreszenzintensitäten und Anteile positiver Tröpfchen eines digitalen Tröpfchens untersucht.

Es wurden MDA-Assays mit steigenden Konzentrationen der Matrize Lambda-DNA gemessen. Die Linie zeigt den erwarteten fluoreszierenden Anteil an, wobei die Poisson-Verteilung zur Modellierung der experimentellen Daten verwendet wurde. Repräsentative fluoreszierende Bilder der Tropfen werden gezeigt; sowohl die Gesamtfluoreszenz als auch der Anteil an positiven Tropfen aus den digitalen MDA-Proben skaliert wie erwartet mit der durchschnittlichen Matrizenmenge pro Tropfen, was darauf hinweist, dass die Gesamtmessung das Ergebnis eines digitalen Assays zuverlässig wiedergeben kann.

Diese Methode kann andere digitale Assays wie die digitale PCR unterstützen, indem sie die Parallelisierung beschleunigt und die Auswertung des Assays vereinfacht.