Name: Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Lernen Sie die vereinfachte Massenfluoreszenz-Messung digitaler Tropfenassays mit einem Standard-qPCR-Gerät. Diese Methode ermöglicht die Nukleinsäure-Quantifizierung ohne spezialisierte Instrumente.

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Die Autoren danken Liyi Xu für die Bereitstellung von MDA-Reagenzien und -Protokollen. Wir danken auch David Feldman und Navpreet Ranu für die Diskussionen im Zusammenhang mit dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Burroughs Wellcome Career Award im Rahmen der Scientific Interface to PCB unterstützt.

Anmerkung: Die Herstellung von Mikrofluid-Vorrichtung ist nicht notwendig, diesen Assay als Tröpfchen für dieses Protokoll mit vorhandenen kommerziellen Tropfenträgern 23,29 gebildet werden. 1. Stellen Sie die Tröpfchenbildungs ​​Mikrofluidikvorrichtung <ol><li> Vorbereitung Vorlagenform für die Kanäle mit der SU-8 Master Fabrication Protokoll dargelegt zuvor 31, aber mit einem Tröpfchengenerator Maskenmuster 32. </li><li> Fertigen Geräte in PDMS mit den Techniken der Softlithographie 32,33. </li></ol> 2. Bereiten Sie Reaction Mix für Schütt Droplet Anzeige Hinweis: Das Protokoll kann verwendet werden, um Nukleinsäuren unter Verwendung vieler Arten von Amplifikationsreaktionen zu quantifizieren. Als Beispiel werden die Reagenzien für MDA benötigt mehrerer Lambda DNA-Konzentrationen angegeben. Reagenz Einzelheiten sind in der Tabelle mit den spezifischen Reagenzien aufgeführt. Die Verteilung der Vorlage in den Tröpfchen hängt sufficient Mischen der Probe. <ol><li> Zu erhalten oder zu reinigen Phi29 DNA-Polymerase. <ol><li> Reinige Phi29 wie zuvor beschrieben 7 oder Kauf von Lieferanten. Die für die gezeigten Experimente verwendet Phi29 gereinigt. </li></ol></li><li> Herstellung von 10 ml Denaturierungspuffer aus 65 mM KOH, 1,65 mM EDTA und 14 mM DTT. </li><li> Herstellung von 10 ml Neutralisierungspuffer aus 65 mM HCl, 0,21 M Tris-Cl pH 7,0, und 9 mM Tris-Cl pH 8,0. </li><li> Bereiten Sie zwei Standards, einen Leerwert-Kontrolle (NTC), wie Nuklease-freies Wasser, und eine High-Vorlage Konzentration (ungefähr 4 pg / ul Lambda DNA). Denaturieren 3,3 ul jeder Standard mit 3,3 ul Denaturierungspuffer in einem qPCR Rohr. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. Quench mit jeweils 3,3 ul Neutralization Buffer. </li><li> Denaturieren 3,3 ul der Vorlage von Interesse mit 3,3 ul Denaturierungspuffer in einem qPCR Rohr. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. Es wird mit 3,3 &amp; mgr;Neutralisierungspuffer. </li><li> Bereiten Sie 11 ul des Master-Gemisch pro Probe auf Eis. Die 2x MDA Reaktionsmastermischung besteht aus 2x Doppelstrang-DNA (dsDNA) bindenden Farbstoff, 2x qPCR Referenzfarbstoff, 50 uM randomisiert Oligo, 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA Polymerase Reaktionspuffer, 4,8 mM dNTPs, Nuklease-freies Wasser und 40 ug / ml Phi29 DNA-Polymerase. In Phi29 DNA-Polymerase, um den letzten Polymerase nicht begegnen pH-Werte viel höher oder niedriger als 7.5.Mix auch zu gewährleisten. </li><li> Optional: Für weniger False Positives, aussetzen Master-Mix mit UV-Licht vor der Bildung von Tröpfchen 34. <ol><li> Bereiten Sie 10 ul der Vormischung pro Probe in einem 0,5 ml oder 1,5 ml klare Röhrchen auf Eis. Die Vormischung besteht aus 55 &amp; mgr; M randomisiert Oligo, 2,2 mg / ml BSA, 1.1x Phi29 DNA Polymerase Reaktionspuffer, 5,3 mM dNTPs und Nuklease-freies Wasser. </li><li> Das Röhrchen wird in Wasser auf Eis, wie beschrieben, 34 und setzen mit UV-Licht (254 nm) mit einem Akku-sammelten Dosis von 5,7 J / cm 2. </li><li> Hinzufügen dsDNA-bindenden Farbstoff auf 1x, Referenzfarbstoff auf 1x und Phi29 bis 40 &amp; mgr; g / ml in der Vormischung. Gut mischen. </li></ol></li><li> Kombinieren Sie 10 ul der denaturierten Vorlage oder Standard und 10 ul Stammmischung. Gut mischen. </li></ol> 3. Tropfenbildung Hinweis: Tröpfchen kann sehr empfindlich auf statische Elektrizität und die Scherspannung zu sein. Kleidung, die statische Elektrizität verursachen können, zu entfernen, und erden Sie sich vor der Bildung von Tröpfchen. Griffrohre der Emulsion aus dem oberen Ende der Röhre so weit aus der Emulsion wie möglich. Pipetten-Emulsionen sehr langsam, vorzugsweise mit einer großen Bohrung Pipettenspitze. Bei der Abgabe von einem Pipettenspitze, beobachten Sie die Emulsion auf der Seite der Spitze, um Pipettiergeschwindigkeit bestimmen. <ol><li> Form Tröpfchen. Für die Experimente gezeigt, hat der Mikrofluidvorrichtung einen Öleinlass und zwei wässrige Einlässe mit einem Fluss-Fokussierung Übergang zur Erzeugung von Tröpfchen. Verwenden Sie zwei syringe Pumpen, um die Durchflussmengen von 55 ul Öl mit Tensid und einem 20 ul Reaktionsgemisch durch den mikrofluidischen Chip steuern zu 20.000 1 nl Tröpfchen zu erzeugen. </li><li> Anmerkung: Es ist möglich, Tröpfchen mit vielen Arten von Öl mit Tensid zu erzeugen, aber die Zusammensetzung wird Tröpfchenstabilität stark beeinflussen bei hohen Temperaturen und über die Zeit. Eine mögliche Kombination ist fluoriertes Öl HFE 7500 mit einem anionischen Tensid 19,35. </li><li> Erzeugen Tröpfchen in jeder Größe mit einem beliebigen Verfahren 13,36, sondern die Formatvariabilität der Tröpfchenpopulation wird den Groß Fluoreszenz und somit die Genauigkeit des Tests beeinträchtigen. Für die gezeigten Experimente waren monodisperse Tröpfchen mit einem Volumen von 1 nl. </li><li> Sammeln Sie alle der Tröpfchen und Öl in PCR-Röhrchen. Für jede Probe wurden 30 ul Aliquots von Öl in frischen PCR-Röhrchen mit Optokappen und übertragen 20 ul von Tropfen auf der Oberseite des Öl. Die konsistente Volumen sicherzustellen, der Assay als ackuratieren wie möglich. </li><li> Schließen Leitung Kopf fest, als lose Kappen wird das Öl zu verdampfen. </li></ol> 4. isothermen Amplifikation <ol><li> Unter Verwendung eines PCR-Thermocycler, qPCR Thermocycler oder Heizplatte, Inkubation der Proben bei 30 ° C für 7 h und inaktivieren für 1 min bei 75 ° C. Die Rohre der Tröpfchen können in einem Kühlschrank mit einer Folie für ein paar Stunden an dieser Stelle abgedeckt gelassen werden. </li></ol> 5. Datenerfassung und Auswertung <ol><li> Unmittelbar nach der Reaktion Inaktivierung, messen Farbstofffluoreszenz Ebenen für alle Proben mit der qPCR Thermocycler. Optimalen Filtereinstellungen werden auf die Farbstoff Anregungs- und Emissionsspektren ab. Für dieses Beispiel verwenden Sie die 492 nm-516 nm-Filter für die dsDNA-bindenden Farbstoff gesetzt und die 585 nm-610 nm-Filter für die Referenzfarbstoff eingestellt. Andere Fluoreszenzmesstechniken verwendet, um die Fluoreszenz zu quantifizieren. </li><li> Für jede Probe, die Trägerfluoreszenzintensität des dsDNA-bindenden Farbstoffdie Fluoreszenzintensität der Referenzfarbstoff. Subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenz, oder die normalisierte Fluoreszenz des Leerwert-Kontrolle, von allen Proben. </li><li> Erstellen Sie eine lineare Standardkurve unter Verwendung der korrigierten Fluoreszenzmessungen von den Standards. Der NTC-Standard ist der Fluoreszenz einer Probe mit 0% fluoreszierenden Tröpfchen (&quot;alle negativ&quot;) und die Hoch Matrizenkonzentration Fluoreszenzmessung ist die erwartete Fluoreszenz für eine Probe mit 100% Fluoreszenz Tröpfchen (&quot;alle positiv&quot;). Verwendung der entsprechenden Standardkurve vorherzusagen, die Zwischenverhältnisse der positiven und negativen Tröpfchen auf der Grundlage ihrer Groß Fluoreszenz. </li></ol> 6. Producing Droplets für Proof-of-Principle-Messungen <ol><li> Stellen Fluoreszenz (positiv) Tröpfchen: Vorbereiten eines PCR-Reaktionsgemisch, bestehend aus 0,1 ng Lambda-DNA, 1x dsDNA-bindenden Farbstoff, 1x Referenzfarbstoff, 1,5 Einheiten Taq DNA Polymerase, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,2 mM dNTP und 0,5 uM Primer. Thermozyklus der Mischung 30-mal (95 ° C für 20 sec, 55 ° C für 20 sec, 72 ° C für 1 min), dann bilden Tröpfchen wie oben beschrieben. </li><li> Stellen nicht-fluoreszierenden (negativ) Tröpfchen: Vorbereiten eines PCR-Reaktionsgemisch, bestehend aus 1x dsDNA-bindenden Farbstoff, 1x Referenzfarbstoff, 1,5 Einheiten Taq DNA Polymerase, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,2 mM dNTP, und 0,5 &amp; mgr; M Primer. Thermozyklus die Mischung 30-mal (95 ° C für 20 sec, 55 ° C für 20 sec, 72 ° C für 1 min), dann bilden Tröpfchen. </li><li> Bilden vorgemischten Tröpfchenverhältnisse <ol><li> Verteilen Sie 20 ul fluorierte Öl in qPCR Rohre, Deckel mit einem optischen Kappe, um Verdunstung zu verhindern. </li><li> Gently Pipette 10 ul der gut gemischten Tröpfchen in gewünschten Positiv: Negativ-Verhältnisse an der Spitze des Öls. In den gezeigten Ergebnissen, positiv: negativ waren Tröpfchenverhältnisse 1 (alle positiv), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 und 0 (alle negtive). </li></ol></li><li> Messen Farbstofffluoreszenz Ebenen für alle Proben mit der qPCR Thermocycler. Für dieses Protokoll, verwenden Sie die 492 nm-516 nm-Filter für die dsDNA-bindenden Farbstoff gesetzt und die 585 nm-610 nm-Filter für die Referenzfarbstoff eingestellt. <ol><li> Normalisieren dsDNA Bindungsfarbstofffluoreszenz unter Verwendung von Referenzfarbstofffluoreszenz. Weitere Normalisierung durch die Fluoreszenz des &quot;alle positiven&quot; Probe. </li></ol></li><li> Erstellen Sie eine lineare Standardkurve unter Verwendung der normierten Fluoreszenzmessungen von den &quot;alle positiv&quot; und &quot;aller negativen&quot; Proben. Verwendung der entsprechenden Standardkurve vorherzusagen, die Zwischenverhältnisse der positiven und negativen Tröpfchen auf der Grundlage ihrer Groß Fluoreszenz. </li><li> Das Experiment wiederholt für jedes Verhältnis (n = 3) mit unabhängigen Tröpfchenbildung und Mischen für jede Wiederholung. </li></ol> 7. Proof-of-Principle MDA Experiment <ol><li> Messen Sie die Konzentration von Lambda DNA-Stammlösung mit einer specphotometer. <ol><li> Berechnen Sie die Template-Konzentration notwendig, um durchschnittlich 10 Templatmoleküle pro Tröpfchen. Aus diesem Protokoll annehmen Tropfenvolumen sind 1 nl und 1 ng des Lambda-DNA enthält etwa 1,9 × 10 7 Kopien. Daher werden 10 Vorlagen pro Tröpfchen 10 Kopien pro nl oder 526 fg Lambda DNA pro ul sein. Die Vorlage wird verdünnt werden ~ 6x, wenn Tröpfchen gebildet werden, damit die ursprüngliche Vorlage höchsten Konzentration 3,2 pg / ul sein. </li></ol></li><li> Seriell verdünnt das Lambda DNA auf 3,2 pg / ul mit Denaturierungspuffer und gleichen Volumen Neutralization Buffer. Für einen Verdünnungsfaktor von 0,1, zu kombinieren 10 ul Probe mit 45 ul Denaturierungspuffer und Inkubation bei Raumtemperatur für 3 min. In 45 lL Neutralisierungspuffer zu stillen. </li><li> Weiteren Verdünnung der Probe wie in Schritt 7.2 beschrieben, um den Rest der Proben für den Versuch zu machen. Die anfänglichen Vorlage Konzentrationen in den Reaktionen gezeigt, waren 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3,2 fg und fg 1,6 pro Mikroliter. Hinweis: Die endgültige Vorlage Konzentrationen nach Mastermix Zusätzlich waren 526 fg, 52,6 fg, 26,3 fg, 5,26 fg, 2,63 fg, 526 ag und 263 ag pro Mikroliter. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 und 0,005 erwarteten Lambda Kopien pro Tröpfchen auf. </li><li> Generierung und Analyse Tröpfchen aus jeder Probe wie in Schritten von 2,5 bis 5,3 beschrieben. </li><li> Erwerben Sie die gezeigten Fluoreszenzbilder (Abbildung 2,3) mit einer Digitalkamera montiert auf eine Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop mit einer 10-fach Objektiv bei RT. Erwerben zwölf Sichtfelder für jede Probe. Correct Fluoreszenzbilder durch ein Hintergrundbild mit einer Leuchtstoffschieber erhalten. </li><li> Verwenden Sie einen enthaltenen Kammer zur Abbildung 37, wie die Emulsion Öl wird schnell verdunsten. </li><li> Analysieren Sie einzelne Tröpfchen Intensitäten unter Verwendung eines ImageJ Makro (Supplemental Code-Datei). <ol><li> Wählen Sie einen Schwellenwert Fluoreszenzintensität, die am besten trennt nicht fluoreszierenden Tröpfchen in der NTC-Bilder von den fluoreszierenden Tröpfchen in den Hoch Matrizenkonzentration Bilder. Für jede unbekannte Probe, die Berechnung der Bruchteil der Tropfen mit einem Fluoreszenz-Intensität oberhalb der Schwelle. </li></ol></li></ol> 8. PCR und MDA Groß Reaktionen <ol><li> Bereiten PCR-Reaktion. <ol><li> Seriell verdünnt Matrizen-DNA mit einem Verdünnungsfaktor von 0,1. Für jede Verdünnung, zu kombinieren 10 ul-Vorlage mit 45 &amp; mgr; l Denaturierungspuffer und Inkubation bei Raumtemperatur für 3 min. Kombinieren Sie die Verdünnung mit 45 &amp; mgr; l Neutralization Buffer. </li><li> Es werden 20 &amp; mgr; l PCR-Mastermix pro Probe. Die PCR-Reaktion 1,1x Stammischung besteht aus 60 Einheiten / ul Taq DNA-Polymerase, 11 mM Tris-HCl, 55 mM KCl, 1,65 mM MgCl 2, 0,22 mM dNTP, 1,1 x dsDNA-bindenden Farbstoff, 1,1x Referenzfarbstoff und 550 nM jeder Primer. </li><li> Kombinieren Sie 2 ul verdünnt Vorlage und 20 ul Mastermix. Hinweis: Die endgültige Vorlage Konzentrationen in ter Reaktionen gezeigt PCR waren 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, 500 ag und 0 g Lambda-DNA pro Mikroliter und wurden dreifach durchgeführt. </li><li> Thermozyklus PCR-Reaktion in qPCR-Maschine mit dem folgenden Programm. Laufen 40 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 57 ° C für 20 sec, 72 ° C für 30 s, bevor 2 min bei 72 ° C für 2 Minuten und Halten bei 4 ° C. </li><li> Normalisieren dsDNA Bindungsfarbstofffluoreszenz unter Verwendung von Referenzfarbstofffluoreszenz vor der weiteren Analyse. </li></ol></li><li> Bereiten MDA Reaktion. <ol><li> Verdünnte Proben wie in Schritt 8.1.1 beschrieben. </li><li> Bereiten Sie 11 ul des Master-Gemisch pro Probe auf Eis. Die 2x MDA Reaktionsmastermischung besteht aus 2x dsDNA-bindenden Farbstoff, 2x Referenzfarbstoff, 50 uM randomisiert Oligo, 2 mg / ml BSA, 2x phi29 DNA Polymerase Reaktionspuffer, 4,8 mM dNTPs, Nuklease-freies Wasser, und 40 ug / ml phi29 DNA-Polymerase. </li><li> Fügen Sie den Phi29 DNA-Polymerase, um 40 ug / ml reicht, um die Polymerase d sicherzustellen,oes nicht begegnen pH-Werte viel höher oder niedriger als 7,5. Gut mischen. </li><li> Denaturieren 3,3 &amp; mgr; l verdünnt Vorlage mit 3,3 ul Denaturierungspuffer in einem qPCR Rohr. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. 3.3 ul Neutralization Buffer. </li><li> Mähdrescher 10 ul der denaturierten Template und 10 ul der Stammmischung. Gut mischen. </li><li> Führen MDA Reaktion in qPCR-Maschine mit dem folgenden Programm. </li><li> Halten bei 30 ° C für 4 Stunden, messen Fluoreszenz jedes 7,5 min. </li><li> Inaktivierung bei 75 ° C für 1 min. </li><li> Normalisieren dsDNA Bindungsfarbstofffluoreszenz unter Verwendung von Referenzfarbstofffluoreszenz. Weiter normalisiert durch die maximale Fluoreszenz für jede Probe. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Das Broad Institute kann eine Patentanmeldung einreichen, die Aspekte dieser Arbeit umfasst.

Digital Assays sind leistungsfähige Methoden, die den Nachweis von seltenen Zellen und Zählen der einzelnen Nukleinsäuremoleküle zu ermöglichen. Jedoch digital Assays sind noch nicht routinemäßig in analytischen Labors zu den Kosten von Spezialausrüstung mit kommerziell verfügbaren Methoden verbunden angewendet, die teilweise. Hier beschreiben wir einen Endpunkt digitalen Assay zur Quantifizierung von Nukleinsäuren mit einer vereinfachten analogen Auslese Verwendung eines Standard quantitative Echtzeit-PCR-Maschine. Die...

Digitale Assays zur Nukleinsäurequantifizierung (digital PCR) 1-4 und Basis Ordnung (Sequenzierung) stark beeinflussen die Lebenswissenschaften und der Medizin. Digitale Assays stellen die Quantifizierung molekularer zählt auf einer absoluten Skala (nicht relativ zu einer Kontrolle) und bietet hohe Empfindlichkeit und ermöglicht einfache Vergleiche zwischen den Experimenten und entscheidend, so dass der Bau von großen Datenbanken mit vergleichbaren Daten 5 (Tabelle 1). Im Laufe der letzten 15 Jahre, Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) entstanden neben PCR als allgemeines Instrument für die Nukleinsäure-Amplifikation. Wie PCR ist WGA nützlich für analytische und präparative Anwendungen durch Verstärken Minute Probenelemente bis zu einer Höhe, die leicht nachgewiesen oder für spätere Analysen wie Basensequenzierung verwendet werden kann. Im Gegensatz zur PCR ist WGA nicht speziell auf eine bestimmte DNA-Locus, sondern ermöglicht Amplifikation aller Sequenzen in der Probe, einschließlich der unbekannten Sequenzen.Dieser fundamentale Unterschied zwischen der PCR und WGA macht die Verfahren zueinander komplementär und gibt Anlass zu verschiedenen Herausforderungen in ihrer Anwendung. Die hohe Ausbeute an WGA Reaktionen 6 ermöglicht Routine-Amplifikation von genomischer DNA aus einzelnen Molekülen 7. Einzelzellen 8 und andere niederBiomasseProben 9 für die Quantifizierung oder eine weitere Analyse. Die großen Herausforderungen mit WGA Chemie verbunden sind seine extreme Empfindlichkeit gegenüber Verunreinigungen und die ungleichmäßige Verstärkung über einzelne Templatmoleküle 6. Allerdings WGA ist an Popularität gewinnt als Single-Cell-Sequenzierung wurde als &quot;Killer-Applikation&quot; des WGA-Technologie 10 und Template-Quantifizierung durch WGA taucht ist in vielen Anwendungsbereichen 7 wichtig. Instrumentation für digitale Nukleinsäure Quantifizierung wurde zuvor in einer Vielzahl von mit Ventilen und ventillose mikrofluidischen forma beschriebents 11-14 einschließlich tröpfchenbasierten Assays 15,16 (Tabelle 2). , Kommerzielle mikrofluidische Systeme für die digitale Analyse erfordern jedoch Spezialausrüstung für die Reaktionsaufbau und Produkterkennung 17. Benutzerdefinierte Ventil versehenen Mikrofluidik sind flexibel, erfordern aber präzise Mikrofabrikation und pneumatischen Steuerungen 18. Während es relativ einfach ist, monodisperse Mikrotröpfchen zur Emulsionsbasis digitale Assays 19,20 zu machen, ist Digitalanzeige technisch aufwendig und erfordert entweder große Weitfeld-Bildgebung (ähnlich beliebten Next-Generation-Sequencing-Technologien) 21,22 oder High-Speed-Flow-basierte Tröpfchenerkennung 23-25. Im Idealfall, eine digitale Assay wäre einfach vom Set-up, um auszulesen, reduzieren die Notwendigkeit für komplexe Instrumentierung und so eine große Anzahl von Proben schnell ausgelesen werden. Hier beschreiben wir ein vereinfachtes Verfahren zum Auslesen von digitalen Tröpfchen Assays, die einen herkömmlichen Echtzeit-PCR verwendet instrument zur Groß Fluoreszenz der tröpfchenbasierten digitalen Assays messen. Für digitale WGA Assays für welche analoge Echtzeit-Amplifikationsassays (die ausgezeichnete Ergebnisse liefern für PCR) sind problematisch, besonders vorteilhaft, während der neue Ansatz kann auf digitale PCR-Assays angewendet werden, ist es. WGA gemeinhin Proben mit Templat-Molekülen, die unterschiedlich in Sequenz, Länge und Basengehalt angewandt. Diese unterschiedlichen Templat-Molekülen mit unterschiedlicher Geschwindigkeit 6 verstärkt, was die Verwendung einer Referenz (&quot;standard&quot;) Probe mit passenden Eigenschaften. Oft ist eine solche Standard verfügbar sind oder die Eigenschaften der eingehenden Proben unbekannt sind. Die Heterogenität des Eingangsmaterials und längenabhängigen Eigenschaft des WGA-Chemie 26 die Interpretation der Ergebnisse erschweren auch durch die Schaffung von Mehrdeutigkeit, was wird quantifiziert - die Eingangsmasse, Eingangs Anzahl der Moleküle, die eine Kombination der beiden, oder auch nicht. Fsprünglich, die nicht-sequenz Spezifität macht quantitative mehrere Displacement Amplification (MDA) mehr empfindlich gegenüber Verunreinigungen als quantitative PCR, da Schadstoffmoleküle einer beliebigen Sequenz haben ein Potential, sich einzumischen. Mikrofluidischen digitale Assays Adresse Kontamination durch Trennung Templatmoleküle und die Verringerung der Reaktionsvolumina, so dass weniger Schadstoffe abgetastet werden. Hier verwenden wir ein beliebtes isothermen WGA-Methode, MDA 27. Zu beachten ist, mehrere andere WGA Chemie einschließlich PicoPlex und MALBAC 28 hängen entscheidend von Anfangs isotherme Strangverdrängungsschritte. Isothermen Stufen verstärken die Herausforderung der Anwendung von analogen Echtzeit-Assays für die quantitative WGA. WGA weder vollständig während der Einrichtung verhindert werden, was zu unerwünschten variable Vorverstärkung, noch diskretisiert (&quot;getaktet&quot;) in einer Weise, wo die Replikation des heterogenen Moleküle vollständig durchgeführt und gestoppt werden, bevor der nächste Zyklus wie PCR 11 </sup&gt; (1). Ein digitales Testformat für WGA empfängt typische Reaktions Setup-Verfahren aufgrund der Segregation von jedem Molekül zur Zählung im Assayendpunkt (so Vorverstärkung beeinflußt die Treffer) Originalausleseeinrichtung Genauigkeit würde weitgehend unabhängig von Variationen in der Amplifikationseffizienz ist. Der Test ist abhängig von Tröpfchen in Öl mit einheitlichen Mengen hergestellt, wie der Signalpegel pro Tröpfchen in der Assay-Endpunkt wird auf dem Tröpfchenvolumen abhängen, und wir wollen nicht, dass die Konsistenz der Ergebnisse auf Mittelung über eine Verteilung der Tröpfchengrößen abhängen. Erstellen monodisperse Tröpfchen ist heute ein Standardverfahren (etwa 3.500 monodisperse Tröpfchen Papiere sind seit 2013 erschienen), erfordert aber mikrofluidischen Instrumentierung 25. In der Tat haben mehr als sechs Unternehmen entwickelt unabhängige kommerzielle Produkte, die auf die Produktion von solchen Tröpfchen verlassen und Tröpfchenherstellung mikrofluidischen Chipsim Handel erhältlich 23,29. Für diese Studie verwendeten wir kundenspezifische Mikrofluidvorrichtungen in-house (siehe Protokoll) hergestellt. Spritzenpumpen zu fahren Flusses durch die Vorrichtungen sind auch im Handel erhältlich, aber alternativ mit einem einzigen Einmalspritze zur Vakuum angetriebenen Strömungs substituiert werden, um die Kosten von 30 reduzieren.

<table><tbody><tr><td>Evagreen Farbstoff</td><td>Biotium</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA-Polymerase-Reaktionspuffer</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B0269S</td><td>Periodisch vortexen, bis sich das Aggregat auflöst</td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>New England Biotechnologies</td><td>N3011S</td><td>Auf 50 oC erhitzen und auf Eis vor der Verdünnung</td></tr><tr><td>Randomisierte MDA-Oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-NNNNN*N-3'PCR-Primer</td></tr> <tr><td></td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3' und 5'-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3'</td></tr><tr><td>Ultrareines Nuklease-freies Wasser</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td> vor <td>Gebrauch 30 Minuten lang mit Stratalinker 2400 UV-behandelt (optional)</td></tr><tr><td>ROX-Referenzfarbstoff</td><td>Life Technologies</td><td>12223-012</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Verschlüsse für optische Streifen Life</td><td>Technologies</td><td>4323032</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>dNTP (je 25 Mikromolaren)</td><td>Agilent Technologies</td><td>200415</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler - Mx3000P qPCR-System</td><td>Agilent Technologies</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Barrier Pipettenspitzen</td><td>VWR</td><td>89003-046</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad Öl für evagreen</td><td>Bio-rad</td><td>186-4005</td><td></td></tr><tr><td>JumpStart Taq ReadyMix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2893-100RXN</td><td></td></tr></tbody></table>

einfache massen auslesen des digitalen nukleinsäure quantifizierung assays

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digitale Assays sind leistungsfähige Methoden, die Detektion von seltenen Zellen und Zählung von einzelnen Nukleinsäuremoleküle zu ermöglichen. Jedoch digitale Assays noch nicht routinemäßig angewendet wird, aufgrund der Kosten und spezielle Ausstattung mit kommerziell verfügbaren Methoden verbunden. Hier präsentieren wir ein vereinfachtes Verfahren zum Auslesen der digitalen Tröpfchentests unter Verwendung einer herkömmlichen Echtzeit-PCR-Instrument, um Groß Fluoreszenz der tröpfchenbasierten digitalen Assays messen. Wir charakterisieren die Leistung des Schüttauslese Assays unter Verwendung synthetischer Gemische Tröpfchen und Tröpfchen digitalen Multiple Displacement Amplifikation (MDA) Assay. Quantitative MDA besonders profitiert von einer digitalen Reaktions Format, aber unsere neue Verfahren gilt für alle digitalen Assay. Für etablierte digitale Assay-Protokolle wie digitale PCR dient dieses Verfahren zu beschleunigen und zu vereinfachen Assay Auslesen. Unsere Großauslesemethode bringt die Vorteile der partitioned Assays ohne die Notwendigkeit für spezielle Auslese Instrumentierung. Die wichtigsten Einschränkungen des Schüttauslesemethode verglichen mit Tropfenzählen Plattformen und die Notwendigkeit für eine Standardprobe reduzierten dynamischen Bereich, wobei die Anforderungen an diese Norm sind weniger anspruchsvoll als für einen herkömmlichen Echtzeit-Experiments. Quantitative Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) wird verwendet, um für Kontaminanten in WGA Reaktionen testen und ist das empfindlichste Art und Weise, um die Anwesenheit von DNA-Fragmenten mit unbekannten Sequenzen zu erkennen, was das Verfahren sehr vielversprechend in unterschiedlichsten Anwendungsbereichen einschließlich der pharmazeutischen Qualitätskontrolle und Astrobiologie.

Während herkömmliche Bulk / Echtzeit-Auslesen kann sowohl für quantitative PCR und quantitative Assays WGA (Figur 1) verwendet werden, digital quantitative Assays bieten Vorteile (Tabelle 1). In dem beschriebenen Verfahren ausgelesen wir digitalen Assays in Mikrotröpfchen-Format mit einer einfachen Schüttendpunktmessung (Abbildung 2). Während dieses Verfahren breit anwendbar, konzentrieren wir uns auf quantitative WGA (MDA), da dieses Verfahren stellt besondere Herausfo...

Wir beschreiben einen digitalen Endpunkt-Assay zur Quantifizierung von Nukleinsäuren mit einer vereinfachten (analogen) Auslesung. Wir messen die Massenfluoreszenz von tröpfchenbasierten digitalen Assays mit einem Standard-qPCR-Gerät anstelle von speziellen Instrumenten und bestätigen unsere Ergebnisse durch Mikroskopie.

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Auswertung digitaler Tropfenanalysen mithilfe eines herkömmlichen Echtzeit-PCR-Geräts zu vereinfachen, indem die Gesamtfluoreszenz der Analyse gemessen wird. Dies wird erreicht, indem zunächst Amplifikationsreaktionen der interessierenden Proben und zweier Standardproben vorbereitet und Tropfen erzeugt werden, um jede Probe in Tausende von nanolitergroßen Reaktoren zu partitionieren. Der zweite Schritt besteht darin, die Tropfen zu inkubieren, um die Nukleinsäuren innerhalb jedes Tropfens zu amplifizieren.Anschließend wird die Gesamtfluoreszenz jeder Probe oder jedes Standards mit einem herkömmlichen QPC oder Thermocycler gemessen. Im letzten Schritt erfolgt die Vorhersage des Anteils fluoreszierender Tröpfchen in den Proben von Interesse mithilfe einer Standardkurve, die aus den Standardproben generiert wurde. Um die Leistungsfähigkeit dieser Methode zu überprüfen, kann die fluoreszenzmikroskopische Analyse eingesetzt werden, um die Quantifizierungsleistung des Gesamtfluoreszenz-Assays unabhängig zu bewerten.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Tröpfchenzählung besteht darin, dass keine spezielle Messapparatur erforderlich ist, bevor mit diesem Reparatur-Assay begonnen wird. Alle notwendigen Reagenzien, wie im Protokolltext beschrieben, sowie zwei Standards sind erforderlich. Ein No-Template-Kontrollansatz, beispielsweise nukleasefreies Wasser, und eine hohe Template-Konzentration, beispielsweise Lambda-DNA. Denaturieren Sie jeweils 3,3 Mikroliter jedes Standards mit 3,3 Mikrolitern Denaturierungspuffer in einem A-Q-P-C-R-Röhrchen.Ansatz bei Raumtemperatur drei Minuten lang inkubieren. Jeden Ansatz mit 3,3 µL Neutralisierungspuffer abklingen lassen. Ebenso 3,3 µL der gewünschten Vorlage mit 3,3 µL Denaturierungspuffer denaturieren, der drei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurde.Mit 3,3 µL Neutralisierungspuffer abbrechen. Für weniger oder falsch positive Ergebnisse 11 µL Master-Mix pro Probe herstellen. Den Master-Mix vor der Bildung von Tröpfchen UV-Licht aussetzen.Bereiten Sie zunächst 10 Mikroliter der Vormischung pro Probe in einem klaren 0,5-Milliliter- oder 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis vor. Die Vormischung besteht aus randomisierten Oligos, B-S-A-D-N-A-Polymerase-Reaktionspuffer, dn, NTPs und nukleasefreiem Wasser. Stellen Sie das Röhrchen auf Eis in Wasser und setzen Sie es nach der UV-Bestrahlung UV-Licht aus.Fügen Sie A-D-S-D-N-A-Bindungsfarbstoff und Referenznahrung zum Premixgemisch hinzu. Fügen Sie zuletzt PHI 29-DNA-Polymerase hinzu, um sicherzustellen, dass die Polymerase keinen pH-Werten deutlich über oder unter 7,5 ausgesetzt wird. Mischen Sie gut. Kombinieren Sie 10 Mikroliter des denaturierten Templates oder Standards mit 10 Mikrolitern der Mastermischung und mischen Sie gründlich.Da Tröpfchen sehr empfindlich gegenüber statischer Elektrizität und Scherkräften sein können, sollte der Experimentator Kleidung entfernen, die statische Elektrizität verursachen könnte, und sich vor dem Bilden der Tröpfchen erden. Die für diese Demonstration verwendete mikrofluidische Vorrichtung wurde intern hergestellt und verfügt über einen Öleinlass und zwei wässrige Einlässe mit einer Flussfokussierungsstelle zur Erzeugung von Tröpfchen. Verwenden Sie zwei Spritzenpumpen, um die Durchflussraten von 55 µL Öl mit Tensid und 20 µL Reaktionsgemisch durch den mikrofluidischen Chip zu steuern.Um 20.001 Nanoliter große Tröpfchen zu erzeugen, ist einer der schwierigsten Schritte das Sammeln der Tröpfchen, ohne die Emulsion zu stören. Es ist wichtig, langsam zu pipettieren und vorzugsweise eine Weitmundpipettenspitze zu verwenden.Sammeln Sie alle Tröpfchen für jede Probe in PCR-Röhrchen. Portionieren Sie 30 Mikroliter Öl mit einer Weitbohrpipettenspitze und sehr langsamen Pipettierschritten in frische PCR-Röhrchen mit optischen Deckeln. Übertragen Sie 20 Mikroliter Tröpfchen auf das Öl.Die konstanten Volumina gewährleisten eine möglichst hohe Genauigkeit des Assays. Schließen Sie die Röhrchenverschlüsse fest, da lose Verschlüsse die Verdunstung des Öls ermöglichen. Handhaben Sie die Röhrchen mit Emulsion stets am oberen Ende, also so weit wie möglich von der Emulsion entfernt. Für die isothermale Amplifikation kann ein PCR-Thermocycler, ein A-Q-P-C-R-Thermocycler oder eine Heizplatte verwendet werden.Ein A-Q-P-C-R-Thermocycler wird in dieser Demonstration verwendet. Inkubieren Sie die Proben sieben Stunden lang bei 30 Grad Celsius und inaktivieren Sie sie eine Minute lang bei 75 Grad Celsius. Unmittelbar nach der Reaktion und Aktivierung.Messen Sie die Fluoreszenzniveaus aller Proben mithilfe des QPCR-Thermocyclers. Teilen Sie für jede Probe die Fluoreszenzintensität des DS-DNA-Bindungsfarbstoffs durch die Fluoreszenzintensität des Referenzfarbstoffs.Ziehen Sie die Hintergrundfluoreszenz oder die normalisierte Fluoreszenz der No-Template-Kontrolle von allen Proben ab. Erstellen Sie eine lineare Standardkurve unter Verwendung der korrigierten Fluoreszenzmesswerte der Standards. Die No-Template-Kontrollprobe repräsentiert die Fluoreszenz für eine Probe mit 0 % fluoreszierenden Tröpfchen und der hohen Templatekonzentration.Die Fluoreszenzmessung entspricht der erwarteten Fluoreszenz einer Probe mit 100 % fluoreszierenden Tröpfchen unter Verwendung der entsprechenden Standardkurve. Prognostizieren Sie die intermediären Verhältnisse positiver und negativer Tröpfchen basierend auf deren Gesamtfluoreszenz. Diese Methode verwendet ein konventionelles Echtzeit-PCR-Gerät, um die Gesamtfluoreszenz von tröpfchenbasierten digitalen Assays zu messen.Fluoreszierende und nicht fluoreszierende Tröpfchen wurden in verschiedenen Verhältnissen vorgemischt, und ein Vergleich zwischen der Gesamtfluoreszenz und dem Anteil positiver Tröpfchen durchgeführt. Wie erwartet skalierten die Gesamtfluoreszenz und die Anzahl der positiven Tröpfchen linear mit dem eingegebenen Anteil fluoreszierender Tröpfchen. Die auf Standards basierenden vorhergesagten Verhältnisse wurden mit den erwarteten Eingabefraktionen fluoreszierender Tröpfchen verglichen.Die Linie zeigt den erwarteten Wert bei einer linearen Beziehung an. Die Ergebnisse zeigen eine gute Leistung bei der Quantifizierung des Tröpfchenverhältnisses über zwei Größenordnungen des dynamischen Bereichs. Um diese Methode in einem realen quantitativen Whole-Genome-Amplifikations-Assay zu testen, wurden Fluoreszenzintensitäten und Anteile positiver Tröpfchen eines digitalen Tröpfchens untersucht.Es wurden MDA-Assays mit steigenden Konzentrationen der Matrize Lambda-DNA gemessen. Die Linie zeigt den erwarteten fluoreszierenden Anteil an, wobei die Poisson-Verteilung zur Modellierung der experimentellen Daten verwendet wurde. Repräsentative fluoreszierende Bilder der Tropfen werden gezeigt; sowohl die Gesamtfluoreszenz als auch der Anteil an positiven Tropfen aus den digitalen MDA-Proben skaliert wie erwartet mit der durchschnittlichen Matrizenmenge pro Tropfen, was darauf hinweist, dass die Gesamtmessung das Ergebnis eines digitalen Assays zuverlässig wiedergeben kann.Diese Methode kann andere digitale Assays wie die digitale PCR unterstützen, indem sie die Parallelisierung beschleunigt und die Auswertung des Assays vereinfacht.

simple-bulk-readout-of-digital-nucleic-acid-quantification-assays

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Verwendung von NanoDrop Mikrovolumens Systeme als praktische und effiziente Alternative zu herkömmlichen Nukleinsäure Quantifizierung Methodik ist durch die Demonstration von zwei Mikrovolumens Nukleinsäure Quantifizierung Protokollen beschrieben.

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Diese Mitteilung enthält Daten über die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der BioSpec-nano UV-VIS Spektralphotometer für dsDNA-und Protein-Quantifizierung. Selbst bei extrem kleinen Volumina (1 bis 2 L), ist die Reproduzierbarkeit ausgezeichnet, während die automatische Wisch-Funktion verbessert den Durchsatz und die Ergebnisse in minimaler Verschleppung für genauere Ergebnisse.

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