Vorbereitung hoch poröser Koordinationspolymerbeschichtungen auf makroporösen Monoliths für verbesserte Anreicherung von Phosphopeptiden

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, ein neuartiges Trägermaterial mit verbesserter Leistung bei der selektiven Extraktion von Phosphopeptiden herzustellen. Dies wird durch die richtige Herstellung eines porösen Polymerkapillarmonolithen mit geeigneten funktionellen Gruppen erreicht. Zunächst wird eine Metallspezies an den funktionellen Gruppen eines Polymermonolithen immobilisiert, wodurch der Träger selektiv für die Extraktion von Phosphopeptiden wird.

Als nächstes wird schrittweise das Wachstum mehrerer Schichten des metallorganischen Gerüsts durchgeführt, um die Anzahl der Metallstellen zu erhöhen und so die Selektivität für Phosphopeptide zu erhöhen. Die Ergebnisse zeigen eine verbesserte Selektivität für die Extraktion von Phosphopeptiden aus Proteinverdauen basierend auf matrixgestützter Laserdesorptionsionisation und Flugzeit-Massenspektrometrie. Die Anreicherung des O-Peptids erfolgt in der Regel durch Metall-Löwen-Affinitätschromatographie, die entweder an herkömmlichen Siliziumdioxidpartikeln oder Polymerpartikeln durchgeführt wird, die in eine chromatographische Säule verpackt sind.

Unser Material kombiniert die Vorteile eines makroporösen Polymermonolithen, der über gute Stofftransporteigenschaften verfügt, mit der hohen Bindungskapazität eines metallorganischen Gerüsts. Die Art und Weise, wie wir dies erreichen, besteht darin, das metallorganische Gerüst sequentiell von der Oberfläche des Monolithen zu züchten, so dass wir am Ende mehrere Schichten von Metalllinien haben, die für die Interaktion mit dem Analyten zur Verfügung stehen. Die visuelle Demonstration der Polymermonolithenvorbereitung und das Wachstum des metallorganischen Gerüsts sind beide wichtig, da sie sehr schwer zu erlernen sind. Es gibt mehrere wichtige Schritte, auf die man achten muss, um einen Monolithen mit guten Oberflächeneigenschaften und Porosität zu erreichen.

Schneiden Sie zunächst zwei Meter einer Quarzglaskapillare ab, die mit Polyamid beschichtet ist und einen Innendurchmesser von 100 Mikrometern hat, die mit einer 25-Milliliter-Glasspritze verbunden ist, und waschen Sie die Kapillare mit Aceton. Entfernen Sie dann das Aceton, indem Sie die Kapillare mit Wasser spülen. Legen Sie anschließend eine 250-Mikroliter-Glasspritze, die mit einem 0,2-molaren wässrigen Natriumhydroxid gefüllt ist, auf die Spritzenpumpe und lassen Sie die Lösung bei einer Geschwindigkeit von 25 Mikrolitern pro Minute 30 Minuten lang durch die Kapillare fließen, um die innere Kieselsäurebeschichtung zu aktivieren.

Spülen Sie die Kapillare nach 30 Minuten mit Wasser, bis der Ablauf neutral ist. Verwenden Sie pH-Streifen aus Papier, um den neutralen pH-Durchfluss zu überprüfen. Als nächstes wird 0,2 molare wässrige Chlorwasserstoff in die Spritze geladen und die Lösung bei Punkt 25 Mikrolitern pro Minute durch die Kapillare gepumpt, um die Ciolgruppen nach 30 Minuten Fluss zu protonieren, spülen Sie die Kapillare erneut mit Wasser, bis der Fluss neutral ist.

Sobald der pH-Wert neutral ist, spülen Sie die Kapillaren mit einer 250-Mikroliter-Spritze, die mit 100 % Ethanol gefüllt ist. Pumpen Sie dann eine 20%ige Lösung aus drei Trimethylpropylmethacrylat in Ethanol bei Punkt 25 Mikroliter pro Minute für eine Stunde, um die Oberfläche mit Vinylgruppen zu funktionalisieren. Spülen Sie anschließend die Kapillaren mit Aceton aus und trocknen Sie sie anschließend mit einem Stickstoffstrahl ab.

Lassen Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur ruhen und schneiden Sie sie dann in 20 Zentimeter lange Abschnitte. Bereiten Sie das Polymerisationsgemisch in einem Ein-Milliliter-Glasfläschchen mit einem Gummiseptum vor, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie 1%A IBN in Bezug auf die Monomere als Initiator hinzu und beschallen Sie die Mischung 10 Minuten lang.

Als nächstes wird eine nicht funktionalisierte Siliziumdioxidkapillare an einen Stickstoffstrom angehängt und durch das Gummiseptum in die Polymerisationsmischung eingeführt. Lockern Sie die Kappe des Fläschchens leicht und lassen Sie den Stickstoff 10 Minuten lang langsam durch die Mischung sprudeln. Heben Sie nach 10 Minuten die Kapillare des Stickstoffstroms aus der Polymerisationsmischung in den Kopfraum des Fläschchens an und schließen Sie die Kappe fest.

Führen Sie eine der funktionalisierten Kapillaren durch das Septum in das Polymerisationsgemisch ein. Nutzen Sie den durch den Stickstoff erzeugten Drucküberschuss, um das Polymerisationsgemisch in die funktionalisierte Kapillare zu pumpen. Lassen Sie mehrere Tropfen des Polymerisationsgemisches aus dem Abwasser der Kapillare fließen, um sicherzustellen, dass sie vollständig gefüllt ist, und verschließen Sie sie dann mit einem Gummiseptum.

Nehmen Sie die Kapillare sehr vorsichtig aus dem Fläschchen und verschließen Sie den Einlass mit einem Gummiseptum. Legen Sie ein in der Kapillare enthaltenes Gemisch sechs Stunden lang in ein erhitztes Wasserbad bei 60 Grad Celsius, um zu polymerisieren. Wenn Sie fertig sind, kühlen Sie die Kapillare auf Raumtemperatur ab und schneiden Sie dann einige Millimeter von beiden Enden der Kapillare ab. Verwenden Sie anschließend eine HPLC-Pumpe, um die Säule 30 Minuten lang mit Acetonitril bei vier Mikrolitern pro Minute zu spülen.

Dadurch werden alle unreaktiven, Monomere und schlecht bildenden Mittel entfernt. Kontrollieren Sie den Gegendruck der Kapillarsäule. Als nächstes spülen Sie den Kapillarmonolithen in Zyklen mit den hier gezeigten Reagenzien, um die endgültige metallorganische Beschichtung wachsen zu lassen.

Die Schichtdicke wird durch die Anzahl der durchgeführten Zyklen bestimmt. Spülen Sie die Kapillaren mit der vorbereiteten metallorganischen Beschichtung unter Verwendung von 100 Mikrolitern einer Vier-zu-Eins-Mischung aus Acetonidversuch und 0,1 % wässriger Trioressigsäure. Pumpen Sie dann einen Proteinverdau mit zwei Mikrolitern pro Minute durch die Säule.

Waschen Sie die nicht phosphorylierten Peptide 30 Minuten lang erneut mit einer Vier-zu-Eins-Mischung aus Acetyl-NI-Versuch und 0,1 %iger wässriger Trifluoressigsäure für 10 Minuten bei einer Flussrate von einem Mikroliter pro Minute aus. 10 Minuten lang mit Wasser bei einer Durchflussrate von einem Mikroliter pro Minute waschen. Eluieren Sie die Phosphopeptide mit einer 250 mikromolaren Phosphatpufferlösung bei pH sieben, indem Sie sie 15 Minuten lang mit einem Mikroliter pro Minute durch die Kapillare pumpen, sammeln Sie das Ellu in einem Fläschchen und entsalzen Sie die Lösung unter Verwendung eines Standardprotokolls.

Als nächstes bereiten Sie eine Lösung von zwei Milligramm pro Milliliter von zwei Fünf-Dihydroxybenzoesäure in Methanol vor und mischen Sie zwei Mikroliter dieser Lösung mit zwei Mikrolitern der angedeuteten Phosphopeptidlösung. Platzieren Sie diese Mischung in einer Pipettenspitze direkt auf der matrixgestützten Laserdesorptionsionisationsplatte und lassen Sie den Spot vollständig trocknen. Analysieren Sie die Spots mit einem matrixgestützten Laser Desorptionsionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie regenerieren schließlich die Säule, indem sie gründlich mit Wasser gespült wird, gefolgt von Methanolkapillaren, die mit mehreren Schichten verfügbarem Eisen modifiziert wurden.

Drei Gruppen sind ideal für den Einsatz in der immobilisierten Metallionen-Affinitätschromatographie: Die hier gezeigten Spektren aus verdauten Proteinen vor und nach der Anreicherung zeigen eine bemerkenswerte Selektivität für 12 verschiedene Phosphopeptide. Repräsentative Charakterisierungsexperimente liefern wertvolle Informationen über die Entstehung neuer Poren. Hier ist ein Bild eines Pulvermonolithen nach 30 porösen Koordinationspolymerzyklen, die als PCP-Zyklen bekannt sind, unter Verwendung eines Rasterelektronenmikroskops.

Nach 30 PCP-Zyklen wurde festgestellt, dass die Größe der Porenbreiten im Material im Vergleich zum Volumenpolymer einen Durchmesser von weniger als drei Nanometern beträgt. Der Hybrid hat eine große inkrementelle Fläche mit kleinen Poren. Dies führt zu einer Erhöhung der Stickstoffabsorption durch eine Reihe von Drücken unter Verwendung der Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie.

Der initiale Einbau der funktionellen Gruppen von Carboxylen war ebenso sichtbar wie das Wachstum der Beschichtung nach 10, 20 und 30 PCP-Zyklen. Schließlich wurde die thermogravimetrische Analyse verwendet, um die Menge an zusätzlichen Metallstellen zu messen, die sich mit jedem Zyklus ansammelten. Hier ist eine gravimetrische Analyse über einen Temperaturbereich dargestellt, die das Vorhandensein einer erhöhten Anzahl von Metallstellen mit erhöhter Zykluszahl bestätigt.

Nach diesem Protokoll kann ein ähnliches Verfahren für verschiedene Metallzentren in organischen Liganden entwickelt werden, um effiziente Trennungen verschiedener Analyten basierend auf ihrer Affinität zu einem bestimmten Gerüst zu erreichen. Ich glaube, dass Verbundwerkstoffe wie unsere, die makroporöse Polymere mit metallorganischen Gerüsten kombinieren, auf dem Gebiet der Trennwissenschaft vielversprechend sind, da sie die Selektivität, das Bindungsvermögen und die Gesamteffizienz von Trennungen sowohl im analytischen als auch im präparativen Maßstab erheblich verbessern können.