Name: Die Implantation von miniosmotische Pumpen und Lieferung von Tract Tracer Brain Reorganisation in pathophysiologischen Bedingungen Studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Lernen Sie die Implantation von miniosmotischen Pumpen zur kontinuierlichen Zufuhr therapeutischer Substanzen ins Gehirn und die anschließende Tract-Tracer-Injektion zur Analyse von Veränderungen der kortikospinalen Leitfähigkeit.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der Dr. Werner Jackstädt Stiftung (an Eduardo Sanchez-Mendoza), dem Deutschen Akademischen Austauschdienst (DAAD; an Jeismar Carballo), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (HE3173/2-1, HE3173/2-2 und HE3173/3-1; an Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Stiftung (an Dirk M. Hermann).

Tierversuche wurden mit Genehmigung der Regierung durchgeführt (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 und G1362 / 13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung Düsseldorf), basierend auf NIH Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Herstellung von Pumpen miniosmotische <ol><li> In einer sterilen Umgebung (dh., Zellkultur Kapuze), erhalten Sie die Pumpe, Katheter, Strömungsmoderator, Gehirninfusionskanüle und die Distanzscheiben verwendet werden (Abbildung 1). </li><li> Zur Abgabe von Medikamenten direkt in die Herzkammern verwenden eine Abstandsscheibe, so daß nur die Spitze des Kanülennadel in Kontakt mit der Herzkammer. Halten Sie die Kanüle auf den Kopf mit einer Pinzette. Zwei Tropfen Cyanacrylat-Klebstoff (CA) und die Einführung einer Distanzscheibe. </li><li> Verlassen die Kanüle auf eine flache Oberfläche nach oben weist, so daß der Kleber zwischen der Zwischenscheibe und die Kanüle trocknet. </li><li> Schneiden des Katheters in Abschnitte von etwa 2,5 cm. </li><li> Für each Pumpe, bereiten eine minimale von 300-350 ul der Lösung von Interesse, wie es benötigt wird, um die Pumpe somit alle Luft Extrudieren vollständig zu füllen, in der es um die Bildung von Luftblasen innerhalb des Katheters zu verhindern. Bubbles wird die Strömung von der behindern Lösung in das Gehirn. </li><li> Sorgfältig verbinden den Katheter zur Strömungsmoderator. </li><li> Mit einem 2-ml-Spritze auf die Nadel durch das Gehirn Infusionssatz vorgesehen ist, füllen Sie die Pumpe, bis eine kleine Menge der Lösung entweicht die Pumpe und verhindert Luftblasen im Inneren. </li><li> Den Fluss Moderator sorgfältig auszufüllen und Katheter Aufmerksamkeit auf alle Blasen im Inneren des Katheters restlichen verhindern. </li><li> Führen Sie den Durchfluss Moderator in der Pumpe. </li><li> Im gefüllten Zustand sorgfältig zusammen die Kanüle an dem Ende des Katheters. Wenn beobachtet wird, dass eine Blase gebildet Entfernen der Kanüle und sorgfältig Nachfüllen des Katheters mit Vehikel oder Arzneimittellösung und anschließend wieder einführen Kanüle. </li><li> Setzen Sie den pump in einem Behälter mit steriler Kochsalzlösung und lassen Sie ihn bei 37 ° CO / N. </li><li> Vor der Implantation prüfen für Blasenbildung. Falls erforderlich (dh., Blasen beobachtet werden) entfernen Sie die Kanüle und füllen Sie das Rohr. Schließen Sie die Kanüle. Dieses sollte nur wenige Mikroliter der Lösung erfolgen. </li></ol> 2. Die Implantation von miniosmotische Pumps Anmerkung: Für diese Versuche wurden Tiere mit 1% Isofluran (30% O 2, 70% N 2 O) anästhesiert. Jedoch, wenn diese nicht verfügbar ist, ist auch die Verwendung von intraperitoneale Injektionen von Anästhesie möglich 11. <ol><li> Suchen Sie das Tier in der stereotaktischen Gerät unter Narkose und decken Sie die Augen mit einer Schutzsalbe zur Trockene, während der Narkose zu verhindern. Anästhesie Bestätigen Sie durch Beobachten einer fehlende Reaktion in der Hinterpfote, wenn sie mit den Fingern oder mit einer Pinzette gedrückt. Fahren Sie nicht fort, bis das Tier vollständig eingeschlafen. </li><li> Schneiden Sie das Fell über die erAnzeige entweder mit einer Schere oder einem Schermaschine. Geschnitten, so viel wie möglich, ohne die Haut zu beschädigen. </li><li> Reinigen Sie die Haut mit 70% Ethanol und Desinfektionsmittel mit antibakterielle und fungizide Eigenschaften. </li><li> Mit einem Skalpell öffnen Sie eine 1 cm Inzision leicht nach rechts von der Mittellinie und setzen die Schädel. </li><li> Reinigen Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen. Legen Sie ihn mit 70% Ethanol und gibt sie über den Schädel. Dies wird veran der Schädel, um zu trocknen. </li><li> Wenn der Schädel hat leichte Blutungen, verwenden Sie ein Ausbrenner, alle Blutungen Punkte zu beseitigen. Blut verhindert, dass die CA ordnungsgemäß Trocknen über den Knochen, wenn die Kanüle implantiert. </li><li> Verwenden Sie die stereotaktische Gerät an eine Markierung auf den Punkt des Schädels, wo die Kanüle wird implantiert werden zu machen. Ventrikuläre Infusionen auf der linken Hemisphäre Koordinaten -0.2 mm kaudal, 0,9 mm lateral zum Bregma (2A). </li><li> Vorsichtig bohren über den Schädel, einen Winkel von 45 °; Dies verhindert, dass der Bohrer versehentlich gehen in die brain. Mehrmals bohren für einige Sekunden und dann prüfen, wie tief das Loch. Stoppen Sie Bohren, sobald der Schädel wurde ausgedünnt, aber immer noch nicht vollständig durchdrungen. </li><li> Brechen Sie die Hirnhäute mit der Spitze einer sterilen Nadel bis zum vollen Zugriff auf das Gehirn erreicht. Do so sanft, so daß das Gehirn nicht beschädigt. </li><li> Reinigen Sie den Schädel mit 70% Ethanol mit einem Wattestäbchen. </li><li> Einführung einer geraden Pinzette unter der Haut des Tieres in einer von vorn nach kaudal. Verwenden Sie die Pinzette, um den Raum unter die Haut in den Rücken des Tieres, wo die Pumpe implantiert werden zu öffnen. Einführung der Pumpe in den Rücken des Tieres wobei der Katheter und die Kanüle Außenseite (2B). Die Pumpe wird in dieser Position verbleiben, bis sie entfernt und bildet nicht jede Art von Befestigung halten. </li><li> Vorsichtig vier kleinen Tropfen Klebstoff neben der Nadel in die Kanüle. </li><li> Die Nadel durch den Schädel vorsichtig einführen, ohne seitwärts bewegen. Halten Sie es in Position für 15-30 sec until die Kanüle vollständig gebunden (Abbildung 2C.1). Einmal im Ort, wird die Kanüle 2,5 mm in der dorso ventral zu erreichen, wenn eine Distanzscheibe verwendet wurde. Wenn sie richtig angebracht ist, wird die Kanüle in den Knochen befestigt ist, bis zum Ende des Experimentes bleiben. </li><li> Setzen Sie einen Finger auf die Registerkarte abnehmbar und dann mit der anderen Hand, die ihm der Hals mit einer Reihe von Scheren (Abbildung 2C.2) abgeschnitten. </li><li> Schließen Sie die Wunde auf der Haut mit einem 5-0 Naht und fügen Sie ein paar Tropfen des PVP-Jod-Lösung (PVP-I) oben auf der Wunde eine Infektion zu verhindern (2D). </li><li> Bewegen Sie das Tier in einen neuen Käfig. Operierten Tiere mit den Tieren, die noch nicht betätigt worden sind, legen. Halten Tiere, die mit der während der Zeit der Verabreichung des Arzneimittels Pumpen allein in ihre Käfige implantiert wurden. </li><li> Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie wach und haben Brustlage wieder. </li></ol> 3. Pumpe removal Hinweis: In der Regel das Experiment wird am Ende der Lieferzeit von der Pumpe erlaubt zu beenden, aber es ist möglich, die Pumpe, um Sekundär Experimente zu entfernen als Folgemaßnahme zu der Medikamentenabgabe. Um Trakt Tracer Injektionen tun, ist es daher notwendig, um die Pumpe zu entfernen. <ol><li> Legen Sie das Tier in der seterotactic Gerät unter Narkose und decken Sie die Augen mit Schutzsalbe zur Trockene, während der Narkose zu verhindern. Anästhesie Bestätigen Sie durch Beobachten einer fehlende Reaktion in der Hinterpfote, wenn sie mit den Fingern oder mit einer Pinzette gedrückt. Fahren Sie nicht fort, bis das Tier vollständig eingeschlafen. </li><li> Die Haut vorsichtig öffnen, indem durch den Einschnitt am Tag des Pumpenimplantation durchgeführt. </li><li> Mit einem chirurgischen Klammer Halten Sie die Kanüle und herausziehen. Es sollte leicht aus dem Schädel entfernt werden. Als sanfte Blutungen zu erwarten ist, stoppen, indem Sie ein Wattestäbchen und warten Sie 1-2 min. </li><li> Ziehen Sie die Pumpe durch den Katheter. Erlp es heraus, indem Sie sie, wodurch Druck über die Haut. </li><li> Schließen Sie die Wunde wieder mit einem 5-0 Naht und fügen Sie ein paar Tropfen des PVP-I. </li><li> Bewegen Sie das Tier in einen neuen Käfig. Nicht mit den Tieren, die noch nicht betätigt worden sind, setzen Sie operierten Tieren. Tiere, die Operation unterzogen haben können zusammengestellt werden. </li><li> Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie wach und haben Brustlage wieder. </li><li> Lassen Sie das Tier 10 Tage lang, bevor Sie mit Trakt Tracer-Injektion zu erholen. </li></ol> 4. Druck Tract Tracer Injection bei 45 ° Winkel auf der rechten Motor Cortex <ol><li> Legen Sie das Tier auf der stereotaktischen Gerät unter Narkose und decken Sie die Augen mit einer Schutzsalbe zur Trockene, während der Narkose zu verhindern. Anästhesie Bestätigen Sie durch Beobachten einer fehlende Reaktion in der Hinterpfote, wenn sie mit den Fingern oder mit einer Pinzette gedrückt. Fahren Sie nicht fort, bis das Tier vollständig eingeschlafen. </li><li> Öffnen Sie die Kopfwunde. </li><li> Clehnen den Schädel mit 70% Ethanol mit einem Wattestäbchen. </li><li> Einführung einer 5 &amp; mgr; l-Glasspritze (26S ga) auf der vertikalen Halterung des Gerätes. Sicherstellen, dass das untere Ende der Glashalter ist genau an der Haltestück. Die Spritze nicht zu weit darunter, da dann wird es unmöglich, sie auf 45 ° von der vertikalen Position zu bringen und führen die Injektion. </li><li> Richten Sie die Spritze direkt über Bregma und suchen Sie dann die gewünschten Koordinaten. Für eine Injektion an den motorischen Kortex Koordinaten: Punkt # 1: 0,5 mm rostral und 2,5 mm lateral bezüglich Bregma. Point # 2: 1,34 mm rostral, 2,5 mm lateral bezüglich Bregma. </li><li> Sobald Koordinaten lokalisiert wurden, zeigen ihre Position über den Schädel mit einem Marker mit einer dünnen Spitze. Machen Sie nur ein Punkt im Schädel wie überschüssige Tinte Mitteilung könnte verstecken das richtige Koordinaten. </li><li> Bohren Sie vorsichtig den Schädel hält den Bohrer bei 45 °. Wie in Schritt 2.8, überprüfen Sie die Schädel häufig, so dass es nicht vollständig perfum Schädigung des Gehirns durch den Bohrer zu vermeiden dampft. Verwenden Sie die Spitze einer Spritze, um sicherzustellen, dass alle Knochen entfernt wurde. </li><li> Laden 600 nl der Trakt Tracerverdünnung in die Spritze. </li><li> Einstellen der vertikalen Position um 45 ° in Richtung der rechten Seite des Tieres. Unter dem Mikroskop, legen Sie die Spitze der Spritzennadel direkt vor das Loch. </li><li> Bewegt es in der vertikalen Richtung um 1,5 mm. Lassen Sie die Nadel stabil in dieser Position für 30 Sekunden bis 1 Minute, bevor Sie Druckinjektionen. </li><li> Injizieren 300 nl Tracer Verdünnung in drei Stufen von 100 nl voneinander durch 30 Sekunden getrennt. Nach der letzten Injektion, lassen Sie die Spritze stabil für 30 Sekunden bis 1 Minute, um den Tracer aus dem Gehirn fließen zu vermeiden. </li><li> Ziehen Sie den Spritzen, verlagern sie über das zweite Loch, und wiederholen Sie den gleichen Vorgang mit den verbleibenden 300 nl, die in der Spritze sind. </li><li> Nach der zweiten Injektion, entfernen Sie die Spritze und füllen Sie die Sie suchen zu schließennd mit einem 5-0 Naht und fügen Sie ein paar Tropfen des PVP-I. </li><li> Bewegen Sie das Tier in einen neuen Käfig. Nicht mit den Tieren, die noch nicht betätigt worden sind, setzen Sie operierten Tieren. Tiere, die Operation unterzogen haben können zusammengestellt werden. Mäuse nicht unbeaufsichtigt, bis sie wach und haben Brustlage wieder. </li><li> Damit die Tiere für 10 Tage vor der Tötung erholen. </li></ol> 5. Tract Tracer Beobachtung <ol><li> Betäuben das Tier vollständig pro Institutionsrichtlinien. Anästhesie Bestätigen Sie durch Beobachten einer fehlende Reaktion in der Hinterpfote, wenn sie mit den Fingern oder mit einer Pinzette gedrückt. Fahren Sie nicht fort, bis das Tier vollständig eingeschlafen. </li><li> Perfusion der Tiere mit 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7) unter Standard-Protokolle 6. </li><li> Entfernen Sie das Gehirn und senden Sie fix durch O / N Eintauchen in 4% Paraformaldehyd. </li><li> Cryoprotect Gehirne in Saccharose bei 30%, bis die Köpfe sinken. Dann entfernen Sie die Gehirne und frieren sie um 10 Sek immersion in flüssigem Stickstoff. Halten Gehirne bei -80 ° C bis Abschnitten hergestellt werden. </li><li> Produzieren Abschnitte bei 20 &amp; mgr; m für die retrograde Trakt Tracer Analyse und bei 40 &amp; mgr; m für die anterograde Trakt Tracer Analyse durch Schneiden auf einem Kryostaten. </li></ol> Hinweis: FG markierten Neuronen als weiße Zellen unter UV-Lichtanregung beobachtet werden. BDA durch O / N Inkubation mit einem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex und 3,3 Diaminobenzidin mit Zugabe von Nickel von 0,4% ermittelt, um den Kontrast der Fasern 6,7 zu erhöhen.

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<li>Hermann, D. M., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+brain+remodelling+and+plasticity+for+stroke+recovery%3A+therapeutic+promise+and+potential+pitfalls+of+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Promoting brain remodelling and plasticity for stroke recovery: therapeutic promise and potential pitfalls of clinical translation.</a> Lancet Neurol. 11, 369-380 (2012).</li>
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</ol>

Produktion und Open-Access-Publikationsgebühren von DURECT Corporation, die die miniosmotische Pumpen in diesem Artikel verwendete produziert bereitgestellt.

Seit vielen Jahren hat die Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen wie Schlaganfall oder Schädel-Hirn-Verletzungen auf die Entwicklung von neuroprotektiven Therapien, die das Überleben von Neuronen in der akuten Schlaganfallphase zu fördern Ziel konzentriert. Die große Mehrheit der Drogen-Therapien, die gefunden wurden, um wirksam in Nagetiermodellen gescheitert, wenn in die Klinik übersetzten. Gründe für diese Therapieversagen umfassen, sind jedoch nicht auf das Ausbleiben einer nachhaltigen Arzneimittelwirkungen, was zu persistierende funktionelle neurologische Erholung beschränkt. Es ist daher wichtig, Strategien zu fördern Gehirn Umbau auf längere Sicht zu entwickeln. Denn die Förderung der neuronalen Überlebens allein nicht ausreicht, um erfolgreich Schlaganfall Erholung zu ermöglichen, wie durch die große Anzahl von erfolglosen Neuroprotektion Studien vorgeschlagen, die Stimulation der neuronalen Plastizität sich jüngst großes Interesse auf dem Gebiet. Bedeutet für die Arzneimittelabgabe sind intraperitoneale Injektion, Schwanz intravaskuläre injection, Oberschenkel Injektion einzigen stereotaktische Injektion der Vektoren in das Gehirn und weiterhin konstante Lieferung von miniosmotische Pumpen. Letzteres kann eine systemische Verabreichung umfassen, wenn die Pumpe nicht über eine Kanüle oder die Orgel gerichtet werden können, wie wir für die Lieferung in das Gehirn gezeigt. Mit Ausnahme miniosmotische Pumpen und die Verwendung von viralen Vektoren, werden alle anderen Strategien schwankArzneimittelKonzentrationen induzieren. Für Langzeitexperimente somit wird es notwendig, um das Tier zum Druck des Empfangs häufige Injektionen vor. Die BBB erlegt erhebliches Hindernis für die Aufnahme in das Gehirn von Proteinen oder Medikamenten aus dem Blut, was zu der Notwendigkeit von großen Protein oder Medikamentendosierungen, um therapeutische Konzentrationen im Gehirn zu erreichen. Beispiels Pellegrini et al. (2013) geliefert rhEpo durch intraperitoneale Injektion in einer Dosis entsprechend 75 IU / Tag für ein Tier von 30 g (750 IU / Tag für einen 300 g Ratte) 5. Zum Vergleich: Die gezielte Abgabe von RHEPo an das Gehirn es uns ermöglicht, eine viel geringere Dosis von 10 IE / Tag in unserer Studie für eine erfolgreiche Wiederherstellung nach Schlaganfall, die es uns ermöglicht, Rückgewinnung über einen großen Zeitskala zu einem festen Zinssatz von 0,25 &amp; mgr; l / h zu erzielen. In dieser Arbeit haben wir das Verfahren der Implantation von Minipumpen mit einer Kanüle an dem Schädel, um die Plastizität fördernde Protein rhEpo direkt in den Ventrikel zu liefern, so dass unter Umgehung der BBB verbunden ist. Durch dieses Verfahren gefördert rhEpo neurologische Erholung in einer Anzahl von Wegen, einschließlich der Verringerung der Infarktgröße, Verringerung des glialen Narbenbildung und die Induktion von Angiogenese. rhEpo gefördert neuronale Überleben und erhöhte Projektionen aus dem kontraläsionalen motorischen Kortex in Richtung der denervierten roten Kern und Gesichts Kernen. Der Austrieb der Fasern wurde durch Injektion der anterograde Trakt Tracer BDA in den motorischen Cortex (4A und 5A), offenbart. Eine funktionelle Entsprechung zu dem Sprießen der Fasern prdurch die Verbesserung der motorischen Fähigkeiten (5B) ovided. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass der gleiche Ansatz für Trakt Tracerinjektion angewendet werden, um thalamo-kortikalen Verbindungen durch Injektion des retrograden Tracers FG-Darm-Trakt (6B) zu enthüllen werden. Bei der Herstellung des miniosmotische Pumpe ist es wichtig, den Zielpunkt und die Verwendung von Abstandhaltern zu betrachten. Wir verwenden ein Abstandhalter, um die Länge der Nadel um 0,5 mm, wie auf diese Weise die Spitze der Nadel in Kontakt mit der Herzkammer auf den angegebenen Koordinaten (-0,2 mm caudal zu reduzieren, 0,9 mm lateral 2,5 mm dorso ventral mit bezüglich Bregma). Jedoch, wenn tiefere Strukturen sind das Ziel der Forschung, dann werden keine Abstandshalter erforderlich. Ebenso, wenn eine externe Abgabestelle gewünscht (dh., Dem Kortex), dann mehrere Distanzscheiben erforderlich. Der Katheter muss lang genug sein, damit die Pumpe nicht zu nah an den Kopf, als sie Bewegungen des mou behindernse, aber auch nicht zu lange im implantierten Überlänge kann bewirken, dass der Katheter zu biegen, so dass die Gefahr der Kanüle Entfernung durch die natürliche Bewegung der Maus. Ein Abschnitt von 2 cm des Katheters liefert sehr gute Ergebnisse hinsichtlich der Beweglichkeit und Stabilität des Implantats (1 und 2). Inkubation der Pumpe bei 37 ° CO / N kann die Pumpe sofort zu starten Pumpen des Arzneimittels in das Gehirn im Augenblick der Implantation. Im miniosmotische Pumpenimplantation ist es entscheidend, sicherzustellen, daß der Schädel ist, bevor die Implantation der Kanüle getrocknet. Normalerweise Reinigung mit 70% Ethanol wird der Knochen, um zu trocknen zu induzieren, aber wenn kontinuierliche Blutungen gefunden wird, berührt den Schädel vorsichtig mit einem Ausbrenner vollständig trocknen. Es ist kritisch, um sicherzustellen, dass die Einführung der Nadel als vertikale und langsam wie möglich. Einmal in Position, und während der Klebstoff trocknet, indem die Finger auf der Oberseite der Kanüle verhindert, dass sie sich seitwärts bewegt over den Schädel. Besondere Sorgfalt sollte auf die Wunde und die Platzierung der Kanüle gegeben. Wichtig ist, daß der Schnitt nicht genau über der Mittellinie des Schädels, aber leicht zur rechten Seite durchgeführt. Beim Schließen der Wunde, wenn der Einschnitt an der Mittellinie gemacht, die Haut wird überdehnt werden, wodurch das Risiko von Wundöffnung zunimmt. Dem Schnitt leicht zu einer Seite ermöglicht die Nahtstellen, um weg von dem höchsten Teil der Kanüle ist. Als Folge wird es weniger Spannung auf die Nahtstellen und die Wunde wird richtig zu heilen. Die Tiere sollten nur in Käfigen gehalten werden und überprüft jeden Tag, besonders während der ersten 10-15 Tage nach der Implantation. Im Falle Wunddehiszenz haben Wunden so schnell wie möglich geschlossen werden. Wenn die Kanüle entfernt wird, oder das Tier stellt eine Infektion wurde das Experiment beendet. Reimplantation der Kanüle wird nicht empfohlen. Es ist sehr wichtig für eine erfolgreiche Implantation ausreichende Mengen an Gewebe ad verwendenKLEBEND (nicht zu viel!), wie es verschlechtert die Knochen und erhöht das Risiko der Kanüle entfernen. Jedoch mit zu wenig Klebstoff wird auch die Kanüle bis auf die Knochen befestigt nicht halten. Die miniosmotische Pumpen können in einer breiten Vielfalt von Stoffen gelöste Arzneimittel tragen, wobei die einzige Einschränkung dieser daß das Lösungsmittel biokompatibel. Zusätzlich, da das Volumen klein ist (200 ul) bestimmt werden, ob die für das Experiment benötigte Konzentration ist geeignet und wird nicht Ausfällung innerhalb der Pumpe führen. Tract Verfolgung entweder mit anterograden oder retrograde Tracer ist eine sehr gut etablierte Technik zum Gehirn-Konnektivität und Plastizität zu untersuchen. Sorgfalt muss für die Verwendung der stereotaktischen Rahmen bei der Injektion, um die Genauigkeit über die Ausrichtung der Gehirnbereich zu studieren wünscht, einen Nutzen zieht (das heißt zur Injektion auf dem Balken zu verhindern, wenn das Einspritzen des Cortex). Für alle chirurgischen Eingriffe und um Schmerzen zu reduzieren undEntzündungen, sollten die Tiere mit 0,1 mg / kg Buprenorphin 4 mg / kg einmal täglich für drei Tage nach der Operation behandelt werden vor dem Eingriff und Caprofen. Abschließend bietet dieser Ansatz eine richtige Werkzeug für die Untersuchung Wirkung von Proteinen oder pharmakologische Verbindungen im verletzten Gehirn, die eine Methode, die gut für Studien über die Plastizität des Gehirns geeignet ist.

Die Verabreichung von Proteinen und pharmakologischen Verbindungen in das Gehirn sind wichtige Strategien zur Untersuchung von Mechanismen, die Hirnerkrankungen zugrunde liegen, und zur Bewertung von Kandidatenmolekülen für neue Behandlungen 1,2. In den experimentellen Neurowissenschaften ist die Verabreichung von Vektoren wie Plasmiden oder Adenoviren zu einem wichtigen Werkzeug geworden, um die Langzeitwirkung von Proteinen im Gehirn zu untersuchen 3,4. Einzelne Injektionen von Vektoren stellen den Vorteil eines Systems dar, das für sich genommen sehr stabile Spiegel des Therapeutikums im Gehirn aufrechterhält 4. Bei Langzeitexperimenten mit gereinigten Arzneimitteln induziert die systemische Verabreichung durch intraperitoneale Injektion jedoch Stress bei Mäusen oder Ratten und ist nicht die beste Wahl, wenn eine gezielte Reaktion des Gehirns erforderlich ist, was auch hohe Dosen des Medikamentserfordert 5. Miniosmotische Pumpen stellen ein ideales System für eine verlängerte direkte Wirkstoffabgabe in das Gehirn dar, indem sie sowohl eine geringe Zugänglichkeit zum Gehirn als auch Spitzen der Arzneimittelkonzentration umgehen, da die Abgabe des Arzneimittels direkt an einen bestimmten Ort im Gehirn und mit einer festen Durchflussrate erfolgt, die durch das gewählte Pumpenmodellbestimmt wird 2,6,7. In der Tat hat dieses System es uns ermöglicht, die Erholung des Gehirns nach einem Schlaganfall erfolgreich zu untersuchen, indem wir verschiedene Medikamente wie rekombinantes humanes Erythropoietin (rhEpo) und den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor 6,7 verabreicht haben. 
Die Plastizität des Gehirns ist essentiell für die Neuverdrahtung von Verbindungen als Reaktion auf Hirnverletzungen. Plastizität ist ein weit gefasster Begriff, der von der Bildung oder Beseitigung synaptischer Kontakte über das Wachstum dendritischer Dornen bis hin zur Verlängerung oder Retraktion von Langstreckenverbindungen reicht8,9. Bisher ging man davon aus, dass das Gehirn nicht in der Lage ist, Zusammenhänge nach einer Läsion zu rekonstruieren. Viele Ansätze haben jedoch gezeigt, dass es bei richtiger Stimulation die Konnektivität wiederherstellen kann 6,7,10. Eine Technik, die besonders nützlich ist, um dies zu untersuchen, ist die Verwendung von Tract Tracern. Anterograde Tracer sind Verbindungen, die am Soma in Neuronen eindringen und sich dann entlang der Axone verteilen können, bis diese ihre Zielstrukturen erreichen. Zwei Beispiele sind Kaskadenblau (CB) und biotinyliertes Dextranamin (BDA). Umgekehrt dringen retrograde Tracer wie Choleratoxin B (CTB) oder Fluorgold (FG) durch das Axonterminal in das Neuron ein und verteilen sich dann zurück zum Soma, wodurch der Ursprungsort der Neuronen enthüllt wird, die auf die Injektionsstelle abzielen.
Hier stellen wir die Methoden vor, die wir für die Implantation von miniosmotischen Pumpen zur direkten Abgabe von Proteinen oder Medikamenten verwenden, die potenzielle Auswirkungen auf die neuronale Plastizität haben, sowie die Injektion von BDA und FG, um Ein- und Ausgangsverbindungen zum motorischen Kortex zu enthüllen. BDA wird auch als Beispiel für einen Tract-Tracer verwendet, der verwendet wird, um eine erhöhte Plastizität von Axonen zu demonstrieren, die nach einem Schlaganfall unter rhEpo-Behandlung aus dem Co austreten.

<table><tbody><tr><td>Miniosmotische Alzet-Pumpe. Modell 2004.</td><td>Alzet</td><td>000298</td><td>Behälter für Medikamente</td></tr><tr><td>Infusionsset für das Gehirn 3 1-3 mm</td><td>Alzet</td><td>0008851</td><td>Verabreichungssystem für das Gehirn</td></tr><tr><td>Loctite&nbsp; 454 Prismengel&nbsp;</td><td>Loctite</td><td>45404</td><td>Cyanacrylat-Klebstoff für die Kanülenhaftung auf dem Schädel</td></tr><tr><td>75N Glasspritze&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>87900/00</td><td>Injektion von Tracern für Tracts</td></tr><tr><td>Biotin Dextran Amin (10.000 MW)</td><td>Molekulare Sonden</td><td>N-7167</td><td>Tracer für anterograde Tracts</td></tr><tr><td>Fluorogold</td><td>Fluorochrome, LLC.</td><td></td><td>Retrograder Tract</td></tr><tr><td>Tracer Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>Stereotaktisches Gerät zur Koordinatenbestimmung, Pumpenimplantation und Tract Tracer Injektion.</td></tr></tbody></table>

die implantation von miniosmotische pumpen und lieferung von tract tracer brain reorganisation in pathophysiologischen bedingungen studieren

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

Die pharmakologische Behandlung von Hirnerkrankungen in Tiermodellen führt zu wiederholten Injektionsprotokollen, die bei Tieren Stress auslösen und zu unbeständigen Gewebespiegeln des Arzneimittels führen können. Darüber hinaus ist die Verabreichung von Medikamenten an das Gehirn aufgrund der Blut-Hirn-Schranke (BHS) empfindlich, wodurch die intrazerebralen Konzentrationen selektiver Arzneimittel nach systemischer Verabreichung signifikant reduziert werden. Daher ist ein System, das sowohl eine konstante Wirkstoffabgabe ohne Spitzenwerte als auch eine Umgehung der BHS ermöglicht, um ausreichend hohe intrazerebrale Konzentrationen von Arzneimitteln zu erreichen, die für die BHS undurchlässig sind. In diesem Zusammenhang stellen miniosmotische Pumpen ein ideales System für die konstante Wirkstoffabgabe mit einer festen bekannten Rate dar, das sich dem Problem des täglichen Injektionsstresses bei Tieren entzieht und das auch für die direkte Verabreichung von Medikamenten im Gehirn verwendet werden kann. Hier beschreiben wir eine Methode zur Implantation einer miniosmotischen Pumpe und zur Nachsorge bei Tieren, um diese Technik erfolgreich anzuwenden. Wir betten das oben erwähnte experimentelle Paradigma in Standardverfahren ein, die zur Untersuchung der Neuroplastizität im Gehirn von C57BL6-Mäusen verwendet werden. Daher setzten wir die Tiere einem 30-minütigen Hirninfarkt aus und implantierten ihnen miniosmotische Pumpen, die über eine Kanüle mit dem Schädel verbunden waren, um ein Proplastizitätsmedikament zu verabreichen. Verhaltenstests wurden während der 30-tägigen Behandlung durchgeführt. Nach der Entnahme erhielten die Tiere Injektionen von Tracern des anterograden Trakts, um die neuronale Plastizität in der chronischen Erholungsphase zu analysieren. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die Neuroprotektion durch das verabreichte Medikament mit einer Zunahme der motorischen Fasern einherging, die die Mittellinie des Gehirns an den Zielstrukturen kreuzten. Die Ergebnisse bestätigen den Wert dieser Techniken für die Verabreichung von Medikamenten und Studien zur Plastizität des Gehirns in den modernen Neurowissenschaften.

Wir während 30 Tagen, beginnend 3 Tage nach der eingereichten Tieren bis 30 min der mittleren Hirnarterie durch den intraluminalen Fadenmethode Induktion einer Läsion in das linke Striatum und dann geliefert rhEpo direkt in das Gehirn durch miniosmotische Pumpen (Abbildung 1, Abbildung 3) Takt 6. 4 zeigt eine schematische Darstellung des cortico Spinaltraktes die nach CB und BDA Einspritzung und dem Bereich, wo Tracer injiziert verfolgt wurde. Wir zeigten eine Verbesserung der Greifkraft und Motorleistung (Abbildung 5) nach 14 und 42 Tagen nach der Lieferung bzw. rhEpo. Lieferung von BDA in die rechte Motorkortex von Tieren, die einen Anschlag auf der linken Striatum empfangen, zeigten einen Anstieg der motorischen Fasern Überqueren der Mittellinie auf dem Niveau des roten und Facialiskern (Figur 5), was zeigt, erfolgreich Anfärbung Sprießen Fasern eine Folge der pharmakologischen Behandlung mit miniosmotic-Pumpen. rhEpo Behandlung erhöhte auch das neuronale Überleben, verzögerte diffuse Astrozytose, verringert glialen Narbenbildung und eine erhöhte Angiogenese in der untersuchten Periode 6. Durch Verwendung dieser gleichen Technik für Trakt Tracerinjektion können wir erfolgreich Thalamuskernen die zum Cortex durch Injektion des retrograden Trakt Tracer FG (Figur 6) verbunden sind, zu detektieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig1.jpg" /> Figur 1. Bestandteile der miniosmotische Pumpe in diesem Protokoll verwendet. Die Distanzscheibe, Kanüle und entfernbaren Streifen, Katheter, Flußmoderator und miniosmotische Pumpe beobachtet werden. Der Aspekt der komplett montierten Pumpe kann in 2A gesehen werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ithin-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig2.jpg" /> Abbildung 2. Zusammenfassung der Pumpenimplantation wichtigsten Punkte. (A) Die Maus ist gezeigt, wie auf der stereotaktischen Vorrichtung mit dem vollständig aufgebauten miniosmotische Pumpe daneben angeordnet. Der Pfeil zeigt die zur Implantation ausgewählten Koordinaten. (B) Die Pumpe wurde an der Rückseite des Tieres eingeführt wurde und nur die Kanüle an der Außenseite bleibt. Der Schädel wurde bereits gebohrt. (C) Seiten des Kopfes nach der Implantation. (C.1) Die Kanüle ist auf Position aber die Registerkarte abnehmbare nicht geschnitten worden. (C.2) Die entfernbaren Streifen geschnitten wurde und das Nähen von Die Wunde kann nun beginnen. (D) Der Stern zeigt eine kürzlich implantierte Tier im Vergleich zu einem Tier 30 Tage nach der Implantation (#). Wenn es richtig untergebracht ist, sollte die Wunde geschlossen, bis zum Ende des Verfahrens bleiben, wie auf dem Bild gezeigt.ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig3.jpg" /> Abbildung 3 Nissl-Färbung, die die Stelle der Implantation auf dem Kortex. Ein kleiner Schnitt auf Teil des linken Cortex (Pfeil) beobachtet werden. Die Breite des durchdrungenen Bereich ist etwa 50 um. Die keine offensichtlichen schweren Gewebeveränderungen anhand von Nissl-Färbung im Vergleich zu der entsprechenden Gegenfläche (*). R: rechte Hemisphäre. L: Linke Hemisphäre. Maßstabsbalken = 300 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig4.jpg" /> Abbildung 4. TractTracer-Einspritzstrategie wie zuvor durch Reitmeier et al. 6,7 publiziert. (A) Schematische anzeigt Injektionsstellen für die Darm-Trakt Tracer BDA an der kontralateralen motorischen Kortex der Erwägung, dass CB wurde in der motorischen Kortex des Infarkt Hemisphäre injiziert. Fasern wurden auf dem roten Nucleus (nicht gezeigt) und Facialiskern (siehe Abbildung 5). (B) Die Injektionsstelle der anterograde Trakt Tracer BDA neben der motorischen Kortex gezeigt folgt. Beachten Sie den roten Pfeil, der die Nadelbahn der Erwägung, dass der schwarze Pfeil zeigt einige Rindenzellen mit dem BDA beschriftet. Cx: Cortex. CC: Corpus callosum. V: Ventrikels. FN: Gesichts Kern. Maßstabsleiste in B = 200 &amp; mgr; m. 4A wird mit freundlicher Genehmigung 6 wiedergegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt = &quot;5&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.932 / 52932fig5.jpg&quot; /&gt; Abbildung 5. Wiederherstellung eines Infarkt Gehirn nach Lieferung rhEpo. (A) BDA injiziert im kontraläsionalen motorischen Kortex wird dann in kortikobulbären Fasern auf der Ebene des Facialiskern (Bregma -5,8 mm bis -6,3 mm) festgestellt. Schnittlinien auf jeder Hemisphäre wurden parallel zur Mittellinie und Fasern überquert jede Zeile in Richtung zur ipsilesional und kontraläsionalen Halbkugel gezogen wurden gezählt und als Prozentsatz des gesamten markierten Fasern in der Pyramidenbahn ausgedrückt. Erythropoietin erhöhten Faserkreuzungen in Richtung zu den kontraläsionelle Facialiskern Daten sind Mittelwerte + - SD. Die Daten wurden durch Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt von mindestens signifikanten Unterschiede Tests §P &lt;0,05 im Vergleich zu Vehikel-behandelten nicht-ischämischen Mäusen. (B) Motor Verhalten zeigten eine Verbesserung der Handkraft und Koordination in der rota Stange Test. Die Daten sind Mittel valun + - SD. Daten wurden durch Zweiweg-ANOVA mit wiederholten Messungen analysiert, gefolgt von Einweg-ANOVA / am wenigsten signifikanten Unterschiede Tests für jede Zeitpunkt. §P &lt;0,05 im Vergleich mit vorher ischämischen Grundlinie; * P &lt;0,05 im Vergleich zu Vehikel-behandelten ischämischen Mäusen. 5A und B sind mit freundlicher Genehmigung 6 wiedergegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig6.jpg" /> Figur 6. Zielstrukturen nach Injektion Fluorogold (FG) erreicht ist. (A) an der Injektionsstelle von FG neben dem Motorkortex, wie in 1 angezeigt. Beachten Sie den roten Pfeil, der die Nadelbahn und der weiße Pfeil zeigt einige markierte Zellen in die Rinde. (B) FG injiziert in der Nähe des MotorsCortex ist in der VPL erkannt. Fi: Fimbria. IC: Interne Kapsel. RT: Nucleus reticularis. VPL: Thalamus ventralen posterolateralen Kern. Maßstabsbalken = 200 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Um die Reorganisation des Gehirns unter pathologischen Bedingungen zu untersuchen, haben wir miniosmotische Pumpen für die direkte Proteinabgabe ins Gehirn verwendet, wobei die Blut-Hirn-Schranke umgangen wird. Anschließend werden Tract Tracer injiziert, um Veränderungen in der Gehirnkonnektivität unter dem Einfluss des Proteins zu untersuchen.

Die Implantation von miniosmotische Pumpen und Lieferung von Tract Tracer Brain Reorganisation in pathophysiologischen Bedingungen Studieren

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mini-Osmopumpen zu implantieren, um therapeutische Wirkstoffe ins Gehirn abzugeben, und anschließend Bahnmarkierungen vorzunehmen, um Veränderungen der Leitfähigkeit der kortikospinalen Bahn zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der neurorestaurativen Forschung zu beantworten, beispielsweise wie Fernverbindungen innerhalb des zentralen Nervensystems in Gegenwart potenzieller therapeutischer Wirkstoffe verändert werden. Der Hauptvorteil dieser Techniken liegt darin, dass die kontinuierliche Abgabe des therapeutischen Wirkstoffs die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse gewährleistet, während die Bahnmarkierungen sehr zuverlässige Mittel sind, um morphologische Veränderungen bei Fernverbindungen zu verfolgen.Im Allgemeinen werden Personen, die mit diesen Methoden neu sind, Schwierigkeiten haben, da Präzision und chirurgische Fähigkeiten unerlässlich sind, um Gehirnschäden infolge der verschiedenen Eingriffe zu vermeiden. Ich werde das Verfahren gemeinsam mit Jeismar Carballo demonstrieren, einem Doktoranden aus dem Labor von Professor Hammond. Beginnen Sie damit, die Mini-Osmopumpe in einer sterilen Umgebung vorzubereiten.Zuerst halten Sie die Gehirninfusionskanüle mit einer Pinzette verkehrt herum. Anschließend geben Sie zwei Tropfen Cyanoacrylat-Klebstoff hinzu und führen eine Abstandsscheibe für die Arzneimittelfreisetzung in das Ventrikel ein. Danach schneiden Sie den Katheter auf 2,5 Zentimeter zu und verbinden ihn vorsichtig mit dem Flussmoderator.Danach, um die Bildung von Luftblasen zu verhindern, eine 2-Milliliter-Spritze, die mit einer Nadel verbunden ist, verwenden, um die Pumpe zu füllen, bis eine kleine Menge der Lösung aus der Pumpe austritt. Füllen Sie nun vorsichtig den Flussmoderator und den Katheter, wobei sichergestellt werden muss, dass sich keine Blasen im Inneren des Katheters befinden. Danach wird der Flussmoderator in die Pumpe eingesetzt.Nach dem Befüllen die Kanüle vorsichtig mit dem Ende des Katheters verbinden, die Pumpe in einen Behälter mit steriler Kochsalzlösung stellen und über Nacht bei 37 Grad Celsius belassen. Nach der Anästhesie des Tieres gemäß genehmigter Protokolle und Bestätigung der Anästhesie durch fehlende Reaktion auf einen Nadelhieb an der Hinterpfote das Tier in einen stereotaktischen Halter bringen. Die Augen mit einem schützenden Salbenfilm bedecken, um Austrocknung zu verhindern.Schneiden Sie außerdem das Fell über dem Kopf so dicht wie möglich an der Haut ab und reinigen Sie die Haut mit 70 Prozent Ethanol und einem Desinfektionsmittel mit antibakteriellen und fungiziden Eigenschaften. Öffnen Sie mit einem Skalpell einen etwa einen Zentimeter langen Schnitt leicht rechts der Mittellinie, legen Sie den Schädel frei und reinigen Sie ihn mit einem mit 70 Prozent Ethanol getränkten Wattestäbchen. Bringen Sie nach dem Positionieren des stereotaktischen Armes über dem Bregma den stereotaktischen Arm in die Koordinaten, um das Ventrikelziel zu erreichen.Markieren Sie diesen Punkt am Schädel. Bohren Sie vorsichtig mit dem Bohrer, der in einem Winkel von 45 Grad ausgerichtet ist, um unbeabsichtigte Schäden am Gehirn zu vermeiden. Bohren Sie mehrmals für einige Sekunden und überprüfen Sie anschließend die Tiefe der Bohrung.Beenden Sie das Bohren, sobald der Schädel verdünnt, aber noch nicht vollständig durchbrochen ist, und durchtrennen Sie dann die Hirnhäute mit der Spitze einer sterilen Nadel, bis der Zugang zum Gehirn frei ist. Führen Sie danach gerade Pinzette unter die Haut des Tieres in anterokaudaler Richtung ein und öffnen Sie mit der Pinzette den Unterhautraum im Rückenbereich des Tieres, in dem die Pumpe implantiert wird. Bringen Sie die Pumpe im Rücken des Tieres an, wobei Katheter und Kanüle außerhalb verbleiben.Bringen Sie vorsichtig vier kleine Tropfen Klebstoff an der Kanüle neben der Nadel an. Führen Sie nun die Nadel vorsichtig durch den Schädel, ohne sie seitlich zu bewegen. Halten Sie sie 15 bis 30 Sekunden lang in dieser Position, bis die Kanüle vollständig befestigt ist.Es ist wichtig, vorsichtig und präzise vorzugehen, wenn die Pumpe mit der Nadel eingeführt wird, und sicherzustellen, dass die Kanüle ordnungsgemäß am Schädel befestigt ist, um eine vollständige Abgabe über den gesamten Zeitraum zu gewährleisten, ohne dass das Tier die Vorrichtung entfernt. Anschließend einen Finger auf die abnehmbare Lasche legen und mit einer Schere am schmalen Teil abschneiden. Zum Schluss die Inzision mit einer 5-0-Naht verschließen und die geschlossene Inzision mit Povidon-Jod-Lösung desinfizieren.Bringen Sie das Tier in einen sauberen Käfig und überwachen Sie es, bis es die Brustlage wiedererlangt hat. Das Tier sollte während der Medikamentengabe einzeln untergebracht werden. Nachdem das Tier wie zuvor vorbereitet, anästhesiert und im stereotaktischen Rahmen positioniert wurde, öffnen Sie die Haut durch Durchtrennen des für die Pumpenimplantation verwendeten Einschnitts, halten Sie dann die Kanüle mit einer chirurgischen Klemme fest und ziehen Sie sie wie gezeigt heraus.Es sollte leicht aus dem Schädel entfernt werden können. Stoppen Sie jede Blutung, indem Sie einen mit Watte überzogenen Tupfer eine bis zwei Minuten lang auf die Stelle drücken. Greifen Sie den Katheter und entfernen Sie die Pumpe, indem Sie gleichzeitig am Katheter ziehen und die Pumpe wegdrücken.Nach dem Entfernen der Pumpe die Wunde wie zuvor verschließen und einige Tropfen Povidon-Jod auftragen. Das Tier in einen sauberen Käfig verbringen und überwachen, bis es sich bewegt. Zehn Tage nach der Entfernung der mini-osmotischen Pumpe das Tier anästhesieren, erneut in den stereotaktischen Halter zurückbringen und die Kopfwunde öffnen.Reinigen Sie den Schädel mit 70 Prozent Ethanol. Bringen Sie eine Fünf-Mikroliter-Glaskanüle korrekt im vertikalen Halter des stereotaktischen Geräts an. Richten Sie die Kanüle direkt über dem Bregma aus und bewegen Sie sie zu den gewünschten Koordinaten, um den motorischen Kortex zu injizieren.Markieren Sie diese Stelle mit einem Stift mit feiner Spitze. Bewegen Sie danach die Spritze zu der zweiten Stelle und setzen Sie dort eine kleine Markierung. Bohren Sie vorsichtig an beiden Stellen in den Schädel, wobei Sie den Bohrer in einem Winkel von 45 Grad halten.Auch hier nicht vollständig durch die Schädeldecke perforieren und die letzte Knochenpartie mit der Nadelspitze entfernen. Die Spritze mit 600 Nanolitern des Tracers füllen. Anschließend die Position der Nadel unter einem Winkel von 45 Grad auf der rechten Seite des Schädels justieren.Positionieren Sie die Nadelspitze unter dem chirurgischen Mikroskop direkt vor der Öffnung und führen Sie die Nadel dann bis zu einer Tiefe von 1,5 Millimetern ins Gehirn ein. Die gezeigte Geschwindigkeit dient nur Demonstrationszwecken. Normalerweise warten Sie zwischen jedem 0,5-Millimeter-Schritt 30 Sekunden.Lassen Sie die Nadel 30 Sekunden bis eine Minute lang an ihrer Stelle verbleiben. Wie Sie gesehen haben, erfolgt das Eindringen der Nadel während der Tracer-Injektion von der Mantelregion aus, um falsche Zielbereiche zu vermeiden, die zu verwirrenden Ergebnissen zwischen Individuen führen könnten. Ein langsames Entfernen der Nadel verhindert das Zurückfließen des Tracers.Danach injizieren Sie 300 Nanoliter Tracer in drei Schritten zu je 100 Nanoliter, wobei jeder Schritt durch ein Intervall von 30 Sekunden getrennt ist. Nach der letzten Injektion lassen Sie die Spritze 30 Sekunden bis eine Minute lang an ihrer Position, bevor Sie sie langsam zurückziehen. Positionieren Sie die Spitze der Spritze über dem zweiten Loch.Führen Sie die Nadel wie zuvor ein und wiederholen Sie die Injektion mit den verbleibenden 300 Nanolitern in der Spritze. Nach der zweiten Injektion ziehen Sie die Spritze zurück und verschließen die Wunde mit einer Fünf-Null-Naht. Stellen Sie das Tier erneut in einen sauberen Käfig und überwachen Sie es während der Erholung von der Narkose, bevor Sie es in den Aufzuchtraum zurückbringen.Den Tieren wurde eine 30-minütige Okklusion der mittleren Hirnarterie ausgesetzt, um eine Läsion im linken Striatum zu induzieren. Drei Tage später wurde rekombinantes humanes Erythropoietin über Mini-Osmopumpen über einen Zeitraum von 30 Tagen verabreicht. Cascade Blue wurde in die infarzierte Hemisphäre injiziert und biotinyliertes Dextranamin in die kontralaterale Hemisphäre injiziert.Die Fasern wurden bis zum Nervus-facialis-Kern verfolgt. Biotin-Dextran-Amin, das in den motorischen Kortex der kontralateralen Seite injiziert wurde, ist in den kortikobulbären Fasern nachweisbar. Die Fasern zu den ipsilateralen und kontralateralen Hemisphären wurden gezählt und als Prozentsatz der gesamten markierten Fasern im kortikospinalen Trakt angegeben.Erythropoietin erhöhte die Faserüberschneidungen in Richtung des kontraläsionalen Gesichtskerns. Das motorische Verhalten zeigte eine Verbesserung der Handgriffkraft im Vergleich zur präischämischen Ausgangsbasis nach Infusion von rekombinantem humanem Erythropoietin. Die motorische Koordination, bewertet mittels des Rotarod-Tests, war ebenfalls nach der Infusion von rekombinantem humanem Erythropoietin verbessert.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung pro chirurgischem Eingriff in weniger als 30 Minuten durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, während der Pumpenvorbereitung und während der Operation eine ausreichende Sterilität aufrechtzuerhalten, um Gehirninfektionen zu verhindern. Die Verwendung von anterograden und retrograden Tractus-Tracern ist eine sichere und kostengünstige Methode, die es ermöglicht, die Konnektivität des Gehirns sowohl im gesunden als auch im kranken Zustand zu verstehen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mini-Osmopumpen implantiert und entfernt sowie Tracer-Injektionen durchführt.

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Forschung

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Neurowissenschaften

Als neurowissenschaftliche Untersuchung wird immer anspruchsvoller, die Untersuchung von Hirnstrukturen und-Schaltung erfordert eine verbesserte Genauigkeit und eine höhere Auflösung. Wir haben ein Verfahren zur Herstellung und Implantation einer chronischen Infusion System im Gehirn unter Verwendung einer Borosilikat Mikrokanüle mit einer Spitze Durchmesser von 50 Mikrometer entwickelt.

Bau-und Implantation eines Mikroinfusion System für Nachhaltige Lieferung von Neuroactive Agents.

Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Abfolge der Ereignisse für multimodale Bildgebung von zellulären Transplantaten im Gehirn von Nagetieren mit: (i) In-vivo-Biolumineszenz-und Kernspintomographie, und (ii) post mortem histologische Analyse. Die Kombination dieser bildgebenden Verfahren auf einem einzigen Tier erlaubt zelluläre Transplantat Auswertung mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Spezifität.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

In diesem Video demonstrieren wir den Zusammenbau eines mikroosmotischen Pumpen-Gehirninfusionssystems, gefolgt von seiner chirurgischen Implantation in den Schädel der Maus. Dieses System ermöglicht die kontinuierliche Verabreichung potenzieller Medikamente und erleichtert die Untersuchung ihrer Auswirkungen auf das Gehirn und das Hirngewebe.

Kontinuierliches Medikamenteninfusionssystem im Mausmodell: Ein chirurgischer Eingriff zur Implantation eines mikroosmotischen Pumpeninfusionssystems in das Gehirn der Maus für eine kontinuierliche Wirkstoffabgabe

Quelle: Wang, X. et. al., Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Methode zur Verabreichung von Neurotherapeutika mit einer osmotischen Pumpe in einem demyelinisierten Mausmodell. Die kontrollierte Wirkstofffreisetzung fördert die Remyelinisierung, indem sie myelinproduzierende Zellen im Corpus callosum aktiviert.

 Osmotische Pump-basierte neurotherapeutische Wirkstoffabgabe in einem demyelinisierten Mausmodell

Hier präsentieren wir eine histologische Verfahren zur Erfassung, Kennzeichnung, optisch Löschen und Bildgebung des intakten Hirngewebe Schnittstelle um chronisch implantierten Microdevices im Hirngewebe von Nagern. Ergebnisse von den Techniken, die diese Methode sind nützlich für das Verständnis der Auswirkungen von verschiedenen durchdringenden Gehirn-Implantate auf ihre umliegende Gewebe.

Intact Histologische Charakterisierung von Brain-implantierten Microdevices und des umgebenden Gewebes

Osmotic Drug Delivery zu ischämischen Hinterbeine und Perfusion von Blutgefäßen mit Microfil für Mikro-Computertomographie

Ein chirurgisches Verfahren beschrieben, um die Schädel im ventralen Neugeborene Ratten aus. Mit diesem Ansatz ist es möglich, eine Kraniotomie, um akute Elektrophysiologie und der Zwei-Photonen-Mikroskopie Experimente im Hirnstamm von betäubten Jungtiere durchführen zu öffnen.

Eine Methode, um eine Kraniotomie auf der Bauch Schädel des Neugeborenen Nagetiere Stellen

Dieses Protokoll untersucht die Rolle der Chemokin (C-C-Motiv) Liganden 5 (CCL5) im Hypothalamus durch die Bereitstellung von Antagonist MetCCL5, in das Gehirn der Maus mit einem Mikro-osmotischen Pumpe Gehirn Infusion System. Diese vorübergehende Hemmung der CCL5 Aktivität unterbrochen Hypothalamus Insulin Signalisierung, Glukoseintoleranz und periphere systemische Insulinsensitivität führen.

Studium der Hypothalamus Insulin-Signal an peripheren Glukoseintoleranz mit einem kontinuierlichen Medikament Infusion System in das Gehirn der Maus

Konvektionsverstärkte Abgabe (CED) ist eine Methode, die eine effektive Abgabe von Therapeutika in das Gehirn durch direkte Perfusion großer Gewebevolumina ermöglicht. Das Verfahren erfordert den Einsatz von Kathetern und ein optimiertes Injektionsverfahren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik für CED eines Antikörpers in ein Maushirn.

Lieferung von Antikörpern in das Murine Gehirn über Konvektionsverstärkte Lieferung

Die Demyelinisierung findet bei multiplen Erkrankungen des zentralen Nervensystems statt. Eine zuverlässige In-vivo-Arzneimittelabgabetechnik ist für remyelinisierende Arzneimitteltests erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt eine osmotische pumpbasierte Methode, die eine langfristige Arzneimittelabgabe direkt in das Gehirnparenchym ermöglicht und die Bioverfügbarkeit des Arzneimittels verbessert, mit breiter Anwendung in der Remyelinisierungsforschung.

Osmotische pumpbasierte Wirkstoffabgabe für die In-vivo-Remyelinisierungsforschung am zentralen Nervensystem

Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erhöhung der Glukosekonzentration im Liquor cerebrospinalis (CSF) von Mäusen. Dieser Ansatz kann nützlich sein, um die Auswirkungen einer hohen Liquorglukose auf die Neurodegeneration, die Kognition und den peripheren Glukosestoffwechsel bei Mäusen zu untersuchen.

Osmotische Minipump-Implantation zur Erhöhung der Glukosekonzentration im Liquor der Maus

Lernen Sie die Implantation von miniosmotischen Pumpen zur kontinuierlichen Zufuhr therapeutischer Substanzen ins Gehirn und die anschließende Tract-Tracer-Injektion zur Analyse von Veränderungen der kortikospinalen Leitfähigkeit.

Die Implantation von miniosmotische Pumpen und Lieferung von Tract Tracer Brain Reorganisation in pathophysiologischen Bedingungen Studieren (Video) | JoVE Journal

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