Name: qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Lernen Sie die qPCRTag-Analyse für Hochdurchsatz-Genotypisierung synthetischer Hefe-Chromosomen mittels Echtzeit-PCR. Diese Methode ersetzt Gelelektrophorese und verkürzt den Arbeitsablauf auf etwa eine Stunde.

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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von der National Science Foundation Grants MCB-0718846 und Defense Advanced Research Projects Agency Contract N66001-12-C-4020 (zu JDB). LAM wurde durch ein Forschungsstipendium aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada finanziert. Veröffentlichung dieses Artikels wird von Roche gesponsert.

1. Bereiten Sie genomischer Hefe-DNA (gDNA) <ol><li> Wird eine Stamm von Hefelyse Puffer 9, die mit 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 1% SDS enthält (w / v), 2% Triton X-100 (v / v), 1 mM EDTA pH 8,0. </li><li> Als Ausgangsmaterial Gebrauch ~ 2 x 10 6 Zellen, die in der Regel entspricht ~ 100 ul gesättigter Kultur für Laborstämme der BY4741 10 Hintergrund. Kultivierten Zellen sollten durch Zentrifugation bei 1.000 × g für 3 min bei Raumtemperatur in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt werden. Saugen Sie den Überstand. </li><li> Fügen Sie 200 ul Hefe Lysis Buffer und Zellpellet durch Pipettieren. </li><li> Hinzuzufügen ~ 300 ul säuregewaschene Glasperlen, so dass das Niveau der Perlen beträgt etwa 1 mm unter der Ebene der Zellaufschlämmung. </li><li> Unter einem Abzug mit 200 ul Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (25: 24: 1). Verschließen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen und sicherzustellen, dass keine Kugeln werden zwischen der Kappe und dem Rohr stecken, da dies zu Undichtigkeiten beim Schütteln führen(Schritt 1.6). Invert 3 Mal zu mischen und zu überprüfen, die Kappe verschlossen. </li><li> Das Röhrchen wird 10 min bei Raumtemperatur unter Verwendung eines stationären Mischers, wie einer Eppendorf 5432. </li><li> Zentrifuge bei 20.800 g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Transfer 75 ul der wässrigen Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml 100% Ethanol. Kehren Sie 10-mal zu mischen. </li><li> Pellet die DNA durch Zentrifugation bei 20.800 xg für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand aspirieren ohne Verdrängen der DNA-Pellet. Mit 500 ul 70% Ethanol Waschen des Pellets. </li><li> Zentrifuge bei 20.800 g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand aspirieren ohne Verdrängen der DNA-Pellet und der Luft trocknen das Pellet mit dem Mikrozentrifugendeckel geöffnet, bis überschüssiges Ethanol verdampft ist, die in der Regel rund 10 min. </li><li> Resuspendieren der DNA-Pellet in 75 ul 10 mM Tris pH 7,4 und Vortex mischen. Bewahren Sie die Probe bei -20 ° C auf unbestimmte Zeit. Messung der DNA-Konzentration in der Probe unter Verwendung einesLaborcytometer Fluorimeter wie das Qubit, das DNA aus RNA unterscheidet. Sicherzustellen, dass die Endkonzentration von gDNA ~ 1-2 ng / ul. </li><li> Bereiten Sie eine 1:10 Verdünnung von genomischer DNA mit Wasser und Wirbel zu mischen. </li><li> Aliquote von 30 ul verdünnt gDNA in die entsprechende Vertiefung einer Quellenplatte, die mit einem nanoskaligen akustischen Flüssigkeitsspender (Schritt 3) kompatibel ist. Bei Verwendung eines Labcyte Echo 550, mit einem 384-Well-Polypropylenplatte (384PP Platte). HINWEIS: Wenn in geeigneter Weise versiegelt diese Platte für mindestens einen Monat bei -20 ° C gelagert werden. </li></ol> 2. Bereiten Sie und Dispense qPCR Master Mix in eine Multiwell-Platte 1536 <ol><li> Vorzubereiten 850 ul qPCR Mastermix wie LightCycler 1536 DNA Grün Master in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Vortex zu mischen. Zentrifugieren Sie die qPCR-Mastermix für 2 min bei 20.800 xg bei Raumtemperatur, um alle Luftblasen zu entfernen. Die Komponenten der qPCR-Mastermix für eine einzelne 1536 Multiwellplatte erforderlich sind wie folgts: <ol><li> Kombinieren Sie 170 ul der Enzym-Mastermix (Grün Meister Rohr 1, 5-fach konzentriert), 42,5 ul SYBR (Grün Meister Röhrchen 4, 20x konzentriert) und 637,5 ul Wasser. </li></ol></li><li> Dispense 500 nl / Vertiefung in eine 1.536 Multiwellplatte mit einem großen Flüssigkeitsspender, wie die Art Robbins Cobra. (Beachten Sie, dass 2.2.1-2.2.4 beziehen sich speziell auf die Cobra Schritte.) <ol><li> Erstellen Sie einen Ausgabeprogramm mit folgenden Einstellungen: flüssig Klasse, Wasser; absaugen Volumen, 800 &amp; mgr; l; Abgabevolumen, 500 nl; Waschzeit, 20 sec. In den Ausgabeeinstellungen, überprüfen die Ausgabegeschwindigkeit auf 49,6 mm / s eingestellt wird, ist die Abgabe Offset 0,25 mm, und die überschüssige aufgenommene Flüssigkeit wird auch wieder in die Quelle verzichtet werden. </li><li> Setzen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen, das die qPCR Mastermix in Vertiefung A1 des Mikrozentrifugenröhrchen Halter, die in Liegeposition 1 befindet, die Kappe des Mikrozentrifugenröhrchen Schneiden oder einfach offen lassen. Stellen Sie die &quot;Saugen Sie auch &#39;zu A1 durch Bearbeiten der aspirate-Einstellungen. </li><li> Führen Sie einen Waschschritt vor der Abgabe qPCR Mastermix von ersten Abwahl der ansaugen und abgeben Schritte des Programms in Schritt 2.2.2 zu setzen und dann schlagen Sie &quot;Ausführen&quot;. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie die Wieder ansaugen und abgeben Schritte vor dem Ausführen des vollständigen Programm zur qPCR Mastermix verzichten. Wenn der Cobra wurde im Leerlauf für weniger als 10 Minuten die anfängliche Waschschritt, der prime Systems dient, ist nicht notwendig. </li><li> Hit &#39;run&#39; bis qPCR Mastermix in jede Vertiefung zu verzichten. </li></ol></li><li> Sammeln Sie die qPCR Mastermix am Boden jeder Vertiefung durch kurze Zentrifugation von der 1536 Multiwellplatte (30 sec mit einem Low-Speed-PCR-Platte Spinner). </li></ol> 3. Geben Sie Template-DNA und Primer in die 1536 Multiwellplatte <ol><li> Verzichtet 5 nl verdünntem gDNA (Schritt 1.3) in die gewünschten Vertiefungen der Multiwellplatte 1536 unter Verwendung eines akustischen Flüssigkeitsübertragungssystem, wie das Echo 550. <ol><li> Für die Echo 550, verwenden Sie die Platte formatieren Software oder alternativ eine benutzerdefinierte Excel-Tabelle, um die Übertragung zu programmieren. Sicherstellen, dass die gewählte Quelle und für die gDNA in das Programm passt die Quelle auch in die Sie körperlich verzichtet haben die gDNA (Schritt 1.3). Quelle auswählen Plattentyp &#39;384PP_AQ_BP2&#39;, was anzeigt, die Flüssigkeit in dem 384PP Platte ein Puffer ohne Tenside. </li></ol></li><li> Verzichtet 10 nl Primer, vorwärts vorgemischt und umgekehrt zu einer Endkonzentration von jeweils 50 &amp; mgr; M zu den gewünschten Vertiefungen 1536 Multiwell-Platte unter Verwendung eines akustischen Flüssigkeitsübertragungssystem, wie das Echo 550. <ol><li> Für die Flüssigkeitsübertragungssystem, verwenden Sie die Platte formatieren Software oder alternativ eine benutzerdefinierte Excel-Tabelle, um die Übertragung zu programmieren. HINWEIS: Hier ist es möglich, Primer verzichtet werden, so dass das Layout auf dem 1536 Multiwellplatte entspricht der chromosomalen Reihenfolge der Primer so ist es einfach, eine Sichtprüfung, die Echtzeit-PCR-Ergebnissespäter (Schritt 6). </li><li> Fertigmischfutter der Primer in einer Platte, die mit der akustischen Flüssigkeitsspender kompatibel ist. Für das Echo 550, verwenden Sie ein Labcyte 384LDV (geringes Totvolumen) Platte und wählen Sie die Quellplatte Typ &#39;384LDV_AQ_B &quot;bei der Programmierung des Echo, um anzuzeigen, die Flüssigkeit ist ein einfacher Puffer ohne Proteine. </li></ol></li></ol> 4. Seal und die Centrifuge 1536 Multiwellplatte <ol><li> Verwendung eines Mikroplatten Versiegelsystem wie die PlateLoc Thermal Microplate Sealer, sofort abdichten 1536 Multiwellplatte mit optisch klare Dichtung, die mit der Heißsiegelgerät Instrument kompatibel ist. Die Oberfläche nicht berühren, der Dichtung zu Schmierflecken zu vermeiden. <ol><li> Bei Verwendung des Microplate Sealer PlateLoc Thermal, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: versiegeln Zeit 2,0 sec, Siegeltemperatur 162 ° C, Luftdruck 82 psi. Dieses Instrument nimmt ca. 5 min zu erwärmen und so sollte vorher eingeschaltet werden. </li><li> Bei Verwendung des Microplate Sealer PlateLoc Thermal, ein adapter verwendet, um die Höhe der 1536-Multiwellplatte auf der Bühne des Instruments zu erhöhen, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten. HINWEIS: Zwar ist es vorzuziehen, eine Bühnenplatte für die Thermal Microplate Sealer PlateLoc kaufen, ist eine alternative Lösung zu vier ~ 2 mm dick Standardscheiben erhältlich in jedem Baumarkt in den Ecken einfügen, um die Höhe der 1536 Multiwellplatte zu erhöhen. </li></ol></li><li> Die versiegelte 1536 Multiwellplatte sofort Zentrifugation bei 2.000 × g für 3 Minuten bei Raumtemperatur, um alle Reagenzien an der Unterseite jeder sammeln auch. </li></ol> 5. Real Time PCR <ol><li> Programm A 1.536 qPCR Instrument, wie dem LightCycler 1536 mit einem zweistufigen Amplifikationsprotokoll gefolgt von einer Schmelzkurvenanalyse. Mit Hilfe der LightCycler 1536 Software ein Programm einzurichten, wie folgt: <ol><li> Vorinkubation: 95 ° C, 1 min halten, Anstiegsrate 4,8 ° C / s, keine Übernahme. </li><li> Zwei-Schritt-Amplifikation: 30 Zyklen von [95 ° C, keine halten,Anstiegsrate 4,8 ° C / s, keine Übernahme; 64 ° C, 30 Sek halten, Anstiegsrate 2,5 ° C / s, Einzelaufnahme]. </li><li> Die Schmelzkurve: 95 ° C, 10 sec, Anstiegsrate 4,8 ° C / s, keine Übernahme; 60 ° C, 1 min, Aufheizgeschwindigkeit 2,5 ° C / s, keine Erfassung; 97 ° C, Anstiegsrate von 0,1 ° C / s, 5 Akquisitionen / ° C (Dauerbetrieb). </li><li> Cool: 40 ° C, 30 sec, Anstiegsrate 2,5 ° C / s, keine Übernahme. </li></ol></li><li> Stellen Sie die Erkennung Format zu &#39;Green Interkalationsfarbstoff &quot;in der Registerkarte Start Definition. </li><li> Setzen Sie die Pipettensteuer zu &quot;Master Control&quot; in der Registerkarte Start Definition. Diese Eigenschaft dient als interne Kontrolle und erkennt das Vorhandensein qPCR Mastermix in jede Vertiefung der Multiwell-Platte 1536, die nützlich für putative falsche Negative identifizieren. </li><li> Legen Sie die 1536 Multiwellplatte in Schritten 2-4 in den 1536 qPCR Instrument vorbereitet und das Programm auszuführen. </li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> Perform visuelle Inspektion der Daten innerhalb der qPCR Software. HINWEIS: Die 1536-Software ermöglicht die Visualisierung sowohl von Amplifikation und Schmelzkurven sowie einem Wärme zeigt den Aufruf (positiv, negativ, ungültig ist, N / A, Abbildung 2), der Kreuzungspunkt-Wert (Schiebefarbskala für positive oder grau für negative; Abbildung 3) oder ein Endpunkt Fluoreszenz (EPF) Wert (Schiebefarbskala). </li><li> Exportieren von Daten aus dem 1536 Software in Form einer TXT-Datei (Ergebnistabelle) oder .xml-Datei entweder mit den Rohdaten oder berechneten Daten für die Bearbeitung offline aus dem Instrument. HINWEIS: Die teilnehmerautomatisierten Kreuzungspunkt (Cp) Aufruf Algorithmus in die 1536-Software gebaut berücksichtigt die Form und Steigung der Verstärkungskurve, während die Bestimmung positiv / negativ und Cp Wert Anrufe mit hohen Vertrauen, bei niedrigen Untermikroliter Reaktionsvolumina mit vergleichsweise niedrigen Fluoreszenzwerte. </li><li> Wenn der LightCycler DNA Grün Meister war Gebrauchd für qPCR, sicherzustellen, dass alle Vertiefungen bestand die &quot;Master-Steuerung&quot;. A fail weist auf die auch nicht erhalten qPCR-Mastermix und der fehlenden Datenpunkt sollte als möglicher falsch negativ sein. Überprüfen Sie, dass alle Vertiefungen bestand die &quot;Master-Steuerung&quot;. A fail weist auf die auch nicht erhalten DNA Mastermix und betrachten den fehlenden Datenpunkt ein Potential falsch negativ. </li></ol>

<ol><li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li>
<li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li>
<li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+6000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li>
<li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li>
<li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li>
<li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-A-Gene+with+GeneDesign%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li>
<li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li>
<li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome%3A+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li>
<li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li>
<li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C%3A+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li>
</ol>

LAM, NAP, Marmelade und JDB haben nichts zu offenbaren. RC und AL werden von Roche Life Science beschäftigt, den USA und arbeitete an der Entwicklung der Anwendung mit LAM als Teil eines proof of principle experiment.

Der Einbau von Echtzeit-PCR-Nachweis in den PCRTag Genotypisierungsassay ist eine wichtige Entwicklung für die Sc2.0 Projekt, da es ermöglicht deutlich höhere Durchsatzleistung. Der bisherige Workflow angegebenen 2,5 ul Reaktionen in 384-Well-PCR-Platten, 1,5 h Temperaturwechsel Laufzeit, Agarose-Gelelektrophorese, und manuelle Annotation des Gels. Die hier vorgestellte Workflow, genannt qPCRTag Analyse überwindet mehrere große Engpässe. Zunächst kondensiert ein qPCRTag Lauf 4 x 384-Well-Platten in einem einzigen Experiment die verarbeitet werden können, von Anfang bis Ende (Platte eingerichtet und Laufzeit), in etwa eine Stunde. Es ist wichtig zu beachten, dass die Kosten pro Reagenz gut für qPCRTag Analyse ist auf Augenhöhe mit dem geringeren Durchsatz Agarose-Gel-basierten Ansatz. Unter Umgehung Gelelektrophorese und manuelle Annotation, bietet jedoch die qPCRTag Workflow erhebliche Einsparungen bei Zeit und Arbeit, die die wichtigsten Vorteile sind. Wichtig ist die qPCRTag Workflow entirely kompatibel mit Automatisierung. Ein Hauptproblem bei der Verwendung von Echtzeit-Erkennung als die Ausgabe des PCRTag Assay ist die Rate der falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse. Da die PCRTag Primer wurden ursprünglich nicht für die Verwendung in Echtzeit-PCR entwickelt, wird erwartet, dass nicht alle Primerpaare für die Verwendung mit diesem Ausgang geeignet. Zu diesem Zweck ist es wichtig, die Funktion und Spezifität aller PCRTag Primerpaare zu validieren, um die Untergruppe, die nicht in den Echtzeit-basierten Assay vorne nicht funktionieren auszuschließen. Zum Beispiel sind Chromosom 3 PCRTag falsche Positive und Negative nach und große reproduzierbar in der Echtzeit-PCR-Daten (Abbildungen 2 und 3) und diese können von weiteren Analysen ausgeschlossen werden. Ferner Primerpaare bekannt fehl (durch Gelelektrophorese bewertet und in den Fig S6 und S7 von Annaluru et al. 1 gezeigt) kann ebenfalls ausgeschlossen werden. Dies ist leicht einfach erreicht excluding die fehlerhaften Primerpaare bei der Einrichtung des akustischen Übertragungsprotokoll. Wie die meisten Assays mit hohem Durchsatz, beabsichtigen wir, Echtzeit PCRTag Erkennung als primären Bildschirm verwenden, um Transformanten, die weiter stromabwärts Validierung verdienen zu identifizieren. Anschließend wird der Goldstandard für sekundäre Screening PCRTag Analyse mit Gelelektrophorese als Auslese bleiben. Über die Anwendung der PCRTag Analyse für Sc2.0, die Kombination von state-of-the-Art nanoskaligen Liquid-Handling-Systeme mit hohem Durchsatz Echtzeit-PCR-Technologie ermöglicht eine schnelle und automatisierte Analyse und hat das Potenzial, viele Bereiche auswirken. Beispielsweise könnte dieser Workflow, um einen hohen Durchsatz-Bibliothek-Screening, Infektionskrankheiten Diagnose, microbiome Analyse und innovative Genom Bearbeitung angewendet werden Ansätze versucht, mehrere Loci gleichzeitig ändern.

Sc2.0 oder synthetische Hefe-Genom-Projekt ( <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org</a> ) hat sich zum Ziel gesetzt, entwerfen und bauen eine völlig synthetische eukaryotische Genom gesetzt. Unter Verwendung des hoch kuratiert Genomsequenz von Saccharomyces cerevisiae 3 als Ausgangspunkt, jeder der sechzehn lineare Chromosomen wurde neu entwickelt, um eine Reihe von Design-Prinzipien, die Aufrechterhaltung der Zell Fitness, Verbesserung der Genomstabilität und Erhöhung genetische Flexibilität angeben erfüllen. Zum Beispiel sind destabilisierende Elemente wie Wiederholungen von Sc2.0 Chromosomen gelöscht. Alle Instanzen TAG Stopcodons an TAA umcodiert zu &quot;frei&quot; ein Codon in der endgültigen Belastung für die Einführung von nicht genetisch codierte Aminosäure. Zusätzlich eine induzierbare Evolution System, Scramble, durch die Cre-lox-System aktiviert ist, ermöglicht beispiellose Fähigkeit, derivative Genome mit neuartigen Strukturen 4 zu erzeugen. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Eine weitere große Design-Element in Sc2.0 Genom ist die Einführung von PCRTags, die als DNA Wasserzeichen dienen der Verfolgung von synthetischen und Wildtyp-DNA zu ermöglichen. PCRTags sind kurz, re-codierten Segmente in ORFs auf synthetischen Chromosomen; während die PCRTag Sequenzen sich auf DNA-Ebene zwischen synthetischen und Wildtyp-Chromosomen sind die kodierten Proteine ​​in der Aminosäuresequenz und daher vermutlich Funktion identisch. PCRTag Sequenzen spezifisch als Primerbindungsstellen zur selektiven Amplifikation (Figur 1A) erleichtert gestaltet. PCRTag Entwurf wird unter Verwendung des &#39;unterschiedlichsten&#39; Algorithmus in GeneDesign 5,6 durchgeführt, wodurch man umcodiert synthetische Sequenzen, die in der Regel ca. 60% anders als die nativen Sequenzen (mindestens 33%) mit Schmelztemperaturen zwischen 58 ° C und 60 ° C und sind Amplicon Längen zwischen 200-500 Basenpaaren 2. Neukodierung nicht innerhalb der ersten 100 bp jedes ORF erlaubt, da diese Bereiche mit bekanntenhaben spezielle Einstellungen in Bezug auf die Codon-Nutzung 7. Gemeinsam begünstigen diese Designregeln Hochleistungs fast aller PCRTags unter einem einzigen Satz von PCR-Bedingungen, bei denen synthetische und Wildtyp PCRTag Primerpaare ausschließlich zu binden und zu verstärken, synthetische und native DNA, bzw. (1B). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> Abb. 1: schematische PCRTag (A) PCRTags neu kodiert Sequenzen innerhalb offenen Leserahmen (ORF) der Gene auf Sc2.0 Chromosomen. (B) synthetische (SYN) und Wildtyp (WT) PCRTag Primer ausschließlich zu binden und zu verstärken und synthetischen Wildtyp-Genom-DNA (gDNA) sind. Dargestellt ist hier eine Analyse einer ~ 30 kb-Segment des linken Arms von Chromosom sechs Testen dreizehn PCRTag Primerpaare entweder mit WT oder halb synVIL2 gDNA als Template. In vielen Fällen wird ein einziges ORF codiert für mehr als eine PCRTag. Vorhandensein / Fehlen PCRTag Amplikons über Agarose-Gelelektrophorese beurteilt. PCRTag Amplikons in der Größe von 200 bp auf 500 bp. Die schneller wandernden Spezies an der Unterseite der Platten sind Primerdimere. PCRTag Analyse hat sich als ein wichtiges Werkzeug bei der Montage der Sc2.0 Chromosomen. In einem typischen Experiment 30-50 kb synthetischer DNA, 20-30 PCRTags codiert, wird in Hefezellen transformiert, um die entsprechenden Wildtyp-DNA-1,2,8 ersetzen. PCRTag Analyse wird dann verwendet, um Transformanten, die synthetische, aber nicht Wildtyp PCRTags überspannt das Segment der DNA kodieren zu identifizieren, oder so genannte &quot;Gewinner&quot;. Es ist normalerweise notwendig, mehrere Trans testen &quot;Gewinner&quot; identifizieren, so dass der Durchsatz und die Kosten der PCRTag Analyse sind wichtige Überlegungen. Derzeit sind zwei Sc2.0 Chromosomen sind abgeschlossen (synIII 1 und synIXR 2), die weniger als 10% des Genoms Sc2.0, although mehr als die Hälfte der übrigen Chromosomen befinden sich derzeit in der Synthese und Montage. Die Skala der PCRTag Analyse für dieses Projekt erforderlich ist schnell übertraf die Fähigkeit, Gele laufen und manuell punkten die Anwesenheit von synthetischen DNA-und Abwesenheit von Wildtyp-DNA. Um den Durchsatz des PCRTag Test haben wir einen Workflow mit Echtzeit-PCR, die Verwendung von Agarose-Gelelektrophorese umgehen entwickelt zu verbessern. Der Arbeitsablauf macht Gebrauch von einer großen Flüssigkeitsspender zur qPCR Mastermix in jedes Well einer Multiwell-Platte 1536, ein nanoskaliges akustischen Flüssigkeitsspender zur Matrizen-DNA und Primer übertragen zu verteilen, und eine 1.536 qPCR Thermocycler, so dass wir, um Reaktionen zu 500 nl miniaturisieren und Durchsatz zu maximieren. Außerdem Analyse automatisiert werden kann. Diese Art von Hochdurchsatz-Genotypisierung Protokoll sollte verallgemeinerbar für jedes Projekt Analyse vieler Klone erfordern an mehreren Loci sein.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Hefe gDNA Vorbereitung</td></tr><tr><td>Hefe gDNA</td><td>benutzerdefinierte</td><td></td><td>Vorlage für Echtzeit-PCR</td></tr><tr><td>Säuregewaschene Glasperlen (0,5 mm)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>Hefezelllyse</td></tr><tr><td>Ultrareines Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1, v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>Hefezelllyse</td></tr><tr><td>5432 Mischer</td><td>Eppendorf</td><td>5432</td><td>Hefezelllyse</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td>Hefezelllyse</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td>gDNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>gDNA-Quantifizierung</td></tr><tr><td>Labcyte 384PP Platte</td><td>Labcyte</td><td>P-05525</td><td>gDNA-Quellplatte</td></tr><tr><td colspan="4">DNA Green Mastermix Vorbereitung und Dispensing</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 DNA Green</td><td>Roche</td><td>5573092001</td><td>real time PCR Mastermix</td></tr><tr><td>1,5 ml Microfuge Tube Holder</td><td>ARI</td><td>EST BD060314-1</td><td>Microfuge Tube Holder für das Deck von Cobra</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td><td>Roche</td><td>5358639001</td><td></td></tr><tr><td>Cobra Liquid Handling System</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>630-1000-10</td><td>Dispense qPCR Mastermix in 1536</td></tr><tr><td>Platte PCR Plate Spinner</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>Zenrifugation von 1536 Platte</td></tr><tr><td colspan="4">Schablonen- und Primer-Dispensing</td></tr><tr><td>PCRTag Primer</td><td>IDT</td><td>kundenspezifisch</td><td>vorgemischt Vorwärts und Rückwärts, 50 &mu; M Stück</td></tr><tr><td>TempPlate durchstechbare Versiegelungsfolie, steril</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td>temporäre Versiegelung für PCRTag Primerplatten</td></tr><tr><td>Labcyte LDV 384 Well-Platte</td><td>Labcyte</td><td>LP-0200</td><td>vorgemischte Primer Source</td></tr><tr><td>Plate Echo 550 Liquid Handler</td><td>Labcyte</td><td></td><td>Transfer von 2,5 nl Tropfen Primer und Template-DNA in 1536</td></tr><tr><td>Platte Plateloc Thermal Microplate Sealer</td><td>Agilent</td><td>G5402-90001</td><td>Heißsiegel für 1536 Platte vor dem LC1536 Lauf</td></tr><tr><td>Clear Permanent Seal</td><td>Agilent</td><td>24212-001</td><td>optisch klare Heißsiegel für LC1536 Multiwell-Platte</td></tr><tr><td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage</td><td>Agilent</td><td>G5402-20008</td><td>kann ~2 mm dicke Unterlegscheiben ersetzen</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo Scientfic</td><td>75-004-521</td><td>Zentrifuge heißversiegelte 1536 Platte</td></tr><tr><td>Industrieller Luftkompressor</td><td>Jun Air</td><td>1795011</td><td>für den Betrieb des Echo- und Heat Sealer</td></tr><tr><td colspan="4">Real Time PCR</td></tr><tr><td>LightCycler 1536</td><td>Roche</td><td></td><td>benötigt eine 220-V-Steckdose</td></tr></tbody></table>

qpcrtag analyse - ein hoher durchsatz, echtzeit-pcr-assay für sc2.0 genotyping

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Die synthetische Hefe-Genom-Projekt (Sc2.0) zielt darauf ab, 16 Designer Hefechromosomen aufbauen und kombinieren sie zu einem einzigen Hefezelle. Einem synthetischen Chromosom, synIII 1, und ein synthetisches Chromosomenarm, synIXR 2 stammen, wurden konstruiert, und ihre in vivo-Funktion in der Abwesenheit von den entsprechenden Wildtyp-Chromosomen validiert. Ein wichtiges Designmerkmal Sc2.0 Chromosomen ist die Einführung von PCRTags, die kurze, re-kodierten Sequenzen innerhalb offenen Leserahmen (ORFs), die Differenzierung von synthetischen Chromosomen von ihren Wildtyp-Gegenstücke ermöglichen sind. PCRTag Primer lagern selektiv entweder synthetischen oder Wildtyp-Chromosomen und der Gegenwart / Abwesenheit jeder Art von DNA kann unter Verwendung eines einfachen PCR-Assay getestet werden. Die Standard Auslesen des PCRTag Assay ist, um die Anwesenheit / Abwesenheit des Amplicons durch Agarose-Gelelektrophorese beurteilt. Jedoch mit einer durchschnittlichen PCRTag Amplikon Dichte von einem pro 1,5 kb und agenome Größe von ~ 12 Mb, wird die fertig Sc2.0 Genom rund 8.000 PCRTags kodieren. Um den Durchsatz zu verbessern, haben wir eine Echtzeit-PCR-basierten Nachweistest für PCRTag Genotypisierung, die wir qPCRTag Analyse nennen entwickelt. Der Arbeitsablauf gibt 500 nl Reaktionen in einer Multiwellplatte 1536, so dass wir mit sowohl synthetische als auch Wildtyp-Primerpaare in einem einzigen Experiment testen, bis zu 768 PCRTags.

Wir testeten synthetischen und Wildtyp-Chromosom 3 PCRTag Primerpaare 1 mit genomischer Hefe-DNA (gDNA) aus vier verschiedenen Stämmen extrahiert. Chromosom 3 hat 186 PCRTag Primerpaare, die die Länge des Chromosoms überspannen (synIII ist ~ 270 kb und Wildtyp-Chromosom 3 ~ 315 kb). Zu jeder der vier Stämme mit beiden Sätze von Primern zu testen, teilten wir die Multiwellplatte in vier Quadranten, eine für jede Art von gDNA, Zuweisen synthetischen PCRTag Primer an der oberen Hälfte jedes Quadranten und Wildtyp auf der unteren Hälfte. Genomische DNA wurde aus den Hefestämmen, von denen zwei zu kodieren Wildtyp-Chromosom 3 (Wildtyp, synIXR 2) extrahiert, während die übrigen zwei kodieren synthetischen Chromosom 3 (synIII 1, synIII synIXR). qPCR Mastermix wurde mit einem großen Flüssigkeitsspender, gefolgt von gDNA und PCRTag Primer mit den Echo 550. Die Primer wurden identisch in aufgereiht in jede Vertiefung einer Multiwell-Platte 1536 abgegebenjeder Quadrant der Multiwellplatte für einfachen visuellen Vergleich. Die Multiwell-Platte wurde dann Hitze mit optisch klare Dichtung abgedichtet und auf Echtzeit-PCR-Analyse unterzogen. In diesem qPCRTag Experiment beobachteten wir, zum größten Teil, Verstärkung, wie erwartet, wobei ausschließlich synthetische Primer amplifiziert synthetische DNA und umgekehrt (Figuren 2 und 3). Allerdings beobachteten wir auch einige Abweichungen von dem erwarteten Muster, was darauf hindeutet, falsch-negative und falsche Positive in der Datenmenge. In diesem Experiment wurde die Mastersteuerung in 100% der Vertiefungen nachgewiesen, was auf die großen Flüssigkeitsspender erfolgreich in jede Vertiefung der Platte verzichtet Mastermix (Daten nicht gezeigt). Dies schließt eine mögliche Quelle für falsche Negative. Zusätzlich werden einige Chromosom 3 PCRTags bekannt fehl (in den Figuren gezeigt S6 und S7 von Annaluru et al. 1), darunter mindestens 2 SYN und 1 GewPrimerpaare; somit können diese Vertiefungen kann in jedem Quadranten ignoriert. Wahr falsch negative könnte aus einem Mangel an Transfer von template gDNA oder Primer in unserer Erfahrung ergeben sich jedoch angesichts der korrekten Kalibrierung von der Echo 550 sowie die Vorbereitung von gDNA und Primern, wie beschrieben, ist dies nicht eine Hauptfehlerquelle. Insgesamt in diesem Experiment die falsch-negative Rate war für WT Primer mit WT-Vorlage (~ 2%), obwohl für SYN SYN Primer mit DNA (~ 8%) etwas höher extrem niedrig. False Positives, die Erkennung von Signal in Brunnen, wo SYN Primer werden mit WT gDNA (und umgekehrt) gemischt werden, kann von Querverstärkung oder Primer-Dimere entstehen. Tatsächlich sind Primerdimere oft durch Gelelektrophorese (1B) sichtbar sind und eine angemessene Fehlerquelle. Für die Anwendung der qPCR kann die Untersuchung der Schmelzkurven von Nutzen sein, um zu bestimmen, ob verschiedene Arten, wie Primer-Dimere, in ein Signal beitragen. Ferner performing ein Kontrollexperiment, wobei Primer in Abwesenheit von Template-DNA entfallen kann zur Identifizierung von Primern mit einer Neigung zu dimerisieren. Quer Amplifikation durch Gelelektrophorese beobachtet werden, insbesondere, wenn zu viele PCR-Zyklen durchgeführt werden, oder wenn die Glühtemperatur zu niedrig ist. Wir haben durch die Optimierung dieser beiden Parameter für die qPCRTag Protokoll versucht, die Anzahl an Fehlalarmen zu minimieren durch Querverstärkung. Schließlich Prüfung der Übergangsstelle (Cp) Werte für jede Vertiefung kann dazu beitragen, Primer, die nicht in Echtzeit-basierte Erkennung geeignet sind (Abbildung 3, zum Beispiel BB22, Fb22, BB46, FB46). Insgesamt in diesem Experiment die False Positive Rate war gering für SYN-Primer mit WT-Vorlage (~ 5%) und höher für WT Primer mit SYN-Vorlage (~ 10%). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> Abbildung 2: Plattenwärme Karte Anzeigen Gegenwart / absence halber qPCRTag Experiment. Vier verschiedene Typen von genomischer DNA (Quadranten durch feste weiße Linien getrennt) wurden unter Verwendung von synthetischen (SYN) zu PCRTag Analyse unterzogen und Wildtyp (WT) Chromosom 3 PCRTag Primer (gestrichelte weiße Linien zu trennen SYN (top ) und WT (unten) in jedem Quadranten). WT und synIXR gDNA kodieren Wildtyp-Chromosom 3, wodurch Amplifikation mit WT PCRTag Primer. SynIII und synIII synIXR gDNA kodieren synthetischen Chromosom 3, wodurch Amplifikation mit SYN PCRTag Primer. Primer werden nach ihren links-nach-rechts chromosomalen Positionierung angeordnet und in den vier Quadranten zum Vergleich positioniert identisch. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> Abbildung 3: PlattenwärmeKarte Anzeigen Kreuzungspunkt (Cp) Wert für eine qPCRTag Experiment. Das ist die gleiche Datenmenge wie in Abbildung 2 und die Platte Layout ist daher identisch. N / A bezieht sich auf &quot;keine Verstärkung.&quot; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Designer-Chromosomen des Synthetic Yeast Genome-Projekts, Sc2.0, können von ihren nativen Gegenstücken mit Hilfe eines PCR-basierten Genotypisierungsassays namens PCRTagging unterschieden werden, der einen Anwesenheits-/Abwesenheitsendpunkt hat. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Echtzeit-PCR-Nachweismethode für die PCRTag-Genotypisierung.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Das übergeordnete Ziel der QPCR-TAG-Analyse besteht darin, die Durchsatzleistung des PCR-TAG-Genotypisierungsassays im Rahmen des synthetischen Hefegenomprojekts durch die Implementierung eines Echtzeit-PCR-basierten Nachweissystems und miniaturisierter Reaktionen zu verbessern. Dies wird zunächst erreicht, indem ein Bulk-Flüssigkeitsdispenser die QPCR-Master-Mix-Lösung in jede Vertiefung einer 1536er-Mehrfach-Well-Platte abgibt. Anschließend überträgt ein akustischer Nanodrop-Transferroboter mithilfe von Tröpfchen-Ejektion die Vorlagen-DNA und die Primer in die Vertiefungen der Mehrfach-Well-Platte.Dann wird die Platte versiegelt und die Reaktionen im A-Q-P-C-R-Thermocycler durchgeführt. Schließlich werden die Echtzeit-PCR-Daten analysiert, um das Vorhandensein oder Fehlen synthetischer oder wildtypischer PCR-Marker an jedem Locus zu bestimmen. Letztendlich verbessert der QPCR-Marker-Arbeitsablauf den Durchsatz.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber dem derzeitigen PCR-TAG-Assay besteht darin, dass wir die Verwendung der Gelelektrophorese und die manuelle Annotation dieser Gele umgehen können. Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir erkannten, wie zeitaufwendig und arbeitsintensiv das PCR-Tagging an längeren Chromosomen werden würde. Nach dem Kultivieren und Sammeln von etwa 2 Millionen Hefezellen fügen Sie 200 Mikroliter Hefe-Lysepuffer hinzu und pipettieren Sie, um sie wieder aufzusuchen.Zugeben Sie dem Pellet etwa 300 Mikroliter säuregewaschene Glaskügelchen, bis diese etwa einen Millimeter unterhalb der Zellebene liegen, verschwommen. Dann geben Sie in einem Abzug 200 Mikroliter Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zu, drehen das Röhrchen dreimal um, um es zu mischen, und prüfen Sie, ob der Verschluss dicht ist. Anschließend schütteln Sie das Röhrchen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in einem Laborvortex. Nach der Zentrifugation übertragen Sie 75 Mikroliter der wässrigen Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, das ein Milliliter 100 %igen Ethanol enthält.Drehen Sie das Röhrchen nach erneutem Zentrifugieren 10-mal um, um es zu mischen, saugen Sie den Überstand ab, ohne das Pellet zu lösen, und waschen Sie das Pellet mit 500 µL 70 %igem Ethanol. Nach dem Entfernen des Überstands lösen Sie das Pellet in 75 µL 10 mmolar Tris pH 7,4 auf und wirbeln Sie es zur Vermischung. Verdünnen Sie die DNA im Verhältnis 1:10 und pipettieren Sie 30 µL der verdünnten gDNA in das entsprechende Well einer Quellplatte für die nanoskalige akustische Flüssigkeitsdosierung.Bereiten Sie 850 Mikroliter QPCR-Mastermix in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor und wirbeln Sie den Ansatz, um ihn zu mischen. Zentrifugieren Sie dann die Lösung bei 20.800 ×g und Raumtemperatur für zwei Minuten, um eventuelle Bläschen zu entfernen. Geben Sie anschließend mithilfe eines Bulk-Dispensers 500 Nanoliter pro Vertiefung in eine 1536-Mehrfach-Well-Platte ab.Sammeln Sie die QPCR-Master-Mix-Lösung am Boden jedes Wells durch kurzes Zentrifugieren der Platte. Danach geben Sie mithilfe des akustischen Flüssigkeits-Transfersystems und gemäß den im Textprotokoll beschriebenen Angaben jeweils fünf Nanoliter verdünnte GDNA und 10 Nanoliter einer 50 Mikromolar vormischten Lösung aus Vorwärts- und Rückwärtsprimern in die gewünschten Wells der Mehrfach-Well-Platte. Die akustische Tropfen-Technologie verwendet Schallwellen, um kleine Flüssigkeitsmengen vertikal von einer Quellplatte auf eine umgedrehte Zielplatte zu übertragen.Hier werden Vorlage, DNA und Primer in Vielfachen von 2,5 Nanoliter-Tropfen in die Vertiefungen einer 1536-Mehrfach-Platte übertragen, um die QPCR-Tag-Reaktionen vorzubereiten. Anschließend verschließen Sie die 1536-Mehrfach-Platte unverzüglich mit einer optisch klaren Dichtfolie und einem Mikroplatten-Versiegelungssystem.Zentrifugieren Sie die verschlossene Platte sofort bei 2000 G und Raumtemperatur für drei Minuten, um alle Reagenzien am Boden der Vertiefung zu sammeln, um das Echtzeit-PCR-Programm auf dem QPCR-Gerät gemäß den Anleitungen im Textprotokoll durchzuführen, und starten Sie das Programm, sobald es bereit ist. Überprüfen Sie, ob alle Vertiefungen die Hauptkontrolle bestanden haben, was anzeigt, dass die QPCR-Master-Mix-Lösung in der Vertiefung nachgewiesen wurde. Jede Vertiefung, die die Kontrolle nicht besteht, stellt einen potenziellen falsch-negativen Datenpunkt dar.Zur Datenanalyse die Daten visuell innerhalb der QPCR-Software prüfen und/oder die Daten zur Offline-Verarbeitung vom Gerät exportieren. In diesem Experiment wurden Primerpaare für Wildtyp- und synthetische Chromosom-drei-PCR-Marker mit aus Hefe gewonnener gDNA getestet, die aus vier verschiedenen Stämmen stammte. Zwei mit Wildtyp-Chromosom drei und zwei, die ein synthetisches Chromosom tragen.Drei wie erwartet synthetische Primer amplifizierten im Allgemeinen synthetische DNA und nicht Wildtyp-DNA. Ebenso erzeugten Wildtyp-Primer Amplifikate ausschließlich aus Wildtyp-DNA. Das Auftreten einer geringen Zahl falsch positiver und falsch negativer Ergebnisse ist erwartungsgemäß, und mögliche Ursachen dieser Fehler werden im begleitenden textbasierten Protokoll beschrieben.Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie von Anfang bis Ende in etwa einer Stunde abgeschlossen werden. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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