Microbead Implantation im Zebrafischembryo

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe der Implantation von Mikroperlen gezielte Veränderungen im lokalen Gewebemilieu zu bestimmten räumlichen und zeitlichen Zeitpunkten während der Embryogenese von Zebrafischen herbeizuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Implantationsschale für die Perlen vorbereitet wird, um ein präzises Handhaben und Einbringen der Mikroperlen zu ermöglichen. Als zweiter Schritt werden die Zebrafischeier bis zum gewünschten Entwicklungsstadium inkubiert.

Die Mikroperlen werden anschließend in den geeigneten experimentellen Lösungen vorbereitet und vorsichtig an die gewünschte Position innerhalb des Embryos übertragen. Letztendlich kann die Implantation von Mikroperlen durchgeführt werden, ohne die normale Entwicklung von Zebrabärblingen zu stören, wodurch die Wirkung der Moleküle von Interesse auf die Embryogenese des Zebrabärblings bewertet werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen des Fachgebiets der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise wie unterschiedliche Moleküle den Prozess der Organogenese beeinflussen.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da es Übung erfordert, um geschickt im Umgang mit den Mikroperlen zu werden. Um das Implantatetablett für Mikroperlen vorzubereiten, erwärmen Sie zunächst frisch hergestellte 2%aro-Lösung 90 Sekunden lang. Dabei wird in einem 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben alle 30 Sekunden geschwenkt, um zu verhindern, dass das Gel überkocht.

Als Nächstes wird der Deckel einer 60 × 15 mm großen Petrischale mit der Innenseite nach oben in eine 150 × 15 mm große Schale gelegt. Danach wird der Deckel der kleineren Petrischale mit einem Zeigefinger fixiert. Anschließend wird das heiße Agarose-Gel in die größere Schale gegossen.

Lassen Sie eine dünne Agarose-Schicht unter dem kleineren Deckel entstehen, um die Bildung von Kondensat zu verhindern und die Perlen unter dem Mikroskop besser sichtbar zu machen, während die Agarose abkühlt. Bevor sie jedoch erstarrt, kippen Sie langsam eine Vertiefungsform auf die Oberseite des Gels, um eine einfachere Platzierung der Embryonen zu ermöglichen. Sobald das Gel erstarrt ist, entfernen Sie vorsichtig die Vertiefungsform mit einem Mikrospatel.

Geben Sie dann die Lösung E drei auf die Petrischale und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Um die Zebrafisch-Embryonen zu gewinnen, füllen Sie eine Paarkammer mit Systemwasser. Stellen Sie dann einen Trennsteg in die Mitte der Kammer und geben Sie erwachsene männliche und weibliche Zebrafische auf die entsprechenden Seiten der Kammer.

Am nächsten Morgen sammeln Sie die befruchteten Eier mithilfe eines feinen Siebs aus Metalldraht. Drehen Sie das Sieb in einer sauberen 10 cm großen Petrischale um und spülen Sie das Netz mit einem feinen Strahl von E3, bis keine Eier mehr im Sieb sind und sich etwa 25 Milliliter E3-Lösung in der Schale befinden. Anschließend verteilen Sie die Eier auf mehrere Schalen mit jeweils 50 bis 60 Eiern pro Schale, um eine Überbelegung zu vermeiden, und inkubieren die Eier in E3-Lösung bei 28,5 Grad Celsius. Vor der Implantation der Mikroperlen inkubieren Sie sie für den geeigneten Zeitraum in dem entsprechenden Volumen des Testmoleküls der interessierenden Substanz oder des Kontrollansatzes.

Dann, wenn die Embryonen den gewünschten Entwicklungszeitpunkt erreicht haben, entfernen Sie mit feinen Pinzetten deren Kons und inkubieren die Zebrabärte in gefilterter Ringer-Lösung, die mit Antibiotika ergänzt wurde, während die Embryonen sich 10 Minuten lang akklimatisieren. Überführen Sie die Mikroperlen in die zuvor vorbereitete Mikroperlenplatte, die sich in der Implantationsschale befindet, und spülen Sie die Perlen und die Ringer-Lösung 10 Minuten lang aus.

Innerhalb von 50 Minuten nach dem Waschen der Perlen, das Array einzeln innerhalb der Vertiefung des Implantationsträgers, sodass der Bereich für die Mikroperlen-Implantation zugänglich ist. Mit einer Wolframnadel einen kleinen Einschnitt am Embryo vornehmen, dann den Kolben einer Mikrokapillar-Transferpipette zusammendrücken, um vorsichtig eine Mikroperle in die Kapillarsäule zu ziehen, und anschließend den Druck lösen, um die Mikroperle in den Implantationsträger abzugeben, wodurch die Handhabung der Mikroperle erleichtert wird. Die Perle vorsichtig eindrücken, damit sie in die Ringer-Lösung innerhalb der Form eintaucht.

Verwenden Sie dann die Mikronadel, um die Mikrokügelchen auf den Embryo und in den Einschnitt zu bewegen. Schließlich benutzen Sie das Haar-Werkzeug, um die Mikrokügelchen von der Einschnittstelle wegzubewegen, damit die Kugel beim Heilungsprozess nicht ausgestoßen wird. Der Erfolg der Mikrokügelchen-Implantation kann anschließend unmittelbar am Stereomikroskop beurteilt werden, da die Kugel stabil in dem Gewebe verbleibt.

In diesem Experiment wurden einzelne Mikroperlen zweier unterschiedlicher Größen, die lediglich mit Ringer-Lösung gespült wurden, in Zebrafischembryonen im Schwanzknospen-Stadium oder zu späteren Zeitpunkten während einiger Myogenese-Phasen implantiert, um sicherzustellen, dass die Perlenposition aufgrund endogener Gewebemorphogenese während der gesamten Versuchsdauer nicht verschoben wurde. Die Embryonenproben können mittels Zeitrafferaufnahmen visualisiert oder in regelmäßigen Abständen überprüft werden, wie die Bilder die Implantation der Mikroperlen veranschaulichen. In Abwesenheit jeglicher konjugierter Moleküle können kleine Moleküle erreicht werden, ohne grobe morphologische Effekte während der normalen Entwicklung hervorzurufen, die der SPR-Fischembryo zeigt.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Whole Mount Institute hyper durchgeführt werden, um zu untersuchen, wie das Mikroperle die Genexpression beeinflusst. Insgesamt ist das Verständnis der Position der Perle über die Zeit hinweg entscheidend für die Interpretation der Ergebnisse, beispielsweise bei der Bewertung der Wirkungen eines kleinen Moleküls auf ein Zielgewebe oder einen Entwicklungsprozess.