Name: Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Erfahren Sie die absolute Proteinquantifizierung mittels Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für komplexe biologische Proben. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen ohne Antikörper-Kreuzreaktivität.

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Diese Forschung wurde vom Intramural Research Program des NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, unterstützt.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Absolute Proteinquantifizierung ist für ein sehr breites Spektrum von biomedizinischen Anwendungen, wie Biomarker-Validierung und Signaltransduktionsweg Modellierung. Vor kurzem hat gezielte Proteomik mit LC-SRM von Verbesserungen an zahlreichen Technologien, einschließlich Peptidstandardpräparat, HPLC, QqQ-MS und LC-SRM Datenanalyse profitiert. Folglich ist es eine leistungsfähige Alternative zu Immunoassays. Immunoassays können extrem empfindlich und Hochdurchsatz, aber die Entwicklung einer robusten Immuntest kann se...

Proteom-Experimente, die Massenspektrometrie (MS) können so gestaltet werden, entweder nicht-zielgerichtete (Schrotflinte) oder gezielte Methoden verwenden. Entdeckung Proteomik beruht in der Regel auf Bottom-up-Schrotflinte MS, entweder durch die Verwendung eines herkömmlichen datenabhängigen Erfassungsmodus oder mit Hilfe eines der neu entwickelten Datenunabhängige Techniken (zB MS E, SWATH) 1,2. Shotgun Proteomics ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Hochdurchsatz-Peptid-Identifikation und relative Quantifizierung, aber es in der Regel für die absolute Quantifizierung oder auf kleine, definierte Sets (~ zig) von Proteinen ungeeignet ist. Die MS-Methode die am häufigsten für gezielte Proteomics ist wegen seiner hohen Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Dynamik 3-5 gewählten Reaktionsüberwachung (SRM). Alternativen zu SRM sind parallel Reaktionsüberwachung, die Vorteile der hochauflösenden Voll MS Scan-6 nimmt. SRM ist in der Regel unter Verwendung einer Nanofluss reverSED Phasen-Hochleistungschromatographie (Nano RP-LC) Gerät in einen Nanoelektrospray-Ionisations (nano-ESI) Ionenquelle zu einer Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer (QqQ-MS) angebracht ist. In einem typischen Experiment werden Probenproteinen proteolytisch verdaut und die resultierenden Peptide werden chromatographisch getrennt, desorbiert und ionisiert. Die erhaltenen Vorläuferionen m / z durch den ersten Quadrupol (Q1) gefiltert und fragmentiert in der zweiten Quadrupol (Q2) durch Kollision sie mit einem Stoßgas. Die resultierenden Fragmentionen m / z-gefiltert in dem dritten Quadrupol (Q3) und durch eine Dynode quantifiziert. Jedes Vorläufer- und Fragmentionenpaar wird als Übergang bezeichnet, und jeder Übergang wird für eine bestimmte Zeitdauer (die Verweilzeit, typischerweise 2-50 ms) überwacht. Während LC-SRM, die QqQ-MS durchläuft einer vordefinierten Liste von Übergängen (das Tastverhältnis ist typischerweise ≤3 s) und ein Chromatogramm jedem Übergang entsteht. Alternative strategies zur Proteinquantifizierung verwenden in der Regel Immunoassays wie Dot-Blots, Western Blots, ELISAs, Antikörper-Mikroarrays, Reverse-Phase-Protein-Microarrays, Mikrofluid-Immunoassays, digital ELISAs, und Mikrokügelchen basierende Immunoassays 7. Die besten Immunoassays deutlich empfindlicher als LC-SRM ist, und der Probendurchsatz von Immunoassays deutlich höher als die der LC-SRM 5 sein. Jedoch kann die Entwicklung Immunoassays teuer und / oder zeitaufwendig, und die resultierenden Assays können anfällig für Cross-Reaktivität und / oder Störungen, inkompatibel mit Zell- / Gewebe Lyse / Homogenisierungsverfahren werden und / oder nicht zugänglich Multiplexen 5,8. Einige dieser Probleme können durch Kopplung Antikörper- und MS-basierte Techniken behandelt werden. Zum Beispiel können Zielproteine ​​mittels Immunpräzipitation vor Proteolyse und LC-SRM 9-12 angereichert werden. Alternativ verwendet der SISCAPA Technik Immunpräzipitation im Anschluss an die Proteolyse im Peptid level 13,14. Neben Strategien immunoenrichment kann Immunodepletion hoher Fülle Proteine ​​eingesetzt werden, um LC-SRM Empfindlichkeit durch Reduzieren von Interferenz erhöhen koeluierender Analyten 15,16. MS-basierte Proteinquantifizierung kann in relative und absolute Quantifizierung in markierungsfreien und stabilen Isotopenmarkierung (zB metabolische Markierung, chemische Markierung, und Heavy-markiertem Protein und Peptid-interne Standards) unterteilt werden, und auch. Markierungsfreie Techniken können nützlich für die relative Proteinquantifizierung, sind aber für eine genaue absolute Quantifizierung ungeeignet. Im Vergleich dazu haben Markierungstechniken Fehler mit Probenvorbereitung und MS assoziierten Varianz reduziert und werden häufig für die relative Proteinquantifizierung 17 eingesetzt. Zum Beispiel unter Verwendung einer kultivierten humanen Zelllinie aktiviert relative Quantifizierung Biomarkern über LC-SRM von menschlichem Serum 18 hergestellten stabilen Isotop markiert Proteoms (SILAP) -Standards. Genaue absolute Proteinquantifizierung von MS verlangt, dass gereinigte, quantifiziert, isotopenmarkierte Protein oder Peptid internen Standards versetzt, in biologischen Proben vor der MS werden. Der Einbau von schweren Isotopen-markierten internen Standards in ein LC-SRM-Workflow ermöglicht absolute Quantifizierung, die nachweislich hoch reproduzierbar und übertragbar zwischen Laboratorien 16,19 sein. Stabiles Isotop markierten internen Standards für die absolute Proteinquantifizierung von MS gehören Peptid-Standards unter Verwendung von Festphasensynthese 20, Proteine ​​von verketteten Protease-spaltbare Peptidstandards 21, und in voller Länge Proteinstandards 22 vorbereitet. Zielprotein kovalente Modifikation und unvollständig Probenvorbereitung (dh unvollständige Lyse der Probe und Homogenisierung und unvollständiges Protein-Solubilisierung Denaturierung, Alkylierung und Proteolyse) kann eine genaue Quantifizierung zu untergraben. Interne protein Normen sind die am wenigsten von den meisten dieser potentiellen Probleme betroffen sein, aber sie sind in der Regel die schwierig herzustellen. Eine Alternative ist es, jede Zielprotein Verwendung mehrerer interner Peptidstandards, die dazu bestimmt sind, Amino- und Carboxy-terminalen nativen flankierenden Reste umfassen analysieren. Unabhängig davon, welche Art von interner Standard verwendet wird, sollte es während der Probenvorbereitung wie möglich Spike-in werden die biologischen Proben in einem möglichst frühen Zeitpunkt. Außerdem sollten mehrere Probenpräparationstechniken (zB unterschiedliche Denaturierungsbedingungen) getestet werden. Die Verwendung von mehreren orthogonalen experimentellen Techniken (experimentell Kreuzvalidierung) ist eine praktikable Strategie zur Überwindung meisten Quantifizierung mögliche Herausforderungen 23-25. LC-SRM Quantifizierung von Proteinen ist ein sehr flexibles Verfahren, das in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet worden ist. Bemerkenswerterweise wurde verwendet, um Peptid- und Protein-Biomarkern in studierenklinischen Proben, wie Serum, Stanzbiopsien und Feinnadelabsaugungen 5. LC-SRM ist auch verwendet worden, um die Stöchiometrie von Proteinkomplexen 5,26 messen, Botulinumneurotoxine 27 zu erfassen, um die Proteinphosphorylierung Dynamik innerhalb Signalwege 5 quantifizieren und um Änderungen in der Proteinkonformation 28 zu quantifizieren. Unser Labor ist mit LC-SRM, die Signalproteine, die Makrophagen-Chemotaxis vermitteln, um die Entwicklung von Chemotaxis Signalweg Simulationen unterstützt quantifizieren. Das Gesamtkonzept des Protokolls (Abbildung 1) beginnt mit Ranking der vorläufige Soll Peptide. Anschließend werden rohe externen Peptidstandards synthetisiert und verwendet werden, um LC-SRM-Assays für die qualitative Analyse von biologischen Proben zu entwickeln. Wenn der biologischen Probe stammenden Zielpeptid erfaßt wird, werden gereinigte Schwer markierten internen Peptid-Standards für die quantitative LC-SRM hergestellt. Dieses Protokoll kann zu ac verwendet werdennau Quantifizierung von Proteinen aus einer Vielzahl von biologischen Proben und zur Untersuchung einer Vielzahl von Proteinziele zu unterstützen.

<table><tbody><tr><td>Acetonitril (ACN), LC-MS-Qualität</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>BCA (Bicinchoninsäure) Protein-Assay-Kit</td><td>Fisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Kügelchen zum Bead-Beating, Zirkonoxid-Siliziumdioxid, 0,1 mm</td><td>BioSpec Products</td><td>11079101z</td><td></td></tr><tr><td>Bestatinhydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>B8385-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur DMEM (mit Glukose, ohne L-Glutamin)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur EDTA, 500 mM, pH8</td><td>Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur L-Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur Trypanblau Viabilitätsfärbung, 0,4 % w/v</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4 Zellzähler</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto T4 Einweg-Zählkammern</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100-014</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure, LC-MS-Qualität, Ampullen</td><td>Fisher</td><td>A117-10X1AMP</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer, Neubauer-verbessert, 0,1 mm tief</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0640030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 m, pH 7,2</td><td>Mediatech</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure, 37 % w/w</td><td>VWR</td><td>BDH3028-2.5LG</td><td></td></tr><tr><td>Iodacetamid</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>Laserbasierter Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>LC beschichtete Silica-Kapillare, 50 & Mikro; m id</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>LC Fläschchen, Autosampler, 12 mm x 32 mm Polypropylen</td><td>SUN SRI</td><td>200-268</td><td></td></tr><tr><td>LC Fläschchen mit Schraubverschluss, Autosampler, vorgeschlitzt PTFE/Silikon</td><td>SUN SRI</td><td>500-061</td><td></td></tr><tr><td>Luziferase, von Photinus pyralis</td><td>Sigma</td><td>L9506-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>EMD Millipore</td><td>516481-25MG</td><td></td></tr><tr><td>pH-Streifen colorpHast (pH 0,0-6,0)</td><td>EMD Chemicals</td><td>9586-1</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop Phosphatase-Inhibitor-Cocktail</td><td>Roche</td><td>04906837001</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg Kartusche</td><td>Wässer</td><td>WAT023590</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, Extraktionsverteiler, 20</td><td>Positionen Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, Gummikugel mit flacher Oberfläche</td><td>Fisher</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac Vakuumkonzentrator</td><td>Fisher</td><td>SPD111V</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure (TFA), LC-MS Qualität</td><td>Fisher</td><td>A116-50</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, Sequenzierqualität, modifiziert</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen Decapper für Micronic Röhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1765-4000</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen, 2 ml Mikrozentrifuge, O-Ring Schraubverschluss, steril</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U0631-500g</td><td></td></tr><tr><td>Wasser, LC-MS Qualität</td><td>Fisher</td><td>W6-1</td><td></td></tr></tbody></table>

selected reaction monitoring-massenspektrometrie für absolute proteinquantifizierung

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Die absolute Quantifizierung von Zielproteinen in komplexen biologischen Proben ist entscheidend für eine breite Palette von Forschungs- und klinischen Anwendungen. Dieses Protokoll enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Entwicklung und Anwendung quantitativer Assays mit Hilfe der Massenspektrometrie (Selected Reaction Monitoring, SRM). Zunächst werden wahrscheinliche quantotypische Zielpeptide anhand zahlreicher Kriterien identifiziert. Dazu gehören die Identifizierung proteotypischer Peptide, die Vermeidung posttranslationaler Modifikationsstellen und die Analyse der Einzigartigkeit des Zielpeptids mit dem Zielprotein. Als nächstes werden rohe externe Peptidstandards synthetisiert und zur Entwicklung von SRM-Assays verwendet, und die resultierenden Assays werden verwendet, um qualitative Analysen der biologischen Proben durchzuführen. Schließlich werden gereinigte, quantifizierte, mit schweren Isotopen markierte interne Peptidstandards hergestellt und zur Durchführung von SRM-Assays der Isotopenverdünnungsserie verwendet. Es wird eine Analyse aller resultierenden MS-Daten vorgestellt. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die absolute Häufigkeit von Proteinen des Chemotaxis-Signalwegs in RAW 264.7-Zellen (einer Maus-Monozyten/Makrophagen-Zelllinie) genau zu bestimmen. Die Quantifizierung von Gi2 (ein heterotrimeres G-Protein α-Untereinheit) wird ausführlich beschrieben.

Die Entwicklung von Vorhersageberechnungsmodelle von Signalübertragungswegen ist eines der grundlegenden Ziele der Systembiologie 53. Leider ist auch für Signalwege, die ausführlich untersucht worden und haben eine hohe klinische Bedeutung, es ist noch nicht allgemein möglich, quantitativ vorherWegs Verhalten in Reaktion auf Störungen (beispielsweise gilt dies für die MAPK / ERK-Weg 54). Vor kurzem hat eine Untersuchung angestellt gezielte Proteomik, Transkriptomik und rechnerische Modelli...

Dieses Protokoll beschreibt, wie absolute Quantifizierungsassays von Zielproteinen in komplexen biologischen Proben unter Verwendung ausgewählter Reaktionsüberwachung durchgeführt werden. Es wurde verwendet, um Proteine des Chemotaxis-Signalwegs von Mausmakrophagen genau zu quantifizieren. Die Auswahl des Zielpeptids, die Assay-Entwicklung sowie qualitative und quantitative Assays werden ausführlich beschrieben.

Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der Flüssigkeitschromatographie und der selektiven Reaktionsüberwachung (L-C-S-R-M) die absolute Häufigkeit von Zielproteinen in komplexen biologischen Proben zu quantifizieren. Nach der Auswahl der Peptid-Ziele werden grobe externe Peptid-Standards synthetisiert und zur Entwicklung von SRM-Assays unter Verwendung der Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie (LCM-MS) eingesetzt. Mit den resultierenden Assays werden anschließend qualitative LC-SRM-Analysen der vorbereiteten biologischen Proben durchgeführt.Wenn das aus der biologischen Probe stammende Zielpeptid nachgewiesen wird, werden die biologischen Proben mittels quantitativer LC-SRM-Analysen unter Zugabe einer stabilen Isotopenverdünnungsreihe interner Peptidstandards analysiert. Letztendlich kann mit LC-SRM die Quantifizierung von Proteinen aus einer Vielzahl biologischer Proben genau durchgeführt und die Untersuchung einer breiten Palette von Proteinzielen unterstützt werden. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber etablierten Verfahren wie Immunoassays liegt darin, dass die Assay-Entwicklung vergleichsweise schnell und kostengünstig ist und die r

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Stabile Isotope Standards und Capture von Anti-Peptid-Antikörper (SISCAPA) Paare Affinitätsanreicherung von Peptiden mit Isotopenverdünnungsanalyse Massenspektrometrie (MRM-MS) zur quantitativen Messung von Peptiden als Ersatz für ihre jeweiligen Proteine ​​liefern. Hier beschreiben wir das Protokoll mit magnetischen Partikeln in einer teilautomatisierten Format.

Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung und Quantifizierung der Komponenten in Mischungen von Spezies, die ähnliche Proteine besitzen. Die Massenspektrometrie detektiert Peptide zur Identifizierung und liefert eine relative Quantifizierung durch Verhältnisse der Peakflächen. Als Werkzeugfutter zur Betrugserkennung kann die Methode 1 % Pferd im Rind nachweisen.

Artbestimmung und Quantifizierung in Mischungen Mit MRM-Massenspektrometrie von Peptiden, der Fleisch-Authentifizierung

Hier beschreiben wir einen chromatographischen Assay, gekoppelt mit der Ionen-Mobilität Trennung von Peptid-Vorstufen, gefolgt von den hochauflösenden (~ 30.000) MS-Detektion von Peptid-Fragmente für die Quantifizierung der Spike Peptid Standards in ein monoklonaler Antikörper Digest.

Ein HS-MRM-Assay für die Quantifizierung der Wirtszelle Proteine in Protein Biopharmazeutika durch flüssige Chromatographie Ion Mobility QTOF Massenspektrometrie

Ein Protokoll zur umfassenden Extraktion von Lipiden, Metaboliten und Proteinen aus biologischen Geweben mit einer Probe wird vorgestellt.

Eine einfache Fraktionierte Extraktionsmethode für die umfassende Analyse von Metaboliten, Lipiden und Proteinen aus einer einzigen Probe

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung, Detektion und Identifizierung von diGly Peptiden, die aus ubiquitinierten Proteinen aus komplexen biologischen Proben stammen. Die vorgestellte Methode ist reproduzierbar, robust und übertrifft die veröffentlichten Methoden in Bezug auf den Grad der Tiefe der Ubiquitinom-Analyse.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

Hier präsentieren wir ein robustes Protokoll zur Quantifizierung von 40 Verbindungen, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel in zellfreien Proteinsynthesereaktionen beteiligt sind. Das zellfreie Synthesegemisch wird mit Anilin zur effektiven Trennung mittels umgekehrter Flüssigchromatographie abgeführt und dann durch Massenspektrometrie unter isotopisch gekennzeichneten internen Standards quantifiziert.

Absolute Quantifizierung des zellfreien Proteinsynthesestoffwechsels durch Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Das beschriebene Protokoll bietet eine optimierte quantitative Proteomik-Analyse von Gewebeproben mit zwei Ansätzen: markierungsbasierte und markierungsfreie Quantifizierung. Markierungsbasierte Ansätze haben den Vorteil einer genaueren Quantifizierung von Proteinen, während ein markierungsfreier Ansatz kostengünstiger ist und zur Analyse von Hunderten von Proben einer Kohorte verwendet wird.

Umfassender Workflow der massenspektrometrischen Schrotflintenproteomik von Gewebeproben

Das Protokoll zielt darauf ab, die Verwendung eines Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometers für die Mehrfachreaktionsüberwachung (MRM) von Proteinen aus klinischen Proben einzuführen. Wir haben einen systematischen Workflow von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse für klinische Proben mit allen notwendigen Vorsichtsmaßnahmen bereitgestellt.

Quantitativer Proteomik-Workflow mit multipler Reaktionsüberwachung basierender Detektion von Proteinen aus menschlichem Hirngewebe

Es wird ein Protokoll zur Bestimmung von Biomarkern mit geringer Abundanz aus getrockneten Serumproben vorgestellt, das am Beispiel des Biomarkers Progastrin-freisetzendes Peptid (ProGRP) veranschaulicht wird. Antikörperbeschichtete magnetische Beads werden zur selektiven Aufreinigung und Anreicherung eines proteotypischen ProGRP-Peptids verwendet. Das eingefangene Peptid wird anschließend mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert.

Microsampling in der gezielten Massenspektrometrie-basierten Proteinanalyse von Proteinen mit geringer Abundanz

Erfahren Sie die absolute Proteinquantifizierung mittels Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für komplexe biologische Proben. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen ohne Antikörper-Kreuzreaktivität.

Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung

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