Name: Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar Salmonellen In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung zytosolischer und vakuolärer Salmonella typhimurium in primären Makrophagen mittels differentieller Digitonin-Permeabilisierung. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung intrazellulärer Lokalisationen des Pathogens.

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Wir möchten Mathias S. Dick, Roland F. Dreier und Sebastian Rühl zur Diskussion zu bestätigen. Diese Arbeit wurde von einer SNF-Förderungsprofessuren PP00P3_139120 / 1 und einer Universität Basel Projektzuschuss ID2153162 zu PB unterstützt

1. Digitonin Assay mit mCherry-exprimierenden Salmonellen (FACS-basierte Analyse) <ol><li> Vorbereiten von Bakterien Hinweis: Salmonella-Wildtyp SL1344 (Streptomycin resistent) exprimieren mCherry aus einem Plasmid (pFPV mCherry unter der RPSM Promoter kodiert) in diesem Test verwendet. Bakterielle Phagocytose und Proliferation in dem nicht durch die konstitutive Expression von mCherry verändert 16 (Daten nicht gezeigt). <ol><li> Inokulieren des Stammes 1 Tag vor der Infektion in 3 ml LB-Medium mit Streptomycin (90 ug / ml) und Ampicillin (100 ug / ml, mCherry exprimierenden Vektor) in einem Schüttler bei 37 ° CO / N ergänzt. </li></ol></li><li> Plating-Zellen für eine Infektion. <ol><li> Samen Wildtyp- BMDMs in einer Platte mit 24 Vertiefungen bei einer Dichte von 1,25 x 10 5 Zellen / Vertiefung in 1 ml von primären Makrophagenmedium (DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS, hitzeinaktiviert, 56 ° C, 30 min ), 1% HEPES, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 1% L-Glutamin und 10% L929-Überstand (konditioniertes Medium von Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF) Herstellung L929-Zellen). Samen Vertiefungen entsprechend Tabelle 1 für die einzelnen Bedingungen Rechnung zu tragen. Hinzuzufügen Deck den als Kontrollen (Tabelle 1) verwendet Vertiefungen. </li><li> Die Zellen in einem Inkubator über Nacht inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Permeabilisierung </td><td colspan="3"> Färbung </td></tr><tr><td></td><td> Deckglas </td><td> Salmonellen </td><td> Digitonin </td><td> Saponin </td><td> Anti-Salmonella </td><td> Anti-Calnexin </td><td> anti-PDI </td></tr><tr><td> A1 (Probe) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A2 (Probe) </td><td> - / + * </td><td> + </td&gt; <td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A3 (Probe) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A4 (ohne Permeabilisierung Steuerung) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A5 (komplette Permeabilisierung Steuerung) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> B1 (für Calnexin gebeizt) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B2 (für Calnexin gebeizt) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B3 (für Calnexin gebeizt) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> C1 (Buntfür PDI) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C2 (gefärbt für PDI) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C3 (gefärbt für PDI) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Plating System für Knochenmark-Makrophagen (BMDMs) in einer 24-Well-Format für die spätere Infektion mit Salmonella, Permeabilisierung und Färbung * Je nachdem, ob Protokoll 1 oder Protokoll 2 ist fertig.. <ol start="3"><li> Vorbereitung der Bakterien für die Infektion. <ol><li> Am nächsten Tag, bestimmen die Konzentration von Salmonella in der Übernacht-Kultur durch Verdünnen der Kultur 1:10 in PBS und Messen der OD 600 gegen einen PBS einzige Kontrolle. Dies stellt sicher, dass die OD 600 in der L gemesseninear Bereich des Spektrometers. </li><li> Berechnen der Konzentration von Salmonellen pro ml. Einer OD600 von 1 entspricht 1 x 10 9 Bakterien. </li><li> Verdünne die Bakterien in Makrophagen Medium, um ein Salmonella-Konzentration von 1,25 x 10 6 Zellen / ml zu erreichen. </li></ol></li><li> Infektion von Zellen mit Salmonella. <ol><li> Entfernen Sie Medium aus BMDMs. 1 ml Medium, um nichtinfizierten Makrophagenkontrolle Vertiefungen (B1-B3, C1-C3). 1 ml der Suspension in die Vertiefungen Salmon A1 - A5, um eine Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 Bakterien pro Zelle zu erreichen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte für 15 Minuten bei 300 g bei 37 ° C, um die Infektion zu synchronisieren. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Töten extrazellulären Salmonellen mit Gentamicin. <ol><li> Bei 1 h nach der Infektion zu entfernen Platte von Inkubator und 0,1 ml von Makrophagen-Medium mit 0,1 mg / ml Gentamicinan extrazelluläre Bakterien zu töten. Hinzuzufügen Amicin zu allen Vertiefungen, auch nicht infizierten Kontrollen, um sicherzustellen, dass alle Zellen die gleiche Weise behandelt. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Waschen der Zellen. <ol><li> Bei 2 h nach der Infektion zu entfernen Platte aus Inkubator und waschen alle Vertiefungen 2x mit 1 ml Klar DMEM (vorgewärmt auf 37 ° C) und ersetzen sie durch Makrophagen-Medium (auf 37 ° C vorgewärmt), das 10 ug / ml &#160; Gentamycin, um das Wachstum der verbleibenden extrazellulären Bakterien zu verhindern. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Vorbereiten von frischem Puffer mit Reinigungsmitteln und Antikörper. <ol><li> Kurz vor dem gewünschten Zeitpunkt der Analyse, eine frische Stammlösung von Digitonin bei 1 mg / ml in KHM-Puffer (110 mM Kaliumacetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,3). Filtern Sie die Lager und in KHM verdünnte Puffer auf eine Arbeitskonzentrationvon 50 ug / ml Digitonin. Darüber hinaus wird eine Lösung aus 0,1% Saponin in KHM Buffer, anti- Salmonellen-Antikörper gegen FITC (CSA-1-FITC) bei 1/500, anti-Calnexin in KHM gekoppelt an 1/100 oder anti-PDI bei 1/100 Puffer, ergänzt mit 3% BSA. </li></ol></li><li> Zellpermeabilisierung. <ol><li> Entfernen Platte aus Inkubator und waschen Brunnen 3x mit 0,5 ml KHM Buffer (auf 37 ° C vorgewärmt). Entfernen KHM Buffer und fügen Sie 0,25 ml Klar KHM-Puffer in Vertiefungen A4 und B1 / C1, KHM Buffer mit Digitonin in die Vertiefungen A1 - A3 und B2 / C2 oder KHM Puffer mit Saponin in Vertiefungen A5 und B3 / C3 (nach Tabelle 1). Inkubieren für genau 1 min bei RT und sofort abwaschen alle Vertiefungen 3 x mit 0,5 ml KHM Buffer (auf 37 ° C vorgewärmt). </li></ol></li><li> Primärantikörperfärbung. <ol><li> Entfernen Sie das KHM Buffer und fügen Sie die primären Antikörperlösungen (Ziege anti Salmonellen -FITC, 250 ul / Vertiefung, 0,1 ug / ml) in die entsprechenden Vertiefungen (Abbildung 1 </strong&gt;, Tabelle 1). Inkubiere die Platte für 15 min in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. </li><li> Die Zellen 1x mit 1 ml PBS waschen. </li></ol></li><li> Infizierte Zellen (wells A1 - A5): FACS-Analyse <ol><li> Wash Zellen 3x mit PBS und fügen Sie 0,5 ml eiskaltem PBS, das 0,1% Triton. Übertragung auf eine 5 ml FACS-Röhrchen mit Zellsieb Kappe zu brechen Zellaggregate. Halten Sie Proben auf Eis. </li><li> Analysieren Sie die Proben eines FACS. Bei Verwendung des voll durchlässig gemacht Kontrollen, setzen das Tor für insgesamt Bakterien auf der Basis nach vorne und Seitenstreuung (FSC / SSC) erste und die mCherry Signal (610 nm ± 20 nm Filter). </li><li> Als nächstes analysieren die FITC-Signal in der gesamten Bakterienpopulation mit Hilfe der vollständig durchlässig gemacht und nicht permeabilisiert Kontrollen, die Tore für cytosolische Bakterien (FITC +, mCherry +) und vakuoläre Bakterien (FITC-, mCherry +) (Abbildung 3) festgelegt. </li><li> Mit setzen die Tore, die Proben analysieren und bestimmen den Anteil der cytosolischen vs.vakuolären Bakterien mittels FlowJo Software gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li></ol></li><li> Nicht infizierte Permeabilisierung Kontrollen (wells B1 - B3, C1 - C3): Mikroskopie <ol><li> Fixierung <ol><li> Entfernen PBS und fügen Sie 250 ul 4% PFA in PBS. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Waschen Vertiefungen 2x mit 1 ml PBS und füge 250 ul 0,1 M Glycin in PBS für 10 min, um die Fixiermittel quenchen. Waschen Vertiefungen 2x mit 1 ml PBS. </li></ol></li><li> Sekundärantikörperfärbung. <ol><li> Flecken Permeabilisierung Steuerungen für 1 Stunde bei RT mit einem geeigneten sekundären Antikörper an Fluorophoren in PBS gekoppelt ergänzt mit 0,1% Saponin und 3% BSA vollständig permeabilisieren Zellen. </li><li> Wash Deckgläser 3x mit 1 ml PBS und montieren Sie die Deckgläser für die Analyse in Eindeckmedium mit DAPI (1,5 ug / ml). </li></ol></li><li> Mikroskopie-Analyse. <ol><li> Analysieren Sie die Deckgläser mit den Kontrollen in einem 40X oder 63X Vergrößerung mit einem konfokalen fluoFluoreszenz Mikroskop. Wenn die Permeabilisierung gearbeitet hat, sollte es keine Färbung für nicht permeabilisierten Zellen Calnexin Färbung sowohl digitonin- und Saponin-permeabilisierten Zellen und PDI Anfärben nur für Saponin-permeabilisierten Zellen (Figur 4) ist. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Digitonin Assay mit unbeschriftet Salmonellen (Mikroskopie-basierte Analyse) <ol><li> Vorbereiten von Bakterien, die für O / N Kulturen. <ol><li> Impfen unmarkierten Salmonella-Wildtyp SL1344 (Streptomycin resistent) 1 Tag vor der Infektion in 3 ml LB-Medium mit Streptomycin (90 ug / ml) in einem Schüttler bei 37 ° CO / N ergänzt. </li><li> Plating-Zellen für eine Infektion. <ol><li> Samen BMDMs in einer 24 Well-Platte mit sterilen Glasdeckgläschen in einer Dichte von 1,25 x 10 5 Zellen / Vertiefung in 1 ml Makrophagen-Medium (DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS, de-komplementiert, 56 ° C,30 min), 1% HEPES, 1% L-Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 1% L-Glutamin und 10% L929-Überstand). Samen Vertiefungen entsprechend Tabelle 1 für die einzelnen Bedingungen Rechnung zu tragen. </li><li> Die Zellen O / N in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Bakterien für die Infektion. <ol><li> Am nächsten Tag, bestimmen die Konzentration von Salmonella in der O / N-Kultur durch Verdünnen der Kultur 1:10 in PBS und Messen der OD 600 gegen einen PBS einzige Kontrolle. Dies stellt sicher, dass die OD 600 in dem linearen Bereich des Spektrophotometer gemessen. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentration von Salmonellen pro Milliliter. Eine OD 600 von 1 entspricht 1 x 10 9 Bakterien. </li><li> Verdünne die Bakterien in Makrophagen Medium, um ein Salmonella-Konzentration von 1,25 x 10 6 Zellen / ml zu erreichen. </li></ol></li><li> Infektion von Zellen mit Salmonella. <ol&gt; <li> Entfernen Sie Medium aus allen Vertiefungen. 1 ml der Klar Makrophagen-Medium nicht infizierten Kontrollvertiefungen (B1 - B3, C1 - C3). 1 ml der Suspension in die Vertiefungen Salmon A1 - A5, um eine Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 Bakterien pro Zelle zu erreichen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte für 15 Minuten bei 300 g bei 37 ° C, um die Infektion zu synchronisieren. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Töten extrazellulären Salmonellen mit Gentamycin. <ol><li> Bei 1 h nach der Infektion zu entfernen Platte von Inkubator und 0,1 ml von Makrophagen-Medium, das 1 mg / ml Gentamycin auf extrazelluläre Bakterien zu allen Vertiefungen zu töten. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Waschen der Zellen. <ol><li> Bei 2 h nach der Infektion zu entfernen Platte aus Inkubator und waschen Sie jedes Well 3x mit 1 ml frischem Makrophagen-Medium, das 10 ug / ml Gentamicin, um zu verhindern,Wachstum der verbleibenden extrazellulären Bakterien. Übertragen die Platte in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Vorbereiten von frischem Puffer mit Reinigungsmitteln und Antikörper. <ol><li> Kurz vor dem gewünschten Zeitpunkt der Analyse, eine frische Stammlösung von Digitonin bei 1 mg / ml in KHM-Puffer (110 mM Kaliumacetat, 20 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,3). Filtern Sie die Lager und in KHM Puffer verdünnen, um eine Arbeitskonzentration von 50 ug / ml Digitonin. </li><li> Darüber hinaus wird eine Lösung aus 0,1% Saponin in KHM Buffer, anti- Salmonellen -FITC (CSA-1, 0,1 ug / ml), anti-Calnexin auf 1/100 oder anti-PDI auf 1/100 in KHM Puffer, ergänzt mit 3% BSA (siehe Materialtabelle für Antikörperkonzentration). </li></ol></li><li> Zellpermeabilisierung. <ol><li> Entfernen Platte aus Inkubator und waschen Brunnen 3x mit 0,5 ml KHM Buffer (auf 37 ° C vorgewärmt). Entfernen KHM Buffer und fügen Sie 0,25 ml Klar KHM BufferVertiefungen A4 und B1 / C1, KHM Buffer mit Digitonin in Vertiefungen A1 - A3 und B2 / C2 oder KHM Puffer mit Saponin in Vertiefungen A5 und B3 / C3 (gemäß Tabelle 1). Inkubieren für genau 1 min bei RT und sofort abwaschen alle Vertiefungen 3 x mit 0,5 ml KHM Buffer (auf 37 ° C vorgewärmt). </li></ol></li><li> Primärantikörperfärbung. <ol><li> Entfernen Sie das KHM Buffer und fügen Sie die primären Antikörperlösungen (Ziege anti Salmonellen CSA1-FITC, 250 ul / Vertiefung, 0,1 ug / ml) in die entsprechenden Vertiefungen (Abbildung 2, Tabelle 1). Inkubiere die Platte für 15 min in einem Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2. Waschen 3x mit 1 ml PBS. </li></ol></li><li> Fixation. <ol><li> Entfernen PBS und fügen Sie 250 ul 4% PFA in PBS. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Waschen Vertiefungen 2x mit 1 ml PBS und füge 250 ul 0,1 M Glycin in PBS für 10 min, um die Fixiermittel quenchen. Waschen Vertiefungen 2x mit 1 ml PBS. </li></ol></li><li> GesamtSalmonella-Färbung der infizierten Proben. <ol><li> Waschdeckgläser 3x mit PBS mit 0,1% Saponin / 3% BSA und Inkubation der Proben mit einem Anti CSA1-Antikörper (Ziegen-anti-CSA1, 0,1 ug / ml, arbeitet Maus-anti-LPS als auch 0,1 ug / ml) 1 h bei RT in PBS mit 0.1% Saponin / 3% BSA. </li><li> Waschen 3x in PBS mit 0.1% Saponin / 3% BSA. Ihre Proben inkubieren mit einem sekundären anti-Ziege-Antikörper gegen Fluorophor der Wahl in PBS mit 0.1% Saponin / 3% BSA für 30 min bei RT im Dunkeln gekoppelt. </li><li> Wash Deckgläser 3x mit 1 ml PBS und montieren Sie die Deckgläser für die Analyse in Eindeckmedium mit DAPI (1,5 ug / ml). </li></ol></li><li> Mikroskopie-Analyse. <ol><li> Erwerben Sie Daten mit einem konfokalen Mikroskop durch Zählen cytosolische Salmonellen (Salmonella anti -FITC positiv) und insgesamt Salmonellen (Doppel positive) (Abbildung 5). Permeabilisierung Kontrollen sollten zeigen: keine Färbung für nicht-permeabilisierten Zellen, Calnexin sTaining für Digitonin-permeabilisierten Zellen und PDI Färbung für Saponin-permeabilisierten Zellen (Figur 4). Wells A4 und A5 werden als interne Kontrollen für die Salmonellen-Färbung zu dienen. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Wir haben nichts offenzulegen.

Differential Permeabilisierung ist ein einfaches und robustes Verfahren zu analysieren und zu quantifizieren, die subzelluläre Verteilung von bakteriellen Krankheitserregern zwischen vakuolären Fächern und Cytosol. Das gleiche Assay wurde erfolgreich mit Bakterien wie Francis novicida 2,4 und Shigella flexneri 12 verwendet. Da jedoch viele intrazelluläre Pathogen zu verändern oder die Host-endomembrane Strukturen ändern, wird die Robustheit der Digitonin Permeabilisierung haben, u...

Intrazelluläre bakterielle Pathogene replizieren entweder direkt in der Wirtszelle Zytosol oder in spezialisierten Vakuolen-Kammer 1. Während der Anfangsphase der Infektion am meisten Pathogene erhalten entweder durch Phagozytose durch spezialisierte Zellen (Makrophagen) oder aktiv für ihre eigene Aufnahme in nicht-phagozytische Zellen internalisiert. In Phagozyten, Sicherungen Phagosom normalerweise mit Lysosomen, um einen Abbauraum, in dem die phagozytierten Partikel verdaut werden zu bilden. Fach cytosolischen Bakterien wie Francis novicida oder Shigella flexneri, Flucht phagosomalen Abbau durch Induktion der Bruch der Phagosomen und anschließend in das Cytosol 2,3 entkommen. Dies erfordert virulenzassoziierten Mechanismus wie dem Francis Pathogenitätsinsel (FPI) oder der Shigella flexneri T3SS, die Effektor-Proteine, die Vakuole Bruch 2-4 fördern injiziert. Die Wirtszelle Cytosol Funktioneneine Anzahl von konservierten pattern recognition receptors, die normalerweise erkennen das Vorhandensein von Krankheitserregern und induzieren angeborenen Immunsignal 5. Zusätzlich xenophagy, ein antimikrobielles Form autophagy können Bakterien, die in das Cytosol eintreten verschlechtern. Cytosolische Bakterien sind in der Regel gut geeignet, um stumpf oder Umgehung Antworten mit unterschiedlichen Strategien. Zum Beispiel Francis modifiziert seine LPS zu Hosterkennung zu vermeiden und Shigella verhindert Autophagie Rekrutierung mit sezerniert Effektorproteinen 6,7. Eine weitere Strategie, um den lysosomalen Abbau entweichen durch den Modell vakuolären Pathogen Salmonella enterica Serovar Typhimurium eingesetzt, danach wie Salmonella typhimurium bezeichnet. Salmonellen benutzt eine T3SS Effektoren, die die anfängliche phagosome in seine intrazelluläre Nische umzu einzuspritzen, Salmonella -enthaltende Vakuole (SCV) 8,9. Kontinuierliche Manipulation von Host Wege istnotwendig, diese Vakuole durch Rekrutierung Lipide und andere Nährstoffe zur Vakuole zu halten. In der Tat, eine Sifa Mutante von Salmonella nicht an vakuolären Stabilität zu gewährleisten, und tritt in das Cytosol der Wirtszellen innerhalb von Stunden nach der Infektion, die Aktivierung der angeborenen Immunwege und Autophagie Rekrutierung 8 Ergebnisse. Vakuolären Entweichen von Salmon hängt vom Zelltyp abhängig, dass Studien ist, und mehrere Berichte haben gezeigt, dass in den Epithelzellen auch WT Salmon die SCV und hyperreplicate im Cytosol 10 entkommen. Jüngste Berichte zeigen, dass die angeborene Immun Nachweis von Vakuolen Erreger hängt auch von der Fähigkeit der Aufnahme zu erkennen und zu destabilisieren erregerhaltigen Vakuolen (PCV) 11-14. Da sowohl der Host oder Bakterien Genotyp kann die Verteilung der intrazellulären Bakterien zwischen vakuolären und Cytosol zu beeinflussen, ist es notwendig, die Anzahl der vakuolären vs. quantifizierencytosolischen Bakterien. Da in den meisten Versuchsaufbauten Wirtszellen werden mit mehr als einem Bakterium infiziert, und anschließend kann einige Bakterien in verschiedenen subzellulären Kompartimenten Hafen wird eine Technik benötigt, die Quantifizierung auf der Ebene der einzelnen Bakterien ermöglicht. Differential Permeabilisierung (auch als phagosomalen-Schutz-Assay bekannt) bietet diese Entschließung 2,4,10,12. Der Test basiert auf selektive Permeabilisierung der Plasmamembran Wirtszelle mit dem Detergens Digitonin, die vakuoläre Membranen intakt lässt und ermöglicht somit die selektive Anfärbung von zytosolischen Bakterien mit Antikörpern. Im Folgenden sollen zwei Protokolle für die Quantifizierung von cytosolischen und vakuolären Salmonella typhimurium durch Differential Permeabilisierung. Das Prinzip dieses Verfahrens ist in Figur 1 beschrieben: Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) mit stationärer Phase mCherry exprimierenden Salmonellen infiziert. Stationäre Phase Salmonellen brauchen to verwendet werden, weil sie die Expression des SPI-1 T3SS, deren Aktivität die ansonsten von der NLRC4 Inflammasoms erkannt und veran schnellen Zelltod (pyroptosis) des BMDMs 15 herunterregulieren. Nach der Infektion Zellen werden gewaschen und mit 50 ug / ml Digitonin für 1 Minute behandelt. Zellen werden sofort wieder gewaschen und mit Anti-Salmonella-Antikörper an FITC gekoppelt, um Bakterien, die mit Zugang zum Cytosol zu markieren inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt Zellen lysiert und der Prozentsatz der mCherry + (vakuoläre) und FITC + / mCherry + (cytosolische) Bakterien durch FACS bestimmt. Wir zusätzlich eine Anpassung der Methode, die verwendet werden können, wenn keine fluoreszierende Protein exprimierenden Stämme sind (Abbildung 2). Zusätzliche Schritte werden nach der Markierung mit FITC bei denen Zellen fixiert und permeabilisiert vollständig eingeführt. Danach alle Bakterien mit anti Salmonellen-Antikörpern und entsprechenden Sekundärantikörper gefärbt. DetReflexion wird dann durch Mikroskopie anstelle von FACS-Analyse durchgeführt.

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td>50 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>PFA</td><td>mpbio</td><td>219998380</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumacetat</td><td>Sigma</td><td>791733</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Salmonellen CSA-1-FITC</td><td>KPL</td><td>01-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-Salmonellen CSA-1</td><td>KPL</td><td>02-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Anti-Calnexin</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-860D</td><td>1/100</td></tr><tr><td>Anti-PDI</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-890</td><td>1/100</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Anti Kaninchen Antikörper-488</td><td>Molekular Sonden</td><td>A-11070</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15710-49</td><td>100 &mu; g/ml und 10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Amimed</td><td>5-13K00-H</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 Konfokales Mikroskop</td><td>Zeiss-Bildgebung</td><td></td><td>mit 63X</td></tr><tr><td>FACS Fortessa</td><td>BD technologies</td><td></td><td>Detektion mCherry 610 nm</td></tr><tr><td>FACS Fortessa</td><td>BD Technologien</td><td></td><td>Detektion FITC 530 nm</td></tr></tbody></table>

die quantifizierung der cytosolic vs. vacuolar<em&gt; salmonellen</em&gt; in primäre makrophagen durch differential permeabilisierung

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger können im Cytosol oder in spezialisierten erregerhaltigen Vakuolen (PCV) zu replizieren. Um das Cytosol zu erreichen, Bakterien wie Shigella flexneri und Francis novicida müssen den Bruch der phagosome induzieren. Im Gegensatz dazu repliziert Salmonella typhimurium in einer Vakuole Fach, wie Salmonellen enthaltenden Vakuolen (SCV) bekannt. Jedoch bestimmte Mutanten von Salmonella nicht zu SCV Integrität zu erhalten und somit in das Cytosol freigesetzt. Der Prozentsatz der cytosolischen vs. vakuolären Bakterien auf der Ebene von einzelnen Bakterien können durch differentielle Permeabilisierung gemessen werden, die auch als Phagosomen-Schutzassay bekannt. Der Ansatz nutzt die Eigenschaft des Waschmittels Digitonin, um selektiv binden Cholesterin. Da die Plasmamembran enthält mehr Cholesterin als andere zelluläre Membranen kann Digitonin zur selektiven Permeabilisierung der Plasmamembran, während die intrazelluläre Membranen werdenintakt. Kurz gesagt, nach einer Infektion mit dem Pathogen ein fluoreszierendes Markerprotein (zB mCherry unter anderem) exprimieren, wird die Plasmamembran der Wirtszellen mit einer kurzen Inkubation in Digitonin enthaltenden Puffer permeabilisiert. Die Zellen werden dann gewaschen und inkubiert mit einem primären Antikörper (mit einem Fluorophor gewählt gekoppelt) gegen das Bakterium der Wahl gerichtet (zB Antisalmon -FITC) und erneut gewaschen. Wenn unmarkierte Bakterien verwendet werden, kann ein zusätzlicher Schritt durchgeführt, in dem alle Membranen werden permeabilisiert und alle Bakterien, die mit einem entsprechenden Antikörper gefärbt. Nach der Färbung kann der Prozentsatz der Vakuole und cytosolische Bakterien durch FACS oder Mikroskopie durch Zählen einfach oder doppelt positive Ereignisse quantifiziert werden. Hier bieten wir experimentelle Details für den Einsatz dieser Technik mit dem Bakterium Salmonella typhimurium. Der Vorteil dieses Tests besteht darin, dass im Gegensatz zu anderen Assays, bietet es eine Quantifizierung auf der Ebene einzelner bacteria stellt die genaue Anzahl der cytosolischen und vakuolären Bakterien in einer gegebenen Zelle, und wenn durch Mikroskopie analysiert.

Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen die Schaltpläne der Digitonin Assay in Protokoll 1 und Protokoll 2, die die kritische Schritte in dem Protokoll und die erzielten Ergebnisse beschrieben. Abbildung 3 zeigt typische FACS Ergebnisse. Positive und negative Kontrollen werden verwendet, um die Tore für mCherry + / FITC- Bakterien (Salmonellen Vakuolen) und mCherry + / FITC + Bakterien (Salmonellen cytosolische) eingestellt. Basierend auf diesen Toren der Anteil der cytosolisch...

Wir beschreiben die Quantifizierung von zytosolischen und vakuolären Salmonella typhimurium in Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen mittels differentieller Digitonin-Permeabilisierung.

Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar<em&gt; Salmonellen</em&gt; In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den Prozentsatz zytosolischer und vakusolarer Salmonella Typhimurium in infizierten, aus Knochenmark stammenden Makrophagen zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem Makrophagen mit M-Cherry-exprimierenden Salmonella Typhimurium infiziert werden. In einem zweiten Schritt werden die Zellen mit dem Detergens Triton behandelt, das die Plasmamembran, nicht jedoch die Vakuolenmembranen, permeabilisiert.Anschließend werden die Zellen mit einem gegen Salmonella gerichteten Antikörper markiert, der an den Fluorophor für Zi gekoppelt ist. Um cytosolische Salmonella typhimurium zu markieren, zeigen die Ergebnisse den Prozentsatz cytosolischer Bakterien an der Gesamtanzahl von Bakterien basierend auf der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung oder FACS. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich der Pathogen-Interaktion zu beantworten, beispielsweise, ob ein intrazellulärer Erreger in einer Vakuole oder im Cytosol repliziert. Impfen Sie den Bakterienstamm einen Tag vor der Infektion in drei Milliliter Luria-Bertani-Medium, das mit Streptomycin und Ampicillin ergänzt wurde, und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Schüttler, um den individuellen Bedingungen Rechnung zu tragen. Geben Sie Deckgläser in die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte, die als Kontrollen dienen sollen, um die Zellen für die Infektion auszuplatzieren. Säen Sie wildtypische aus Knochenmark abgeleitete Makrophagen oder BM-DMs mit einer Dichte von 0,125 Millionen Zellen pro Vertiefung in ein Milliliter Primär-Makrophagen-Medium aus und inkubieren Sie die Zellen anschließend über Nacht in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.Am nächsten Tag. Bestimmen Sie die Konzentration von Salmonellen in der Übernachtkultur, indem Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600 der verdünnten Kultur gegenüber gepuffertem Salzlösungsmittel messen. Dies gewährleistet, dass die OD 600 im linearen Bereich des Spektrophotometers gemessen wird.Berechnen Sie die Konzentration von Salmonellen pro Milliliter und berücksichtigen Sie, dass ein OD 600 einem Milliarden entspricht. Verdünnen Sie die Bakterien im Makrophagen-Medium, um eine Salmonellen-Konzentration von 1,25 Millionen Zellen pro Milliliter zu erreichen, um die Zellen mit Salmonellen zu infizieren. Entfernen Sie das Medium aus den B MDMs.Geben Sie ein Milliliter Makrophagenmedium in die nicht infizierten Kontrollgefäße, B1 bis B3 und C1 bis C3. Geben Sie anschließend ein Milliliter Salmonella-Suspension in die Gefäße A1 bis A5, um eine Infektionsmultiplizität von 10 Bakterien pro Zelle zu erreichen. Zentrifugieren Sie die Platte 15 Minuten bei 300 × g und 37 °C, um die Infektion zu synchronisieren, bevor Sie die Platte zur Inkubation bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid nach einer Stunde post-Infektion überführen. Entnehmen Sie die Platte dem Inkubator, um 0,1 Milliliter Makrophagenmedium mit Gentamycin hinzuzufügen, um extrazelluläre Bakterien abzutöten.Gentamycin zu allen Vertiefungen hinzufügen, auch zu den nicht infizierten Kontrollen, um sicherzustellen, dass alle Zellen einheitlich behandelt werden. Anschließend die Platte zwei Stunden nach der Infektion in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid überführen. Die Platte aus dem Inkubator nehmen und alle Vertiefungen zweimal mit einem Milliliter vorgewärmtem Dulbeccos modifiziertem Eagleschem Medium (DMEM) waschen.Ersetzen Sie das DMEM durch vorgewärmtes Makrophagenmedium mit Gentamicin, um das Wachstum eventuell verbliebener extrazellulärer Bakterien zu verhindern, bevor die Platte kurz vor dem gewünschten Analysezeitpunkt in den Inkubator zurückgebracht wird. Bereiten Sie frische Lösungen des KHM-Puffers, des KHM-Puffers mit Digitonin und des KHM-Puffers mit Saponin vor. Neben den im Textprotokoll beschriebenen Antikörperlösungen zur Durchführung der Zellpermeabilisierung entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und waschen die Vertiefungen dreimal mit je 0,5 Milliliter vorgewärmtem KHM-Puffer.Entfernen Sie dann den KHM-Puffer und geben Sie 0,25 Milliliter reinen KHM-Puffer in die Vertiefungen A4, B1 und C1, KHM-Puffer mit Digoxin in die Vertiefungen A1 bis A3, B2 und C2 sowie KHM-Puffer mit Saponin in die Vertiefungen A5, B3 und C3. Inkubieren Sie genau eine Minute bei Raumtemperatur, bevor Sie unverzüglich alle Vertiefungen dreimal mit je 0,5 Milliliter vorgewärmtem KHM-Puffer waschen. Abschließend entfernen Sie den KHM-Puffer und geben die primären Antikörperlösungen in die entsprechenden Vertiefungen, gefolgt von einer Inkubation der Platte für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen in den Vertiefungen A1 bis A5 einmal mit einem Milliliter PBS.Bereiten Sie die Zellen für die Fax-Analyse vor, indem Sie sie dreimal mit PBS waschen. Geben Sie anschließend 0,5 Milliliter eiskalte PBS mit 0,1 % Triton hinzu. Überführen Sie danach die Zellsuspension in ein fünf Milliliter fassendes Fax-Röhrchen mit einem Zellfilterdeckel, um Zellaggregate aufzubrechen, während die Proben auf Eis gehalten werden.Analysieren Sie die Proben auf einer Faxmaschine unter Verwendung der vollständig permeablen Kontrollen. Stellen Sie das Tor für Gesamtbakterien basierend auf Forward- und Side-Scatter sowie dem mCherry-Signal ein. Analysieren Sie anschließend das Fitz-Signal in der Gesamtbakterienpopulation unter Verwendung der vollständig permeablen und nicht permeablen Kontrollen, um die Tore für zytoplasmatische Bakterien und vakuläre Bakterien mit der eingestellten Torpositionierung festzulegen.Analysieren Sie die Proben und bestimmen Sie den Prozentsatz zytosolischer gegenüber vakulärer Bakterien mithilfe der FlowJo-Software. Gemäß der Herstelleranleitung für die nicht infizierten Permeationskontrollen in den Wells B1 bis B3 und C1 bis C3, bereiten Sie die Probe für die Mikroskopie vor, indem Sie das PBS entfernen und 250 µL 4 % Paraformaldehyd in PBS hinzufügen. Inkubieren Sie 10 Minuten bei 37 °C. Nach der Inkubation waschen Sie die Wells zwei Mal mit je einem Milliliter PBS und geben anschließend 250 µL 0,1 molaren Glycin in PBS für 10 Minuten zu, um das Fixativ zu quenchieren. Danach waschen Sie die Wells erneut zwei Mal mit je einem Milliliter PBS, um die Sekundärantikörper-Färbung durchzuführen.Färben Sie die Permeationskontrollen eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit geeigneten sekundären Antikörpern, die an Fluorofarbstoffe gekoppelt sind, in PBS. Das PBS ist mit 0,1 % Saponin und 3 % BSA angereichert. Zum vollständigen Permeabilisieren der Zellen waschen Sie die Deckgläser dreimal mit je einem Milliliter PBS und bringen Sie die Deckgläser zur Analyse in Eindeckmedium mit DAPI ein.Analysieren Sie die Deckgläser mit den Kontrollen bei einer 40×- oder 63×-Vergrößerung mithilfe eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops. Hier dargestellt sind typische Befunde. Ergebnisse aus positiven und negativen Kontrollen werden verwendet, um die Tore für mCherry-positive, FITS-positive Bakterien, die zytosolische Salmonellen, und mCherry-positive, FITS-negative, also vakuäre Salmonellen, festzulegen.Auf Grundlage dieser Gates wird der Prozentsatz zytosolischer und vakuolärer Bakterien in den Versuchsproben bestimmt. In diesem Beispiel wird mCherry-positives Salmonella typhimurium Wildtyp mit einem CA-Deletionsmutanten in aus Knochenmark abgeleiteten MI-Makrophagen verglichen. Gezeigt sind hier Calnexin- und PD1-Färbungen, die in Permeabilisierungskontrollen erhalten wurden, die mit Digitonin oder Saponin behandelt wurden. Da Calnexin ein ER-Membranprotein ist, ist die Calnexin-Färbung im gesamten Zytosol und um den Zellkern herum in beiden Permeabilisierungsbedingungen – mit Digitonin und Saponin – sichtbar. In den mit Digitonin permeabilisierten Kontrollen ist keine PD1-Färbung sichtbar.Während Färbungen in sasin- und perme-Zellen beobachtet werden können, ist hier ein Anti-Salmonellen-Färbungsergebnis in Zellen dargestellt, die mit Tonin permeabilisiert wurden. Gesamtbakterien erscheinen rot, während zytosolische Bakterien grün gefärbt sind.Die E-positive Population besteht aus Salmonellen mit Zugang zum Cytosol. Währenddessen handelt es sich bei der Fite-negativen Population um Bakterien, die in einer intakten, Salmonellen enthaltenden Vakuole (SCV) verbleiben und daher vor der Markierung durch Salmonellen-FSE geschützt sind. Hier wird Wildtyp-Salmonellen mit einem CFE-Deletionsmutantenstamm verglichen. Da CA notwendig ist, damit Salmonellen die Integrität der SCV aufrechterhalten, erhöht sich der Prozentsatz an Salmonellen im Cytosol. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie der Prozentsatz vakuolärer und cytosolischer Bakterien bestimmt werden kann.

quantification-cytosolic-vs-vacuolar-salmonella-primary-macrophages

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