T-Zellen erfassen Bakterien durch Transinfection von dendritischen Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die transinfektion von CD4+T-Zellen durch Bakterien mithilfe eines Mauszellenmodells zu quantifizieren. In vivo können einige pathogene Bakterien wie Listeria monocytogenes und Salmonella enteritidis T-Lymphozyten infizieren und deren Verhalten verändern. In vitro hingegen lassen sich T-Zellen nur schwer infizieren.

Ausgehend von dieser Beobachtung untersuchten wir, ob T-Zellen Bakterien von infizierten dendritischen Zellen während der Antigenpräsentation aufnehmen können, wie es bei Virusinfektionen der Fall ist. Wir fanden heraus, dass T-Zellen Bakterien aufnehmen und diese anschließend abtöten. Tatsächlich stellten wir fest, dass T-Zellen dies effizienter tun als professionelle Phagozyten.

Diese Ergebnisse widersprechen einem zentralen Grundsatz der Immunologie und zeigen, dass Zellen der adaptiven Immunität Funktionen ausführen können, die angeblich ausschließlich der angeborenen Immunität vorbehalten sind. Heute stellen wir das Protokoll vor, das zur Untersuchung des Bakterien-Transinfektionsprozesses in einem Mausmodell verwendet wird. Esteban Veiga und ich werden dieses Verfahren gemeinsam mit Guillermo Ramirez-Santiago, Raquelle Garcia-Ferreras, zwei Doktoranden, und Monica Torres-Torresano, einer Technikerin, demonstrieren.

Beachten Sie, dass alle in diesem Video beschriebenen Verfahren in der Abzugshaube durchgeführt werden sollten und dabei ausschließlich steriles Medium, Instrumente, Pipettenspitzen und Kulturschalen verwendet werden müssen. Geben Sie in einer sterilen 15-Zentimeter-Petrischale, die nicht für die Gewebekultur behandelt wurde, einen Mikroliter einer Lösung mit einem Milligramm pro Milliliter Lipopolysaccharid zu den aus dem Knochenmark eines einzelnen Mäuses stammenden dendritischen Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang, um die Expression des major histocompatibility complex II (MHC II) zu erhöhen.

Nach der Inkubation die Durchflusszytometrie durchführen, um die Expression von MHC II und die Differenzierung zu bestätigen. Nachdem die Expression von MHC II, wie hier gezeigt, bestätigt wurde, die Zellen in ein steriles 50-Milliliter-Polypropylenrohr überführen. 10 Milliliter PBS mit fünf Millimolar EDTA hinzufügen und anschließend die Zellen bei 600 × g zentrifugieren.

Nach Abschluss der Zentrifugation eine Wäsche durchführen, indem die Zellen in RPMI mit 10 % FBS resuspendiert und erneut zentrifugiert werden. Danach nach der Wäsche ein Milliliter RPMI mit 10 % FBS pro fünf mal 10 hoch sechs dendritische Zellen hinzufügen und mehrmals auf- und abpipettieren, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen. Anschließend die resuspendierten dendritischen Zellen auf zwei Reagenzgläser gleichen Volumens aufteilen.

Fügen Sie einem Reagenzglas 10 Mikrogramm pro Milliliter OT-II OVAp hinzu. Das andere Reagenzglas bleibt unbehandelt und dient als negativer Kontrollansatz für die Antigenbeladung.

Die Röhrchen mindestens eine Stunde lang inkubieren, um die MHC-II-Moleküle der dendritischen Zellen mit dem OVA-Peptid zu beladen. Währenddessen die Salmonella enteritidis für die Infektion vorbereiten, indem sie dreimal mit einer PBS-Lösung gewaschen werden. Zwischen jedem Waschschritt bei 1800 x g zentrifugieren, um das LB-Medium und eventuelle sezernierte Toxine zu entfernen.

Resuspendieren Sie die Bakterien anschließend in RPMI. Nach der Inkubation infizieren Sie jedes Röhrchen mit dendritischen Zellen mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 und inkubieren die Zellen danach eine Stunde lang. Nach der Infektion waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und danach einmal mit RPMI 10 % FBS.

Zentrifugieren Sie zwischen den Waschschritten bei 450 × g, um den größten Teil der extrazellulären Bakterien im löslichen OVAp zu entfernen. Nach der letzten Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in RPMI 10 % FBS bei 20 × 10⁶ Zellen pro Milliliter. Geben Sie in eine 24-Loch-Kulturplatte je zwei Millionen CD4⁺-T-Zellen in einem Volumen von 0,5 Milliliter in fünf Wells.

Danach, um den physischen Kontakt zu kontrollieren, Polycarbonat-Transwell-Barrieren mit einer Porengröße von drei Mikrometern in die dritte und vierte Vertiefung geben. In die erste Vertiefung 0,1 Milliliter der infizierten überladenen dendritischen Zellen geben. In die zweite Vertiefung 0,1 Milliliter der infizierten nicht beladenen dendritischen Zellen geben.

Gebe 0,1 Milliliter der infizierten überlasteten dendritischen Zellen in ein Well und 0,1 Milliliter der infizierten nicht beladenen dendritischen Zellen in das andere Well. Als negativen Kontrollversuch infiziere schließlich direkt das fünfte Well mit CD4+T-Zellen bei einem MOI von 10. Anschließend wird das Gesamtvolumen des Wells mit RPMI auf 0,6 Milliliter aufgefüllt.

Die Platte 30 Minuten inkubieren, um die Bildung von immunen Synapsen zu ermöglichen. Nach der Inkubation 100 Mikrogramm Gentamicin pro Milliliter Medium in jedes Loch geben und eine Stunde lang inkubieren. Gentamicin ist ein Aminoglykosid-Antibiotikum, das nicht in der Lage ist, eukaryotische Zellen zu durchdringen.

Daher töten Aminoglykoside in diesem Schritt extrazelluläre Bakterien ab, nicht jedoch intrazelluläre Bakterien. Nach der Inkubation sammeln Sie die nicht-angewachsenen Zellen in 15-Milliliter-Röhrchen und resuspendieren Sie sie in 10 Milliliter PBS-BSA-EDTA-Puffer. Entsorgen Sie die Kunststoffkulturplatte, an der der Großteil der dendritischen Zellen weiterhin angeheftet ist.

Als Nächstes die Röhrchen vorsichtig vortexen, um eine vollständige Zellauflösung sicherzustellen. Die Röhrchen bei 600 x g zentrifugieren. Danach aus einem beliebigen Röhrchen 500 Mikroliter des Zellüberstandes abpipettieren und in ein neues Röhrchen überführen.

Dies dient als Kontrolle, um zu zeigen, dass die Behandlung mit Gentamicin wirksam war. Stellen Sie alle Proben auf Eis. Zu diesem Zeitpunkt liegen sechs Reagenzgläser vor: vier Reagenzgläser mit Testproben und zwei Kontrollen.

Obwohl die meisten dendritischen Zellen mit der Platte verworfen wurden, könnten die Proben, die nicht durch Transwell-Barrieren getrennt wurden, dennoch einige enthalten. Um die Kontamination zu verringern, verwenden Sie die magnetische Zellisolation oder Zellsortierung, um die CD4+T-Zellen erneut aus den Proben zu isolieren, die nicht durch Transwell-Barrieren getrennt wurden. Das endgültige Isolat sollte weniger als 2 % dendritische Zellen enthalten.

Halten Sie die restlichen Proben auf Eis. Sobald die CD4+ T-Zellen gereinigt wurden, ist es Zeit, für die Bakterienklasseninfektion zu speichern. Dies kann durch Koloniezählungen oder durch Durchflusszytometrie erfolgen.

Hier zeigen wir Ihnen, wie man Koloniezählungen durchführt. Waschen Sie die transinfizierten CD4+-T-Zellen zweimal mit PBS. Zentrifugieren Sie zwischen den Waschschritten mit 600 x g.

Anschießend die Zellen zählen und in PBS in einer Konzentration von zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter resuspendieren. Zu 500 Mikrolitern T-Zellen 500 Mikroliter 0,1 % Triton X-100 hinzufügen, um diese zu lysieren. Dadurch werden die intrazellulären Bakterien aus den T-Zellen freigesetzt.

Für jede Probe lysierter Zellen drei serielle Verdünnungen herstellen. Anschließend eine LB-Agarplatte in Viertel teilen und jeweils 50 Mikroliter jeder Verdünnung, einschließlich der undiluierten Suspension, auf jeden Abschnitt der Platte auftragen. Auf einer separaten LB-Agarplatte das aufbewahrte Zellüberstand als Kontrolle für die Wirksamkeit von Gentamicin auftragen.

Als zusätzliche Kontrolle werden anschließend auf einer weiteren Platte direkt infizierte T-Zellen ausgestrichen. Über Nacht inkubieren. Am nächsten Tag die Kolonien in jedem Bereich der Platte zählen und die Anzahl an koloniebildenden Einheiten für jede Probe berechnen.

Wenn eine geringfügige dendritische Zellkontamination auftritt, definiert als weniger als 2 %, ziehen Sie die koloniebildenden Einheiten ab, die der geringen dendritischen Zellkontamination entsprechen. Die T-Zell-Transinfektion wurde unter Verwendung von Salmonella enteritidis durchgeführt und mittels Gentamycin-Survival-Assay quantifiziert, wie in diesem Video beschrieben. Wenn direkt infizierte T-Zellen ausplattiert wurden, wie links dargestellt, wurde kein Wachstum von Kolonien beobachtet, was darauf hinweist, dass T-Zellen resistent gegenüber direkten bakteriellen Infektionen sind.

Wenn Überstand aus Transinfektionsassays ausplattiert wurde, wie rechts gezeigt, wurden keine Kolonien beobachtet, was darauf hindeutet, dass Gentamicin ordnungsgemäß gewirkt hat. Ergebnisse von Transinfektionsassays, die in Gegenwart von Transwell-Barrieren durchgeführt wurden, sind hier dargestellt. Es werden nur drei Kolonien in der undiluierten Suspension sowohl aus OVA-beladenen als auch aus nicht beladenen Proben beobachtet.

Im Gegensatz dazu sind zahlreiche Kolonien zu beobachten, wenn T-Zellen direkt mit infizierten dendritischen Zellen in Kontakt kommen. Außerdem wurde die Aufnahme von Bakterien etwa fünfmal stärker, wenn dendritische Zellen, die mit OVAp beladen waren, gemeinsam mit T-Zellen inkubiert wurden. Insgesamt zeigen diese Daten, dass der direkte Kontakt infizierter dendritischer Zellen mit T-Zellen die bakterielle Aufnahme fördert und dass die zelluläre Transinfektion während der Antigenerkennung verstärkt wird.

Nach diesem Video sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Transinfektion mittels mariner T-Zellen quantifiziert. Der Vorteil der Quantifizierung der Transinfektion mittels Gentamicin-Überlebensassay liegt in seiner hohen Empfindlichkeit. Wir sind in der Lage, ein einzelnes infizierendes Bakterium nachzuweisen.

Es ist wichtig zu beachten, dass der Reinigungsschritt dieses Verfahrens entscheidend ist. Die Reinheit muss sehr hoch sein, wenn Koloniezahlen zur Bestimmung der Transinfektionsrate verwendet werden sollen. Die Quantifizierung mittels Durchflusszytometrie weist diese Einschränkung nicht auf, da man leicht zwischen dendritischen Zellen und T-Zellen unterscheiden kann, allerdings besteht die Einschränkung darin, dass die GFP-exprimierenden Bakterien hell genug sein müssen, um die infizierten Zellen vor dem äußeren Fluoreszenzhintergrund nachweisen zu können.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens stets die geeigneten Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden sollten.