A thrombotischer Schlaganfall Modell basierend auf Transient zerebrale Hypoxie-Ischämie
18. August 2015
Thromboembolische Schlaganfallmodelle sind wichtige Werkzeuge zur Optimierung der Rekanalisationstherapie. In dieser Arbeit berichten wir über ein murines thrombotisches Schlaganfallmodell, das auf einem transitorischen zerebralen hypoxisch-ischämischen (tHI) Insult basiert, der Thrombose und Infarkt auslöst und positiv auf die durch Gewebeplasminogenaktivator (tPA) vermittelte Fibrinolyse in einem therapeutischen Fenster ähnlich wie bei Schlaganfallpatienten anspricht.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein einfaches Modell für einen thrombotischen Schlaganfall mit stabiler Hirninfarktion zu etablieren und die schützenden Wirkungen einer Gewebeplasminogenaktivator- oder TPA-Therapie zu bewerten. Zunächst wird die Induktion einer transienten zerebralen Hypoxie-Ischämie oder THI durch die doppelte Ligatur der rechten Arteria carotis communis (RCCA) und die Exposition des ligierten Tieres gegenüber hypoxischen Bedingungen zur Induktion einer Thrombose demonstriert. Nach einer 30-minütigen hypoxischen Phase werden die beiden Knoten an der Arteria carotis gelöst.
Im letzten Schritt werden die Verabreichung und die Auswertung der Wirkungen der TPA-Therapie gezeigt. Alternativ können die Echtzeitaufzeichnung des zerebralen Blutflusses, die Bildung der Thrombose und der Grad der Gefäßverstopfung untersucht werden. Dieses Verfahren ermöglicht es, einen thrombotischen Schlaganfall bei erwachsenen Mäusen zu induzieren und die Wiederherstellung mithilfe ihres eigenen Gerinnungssystems zu beobachten.
Wir möchten dieses Modell verwenden, um zu untersuchen, wie das Gehirn die eigene Durchblutung unter hypoxischen Bedingungen reguliert. Außerdem nutzen wir es, um zu erforschen, wie thrombotische Therapien verbessert werden können. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da es schwierig sein kann, während der Gehirninfektion die richtige Körpertemperatur und eine gleichmäßige Atmung aufrechtzuerhalten.
Induktionsschritte Mindestens 15 Minuten vor Beginn des Verfahrens. Stellen Sie die Operationsunterlage auf eine Wärmematte, stellen Sie diese auf 37 Grad Celsius ein und legen Sie eine Nackenrolle, die aus dem Zylinder einer Dreimilliliter-Spritze hergestellt wurde, auf die Unterlage. Stellen Sie das Hypoxiesystem so ein, dass es 2 % Isofluran in 7,5 % Sauerstoff, ausgeglichen durch 92,5 % Stickstoff, liefert, und justieren Sie die Temperaturregler.
Platzieren Sie eine 10 bis 13 Wochen alte männliche C57BL/6-Maus mit einem Gewicht von 22 bis 30 Gramm auf das Operationsbett. Nach Bestätigung der Anästhesie durch Zehenquetschung tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf. Strecken Sie die vier Gliedmaßen entlang des Halses, rollen Sie sie ein und sichern Sie sie mit medizinischem Klebeband.
Danach mit einer Enthaarungscreme die Haare am Hals des Tieres entfernen und den Operationsbereich reinigen. Anschließend den Operationsplatz unter ein Stereomikroskop schieben und einen 0,5 cm langen zervikalen Schnitt in der Haut entlang der Mittellinie vornehmen. Mit einer feinen Pinzette die Luftröhre und die Muskulatur auseinanderziehen, um die rechte Arteria carotis communis freizulegen, und zwei vorgeschnittene Seidennähte (5-0) unter die Arterie legen.
Seien Sie vorsichtig und trennen Sie die Arteria carotis vom Nervus vagus, bevor Sie zwei präkonditionierte, lösbare Seidensuturen der Stärke 5-0 an der RCCA anlegen. Anschließend verschließen Sie die Haut mit Monofile-Nylonsuturen der Stärke 4-0 und bringen die Maus umgehend zum Hypoxiesystem. Legen Sie die Gesichtsmaske über Nase und Mund des Tieres und platzieren Sie eine rektale Sonde, um während der gesamten Hypoxieapplikation eine Körpertemperatur von 37,5 Grad Celsius aufrechtzuerhalten.
Stellen Sie die Wärmelampen nach 30 Minuten ein. Übertragen Sie die Maus zurück auf das Operationsbett und lösen Sie die beiden Nähte. Schließen Sie dann die Wunde mit Gewebekleber und bringen Sie die Maus in ihren Käfig zurück, wobei das Tier überwacht wird, bis es sich vollständig erholt hat.
Alternativ kann die Laser-Speckle-Kontrastbildgebung verwendet werden, um den zerebralen Blutfluss während und nach Hypoxie-Ischämie zu untersuchen. Positionieren Sie das Tier in Bauchlage. Öffnen Sie anschließend die Kopfhaut mit einem einen Zentimeter langen medianen Schnitt, um den Schädel freizulegen, ihn aber nicht zu öffnen.
Überführen Sie das Tier anschließend unverzüglich zum Durchblutungsimager und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der zerebralen Durchblutung. Zeigen Sie die Bilder der zerebralen Durchblutung gemäß den Herstelleranweisungen mit der FLPI-Software an, um ausgewählte Bereiche in Echtzeit zu analysieren. Um die Wirkung der TPA-Therapie zu bewerten, injizieren Sie die Tiere zum geeigneten Zeitpunkt intravenös in die Schwanzvene nach transitorischer einseitiger Karotisokklusion und Hypoxie.
Quantifizieren Sie anschließend das Infarktvolumen mittels in-vivo-TTC 24 Stunden nach der transitorischen zerebralen hypoxischen Ischämie. Verwenden Sie am nächsten Tag ein Vibrom, um Schnitte mit einer Dicke von einem Millimeter zu erhalten. Erhalten Sie schließlich eine Serie von vier geschnittenen Gehirnbildern mittels digitaler Mikroskopie und verwenden Sie die geeignete Bildanalyse-Software, um das Infarktvolumen als Verhältnis des weißen infarzierten Bereichs zur Fläche der unversehrten kontralateralen Hemisphäre zu quantifizieren.
Vielmehr können für dieses Verfahren andere Methoden der Thrombolyse verwendet werden, um deren Wirkungen und klinisches Potenzial zu bewerten. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet des ischämischen Schlaganfalls den Weg, thrombolytische Therapien im Gehirn zu erforschen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein murines thrombotisches Schlaganfallmodell vor, das transiente zerebrale hypoxisch-ischämische (tHI) Bedingungen simuliert. Das Modell wurde entwickelt, um die Wirksamkeit einer Gewebeplasminogen-Aktivator-(tPA-)Therapie bei der Induktion einer Rekanalisation und Verringerung der Infarktgröße zu bewerten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Schlaganfallmodelle
- Therapeutische Interventionen
Hintergrund
- Thromboembolische Schlaganfallmodelle sind unerlässlich, um Therapien zu testen.
- Transiente zerebrale Hypoxie-Ischämie (tHI) kann eine Thrombose auslösen.
- tPA ist eine gängige Behandlung für Schlaganfallpatienten.
- Das Verständnis des therapeutischen Zeitfensters ist entscheidend für eine wirksame Therapie.
Zweck der Studie
- Etablierung eines zuverlässigen thrombotischen Schlaganfallmodells bei Mäusen.
- Beurteilung der schützenden Wirkung einer tPA-Therapie.
- Beurteilung des Zeitpunkts und der Wirksamkeit der Behandlung nach einem Schlaganfall.
Verwendete Methoden
- Induktion eines tHI durch doppelte Ligatur der rechten Arteria carotis communis.
- Aussetzung des Versuchstiers gegenüber hypoxischen Bedingungen, um eine Thrombose auszulösen.
- Lösen der Ligatur nach 30 Minuten Hypoxie.
- Gabe von tPA und Bewertung seiner Wirkung auf die Rekanalisation.
Hauptergebnisse
- Das Modell induzierte erfolgreich eine stabile Hirninfarktion.
- Die tPA-Therapie zeigte günstige Ergebnisse innerhalb des therapeutischen Zeitfensters.
- Die zerebrale Durchblutung und die Thrombusbildung wurden effektiv überwacht.
- Das Modell ermöglicht die Untersuchung von Schlaganfallmechanismen und der Wirksamkeit von Behandlungen.
Schlussfolgerungen
- Das murine thrombotische Schlaganfallmodell ist ein wertvolles Werkzeug für die Forschung.
- Die tPA-Therapie zeigt vielversprechende Ergebnisse bei der Behandlung thromboembolischer Schlaganfälle.
- Weitere Studien können das Verständnis der Schlaganfallbehandlung vertiefen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Modell für thrombotischen Schlaganfall schließt die translationale Lücke in der präklinischen Schlaganforschung, indem es ein tPA-ansprechbares System bereitstellt, das der klinischen Thrombolyse nachempfunden ist. Es ermöglicht die mechanistische Risikominderung neuroprotektiver und thrombolytischer Therapien durch reproduzierbare Induktion einer Thrombose, ohne chirurgische Embolie oder Kraniotomie. Das Modell unterstützt eine vorhersagekräftige Beurteilung der Zielvalidierung und der therapeutischen Zeitfensterabschätzung für Programme zur Schlaganfallmedikamentenentwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung thrombotischer Signalwege und hämodynamischer Beiträge zur ischämischen Schädigung.
- Operativer Wert: Bietet ein standardisiertes Modell für konsistente Messungen von Infarktgröße und Mortalität über verschiedene Labore hinweg.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Priorisierung von Therapiezielen, indem es eine tPA-sensible Thrombose modelliert, die für klinische thromboembolische Schlaganfälle relevant ist.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare Endpunkte, einschließlich Infarctvolumen, Fibrin- und Thrombozytenablagerung sowie zerebrale Durchblutungsdynamik.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch transiente Hypoxie-Ischämie und reversiblen Karotidligaturen.
- Eignung für die Substanzprüfung: Unterstützt die Dosis-Wirkungs-Bewertung thrombolytischer Wirkstoffe mittels zeitabhängiger Gabe von tPA.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Ausrichtung: Induziert eine Thrombose im Versorgungsgebiet der Arteria cerebri media und spiegelt so die Pathologie des menschlichen Schlaganfalls wider.
- Mechanistische Entlastung: Ermöglicht die Untersuchung endogener Fibrinolyse- und Gerinnungswege in vivo.
- Präklinische Kontinuität: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung, indem Reperfusionsdefizite und die Entwicklung des Infarkts modelliert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Modell fügt sich in den Entdeckungsprozess für Schlaganfalltherapien von der Zielvalidierung über die Leitstruktur-Optimierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung ein und ermöglicht die iterative Bewertung thrombolytischer und neuroprotektiver Wirkstoffkandidaten.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Thrombusbildung, Reperfusionsverletzung und Mechanismen der Kollateralzirkulation.
- Screening: Ermöglicht die standardisierte Bewertung von Substanzen anhand quantitativer Endpunkte wie der Verringerung der Infarktgröße und der Verbesserung des Überlebens.
- Analytik: Liefert messbare Ergebnisse, darunter die Laser-Speckle-Kontrastabbildung der zerebralen Durchblutung, TTC-Färbung zur Quantifizierung des Infarkts und die Überwachung der Mortalität.
- Translationale Forschung: Verbindet mit präklinischen Arbeiten, indem sie die auf klinischen Schlaganfallpatienten beobachtete Ansprechbarkeit auf tPA und Effekte des therapeutischen Zeitfensters modelliert.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Plattform zur evaluativen Überprüfung antithrombotischer, fibrinolytischer und neuroprotektiver Strategien über verschiedene Programmreihen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen in der Schlaganfallpathologie, indem klinisch relevante Thrombosen und die Reaktion auf tPA modelliert werden.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Hypoxieexposition, Temperaturkontrolle und reversiblen arteriellen Ligation.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch Identifizierung von Substanzen mit zeitabhängigem Wirkungsnachweis in einem thrombolyseempfindlichen Modell.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem Wirkstoffe priorisiert werden, die Infarktgröße und Mortalität in einem tPA-reaktiven System reduzieren.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Chirurgie an Nagetieren, der Bedienung von Hypoxiesystemen und der physiologischen Überwachung.
- Benötigt eine präzise Temperaturkontrolle (37,5 ± 0,5 °C) und die zuverlässige Zufuhr von hypoxischer Gasgemisch (7,5 % O2, Rest N2).
- Erfordert die Standardisierung der Zeitpunkte für Ligatur, Freigabe und Gabe von tPA (0,5, 1 oder 4 Stunden nach tHI).
- Zu berücksichtigende Anpassungen umfassen die strainenspezifische Variabilität der Blutgerinnung und die Validierung der Infarktlokalisation.
- Praktische Einschränkungen ergeben sich aus der Abhängigkeit des Modells von einer intakten endogenen Gerinnungsfunktion und der Empfindlichkeit gegenüber der Dauer der Hypoxieexposition.
