Bestimmung der Fettsäureoxidation und Lipogenese in Maus primären Hepatozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Fettsäurestoffwechsel in primären Maus-Hepatozyten zu beurteilen. Dies wird erreicht, indem zuerst eine Mausleber mit Verdauung und Medium perfuziert, entfernt und dann die Hepatozyten isoliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, Hepatozyten auf kollagenbeschichteten Platten zu kultivieren.

Als nächstes werden die Hepatozyten mit den zu testenden experimentellen Interventionen behandelt. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen in Gegenwart eines radioaktiv markierten Substrats zu inkubieren. Letztendlich wird die Flüssigszintillationsanalyse verwendet, um die Auswirkungen verschiedener pharmakologischer oder genetischer Eingriffe auf die Fettsäureoxidation oder die Lipogenese in primären Hepatozyten aufzuzeigen.

Diese Methode kann dazu beitragen, mehrere Schlüsselfragen auf dem Gebiet des Stoffwechsels und des Diabetes zu beantworten, einschließlich der Frage, wie sich spezifische pharmakologische und genetische Eingriffe auf die Biologie der Hepatozyten auswirken. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist aus zwei Gründen von entscheidender Bedeutung. Erstens, spezifische Perfusionsbedingungen, die die Gesundheit der Hepatozyten beeinträchtigen, sind schwer zu erreichen, und zweitens, die Quantifizierung der Freisetzung von Kohlendioxid.

Gas ist nicht intuitiv. Dieses Verfahren wird von Tom Akey, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Richten Sie die Peristaltikpumpe ein, indem Sie ein Ende des sterilen Schlauchs in das vorwarme Leberperfusionsmedium und das andere in einen Abfallbehälter legen.

Lassen Sie die Pumpe laufen, bis die gesamte Länge des Schlauchs mit Medium gefüllt ist. Nachdem Sie eine Maus von Interesse geopfert haben, besprühen Sie den Bauch der Maus großzügig mit 70% Ethanol. Verwenden Sie dann eine stumpfe Endschere, um einen Mittellinienschnitt durch die Dermis, die Länge des Bauches, zu machen und seitlich zu reflektieren.

Machen Sie einen ähnlichen Schnitt im Bauchfell, um die Eingeweide freizulegen. Verschieben Sie den Darm vorsichtig mit einem stumpfen Instrument. Um das Bauchgefäßsystem freizulegen, lokalisieren Sie die untere Hohlvene und legen Sie eine Naht unter das Blutgefäß distal der Nierenvene, distal der Naht.

Legen Sie eine Nadel und einen Katheter in die untere Hohlvene und schieben Sie sie über die Naht hinaus. Binden Sie die Naht noch an Ort und Stelle, während die Nadel noch an Ort und Stelle ist, um sie an Ort und Stelle zu halten, und entfernen Sie dann vorsichtig die Nadel. Wenn es richtig gemacht wird, fließt das Blut mit einer Pipette durch den Katheter.

Füllen Sie den restlichen Bereich im Katheter mit Perfusionsmedium und stellen Sie sicher, dass keine Luft vorhanden ist. Befestigen Sie dann den Schlauch mit großer Sorgfalt am Katheter. Als nächstes stechen Sie das Zwerchfell vorsichtig mit einer Schere mit scharfer Spitze ein und machen Sie einen seitlichen Schnitt, um die Pleurahöhle freizulegen.

Achten Sie darauf, die Gallenblase und das Pleuragefäßsystem zu vermeiden, und legen Sie eine Bulldoggenklemme um die untere Hohlvene des Brustkorbs direkt in der Nähe der Lebervene. Schneiden Sie dann die Pfortader auf und schalten Sie die Pumpe mit drei bis vier Millilitern pro Minute ein. Perfundieren Sie die Leber fünf Minuten lang mit Leberperfusionsmedium unter Verwendung von etwa 20 Millilitern Perfusionsmedium.

Beobachten Sie während dieser Zeit den sofortigen Farbumschlag der Leber von rot zu graubraun. Bleiben Teile der Leber rot, deutet dies auf eine schlechte Durchblutung hin und die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Isolierung ist stark verringert. Stoppen Sie nach der fünfminütigen Perfusion die Pumpe und übertragen Sie den Schlauch in das Leberverdauungsmedium.

Starten Sie die Pumpe neu und perfundieren Sie die Leber für weitere 10 bis 15 Minuten. Bei drei bis vier Millilitern pro Minute, bis das Medium erschöpft ist. Am Ende der Perfusion stoppen Sie die Pumpe.

Die Leber sollte einen rosafarbenen Farbton haben und etwas vergrößert erscheinen. Zu diesem Zeitpunkt entfernen Sie die Leber durch vorsichtige Dissektion. In eine 10 Zentimeter große Gewebekulturschale geben und die Gallenblase entfernen.

Geben Sie als Nächstes 10 Milliliter Plattierungsmittel in die Leber und beginnen Sie, die Leber vorsichtig mit einem Skalpell zu kratzen. Um die Hepatozyten zu entfernen, filtrieren Sie die Suspension mit einem 100-Mikron-Zellsieb und überführen Sie sie in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Platte mit weiteren 10 Millilitern Beschichtungsmedium und ziehen Sie die Flüssigkeit in das konische 50-Milliliter-Röhrchen.

Pelletieren Sie dann die Zellen bei vier Grad Celsius, zentrifieren Sie fünf Minuten lang bei 350 Gs, saugen Sie das Medium an und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Millilitern Beschichtungsmedium. Fügen Sie als nächstes 10 Milliliter 90% kolloidales Siliziumdioxid hinzu, das mit sanft gemischtem Polyvinylperon beschichtet ist, und pelletieren Sie die Zellen dann wie zuvor. Nach der Zentrifugation wird die Schicht der abgestorbenen Zellen, die auf der Oberseite der Mischung schwimmen, abgesaugt.

Waschen Sie dann die lebenden pelletierten Zellen zweimal mit 20 Millilitern Beschichtung. Mittlere Reanimation. Suspendieren Sie das endgültige Zellpellet in 10 Milliliter Plattierungsmedium und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Legen Sie 90.000 Zellen pro Vertiefung in kollagenbeschichtete 24-Well-Kulturschalen, inkubieren Sie die Platten zwei Stunden lang, 16 bis 20 Stunden vor Beginn des Assays.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit warmem PBS und stellen Sie die Zellen auf serumfreien Serumhunger um. Medium mit 20 Nanomol Glucagon. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid am Morgen des Assays.

Bereiten Sie das Vorinkubationsmedium vor und wechseln Sie dann den Serummangel aus. Medium für das Vorinkubationsmedium. Inkubieren Sie die Zellen in dieser Mischung bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid während der Inkubation zwei Stunden lang.

Trocknen Sie 0,5 Mikrocurie pro Vertiefung C14-Palmitat durch Verdampfen des Ethanollösungsmittels unter Stickstoff etwa 15 Minuten vor Ende der Inkubation und resuspendieren Sie das C14-Palmitat bei 12,5 Mikrolitern pro Mikrocurie in 0,1. Normales Natriumhydroxid inkubiert das Gemisch bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten. Fügen Sie dann drei Volumina warmes Vorinkubations- und Medium hinzu und mischen Sie, indem Sie auf und ab pipettieren.

Vertiefung mit 25 Mikrolitern verdünnter C 14-Palmitat-Mischung aufspießen, indem Sie die Platte leicht schaukeln und 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Dies ist die Assay-Platte. Entfernen Sie während der Inkubation die Abdeckung von einer sterilen 24-Well-Platte und legen Sie ein zwei mal zwei Zentimeter großes Stück Filterpapier in den Boden jeder Vertiefung. Überlagern Sie dann die Platte mit einem Stück Param von vier x sieben Zoll mit einem großen rechteckigen Objekt, z. B. einer Mikropipettenspitze.

Reiben Sie das Paraform auf die Vertiefungen, um das Paraform an den Vertiefungsöffnungen zu perforieren und eine Abdichtung über dem Rest der Platte zu erzeugen. Entfernen Sie dann die perforierten Kreise aus Parfum. Decken Sie nun die Vertiefungen 10 Minuten vor Ende der Inkubation ab und geben Sie 200 Mikroliter drei normale Natriumhydroxide in jede Vertiefung der Filterpappplatte, wobei Sie darauf achten, dass das Filterpapier die gesamte Flüssigkeit aufnimmt.

Am Ende der Inkubation frieren Sie die Assay-Platte in flüssigem Stickstoff ein. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter 70 % pro Kaloriensäure in jede Vertiefung der Assay-Platte. Sofort mit einer Filterpappplatte abdecken und die Platten auf einen Orbitalschüttler legen.

Schaukeln Sie die Platten zwei Stunden lang bei einer Umlaufgeschwindigkeit von 80 U/min bei Raumtemperatur. Messen Sie dann den Kohlendioxidanteil, indem Sie die Quadrate des Filterpapiers in vier Milliliter flüssige Szintillationsflüssigkeit in Szintillationsfläschchen überführen, und messen Sie das C 14-Signal auf einem Szintillationszähler, um das säurelösliche Material zu messen. Übertragen Sie 400 Mikroliter Medium in eine 1,5-Milliliter-Mikrofugeröhrchenzentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 10 Minuten und fügen Sie dann 100 Mikroliter des resultierenden Überstands zu 500 Mikrolitern einer Zwei-zu-Eins-Mischung aus Chloroform und Methanol hinzu.

Die Mischung kurz vortexen und dann 250 Mikroliter Wasser zur Mischung geben und vortexen. Zentrifugieren Sie die Proben erneut 10 Minuten lang bei tausend Gs. Übertragen Sie dann 200 Mikroliter der oberen Phase auf vier Milliliter flüssige Szintillationsflüssigkeit in einem Szintillationsfläschchen und messen Sie das C 14-Signal nach dem Serummangel der Zellen. Verwandeln Sie die Zellen in Lipogenese-Medium.

Fügen Sie alle zu testenden Verbindungen von Interesse hinzu und inkubieren Sie die Zellen nach der Inkubationszeit zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, bevor Sie die Zellen lysieren, indem Sie 120 Mikroliter 0,1 normale Salzsäure hinzufügen. Kratzen Sie jeweils die Vertiefungen ab, um das Lysat freizusetzen, und pipettieren Sie dann 100 Mikroliter des Lysats in ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen.

Geben Sie anschließend 500 Mikroliter einer Mischung aus Chloroform und Methanol in jedes Röhrchen. Kurz vortexen und dann fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation bei 250 Mikrolitern Wasser wirbeln und die Probe dann weitere fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Dann zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 3000 gs.Übertragen Sie die untere Phase der abgetrennten Flüssigkeit vorsichtig in vier Milliliter flüssige Szintillationsflüssigkeit in einem Szintillationsfläschchen und messen Sie die Tritiumaktivität mit einem Szintillationszähler. Dieses Verfahren führt in der Regel zur Isolierung von 10 bis 30 Millionen Hepatozyten pro Maus. Nach der Inkubation über Nacht erscheinen gesunde Zellen sechseckig, von denen viele kernhaltig sind.

Ungesunde Kulturen enthalten oft Granulationen oder Bläschen, die auf den Zelltod hinweisen. Die Ergebnisse eines Fettsäureoxidationsassays sind hier dargestellt, bei dem die Zugabe von F-C-C-P-A-Promotor für die zelluläre Atmung und Oligomycin, einem Atmungshemmer, mit einer Vehikelkontrolle zur Messung der vollständigen Oxidation verglichen wurde. Es wird das Verhältnis von Kohlendioxid zu säurelöslichem Material berechnet.

Substanzen, die die Zellatmung fördern, wie z. B. FCCP, verschieben dieses Verhältnis in Richtung Kohlendioxid, was auf eine stärkere Oxidation über das TC hinweist. Ein Zyklushemmer der Atmungskette verringern bei der Messung die Oxidation insgesamt. Für Lipo-Aktivitätsverbindungen, die die Fettsäureoxidation verstärken, wie FCCP, oder eine TP-Synthese verringern, wie z. B. Oligomycin, verringern sich die Lipo-Aktivität in kultivierten Hepatozyten im Vergleich zu Vehikelkontrollen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Fülle nach der Tieropferung vollständig und rechtzeitig erfolgt.

Darüber hinaus ist während des Fettsäureoxidationsassays das vollständige Einfrieren des Mediums entscheidend für reproduzierbare Messungen von Kohlendioxidgas. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie primäre Hepatozyten isolieren und diese Zellen zur Analyse der Fettsäureoxidation und Lipogenese in vitro verwenden können.